Lipid-lowering and anti-atherosclerotic activity of the natural original enzyme preparation in the experiment

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Известно, что развитие атеросклероза (АС) вызывает появление наиболее серьезных клинических осложнений (ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, инсульт), которые приводят к инвалидности и высокой смертности больных сердечно-сосудистыми заболеваниями [3, 5]. Одной из причин коморбидного патогенеза АС является накопление в организме человека избыточного количества холестерина (ХС) в артериальной стенке (атеросклеротические повреждения) и в крови — в виде атерогенной дислипопротеинемии (ДЛП). Известно, что атерогенная ДЛП относится к ведущему, но модифицируемому фактору риска АС. Для лечения АС и ДЛП применяются немногочисленные гиполипидемические препараты, имеющие серьезные побочные эффекты. Помимо использования липидснижающих средств профилактики АС необходимо сокращать поступление ХС с пищей, то есть больным рекомендуется употреблять продукты с низким содержанием ХС. Данные ряда популяционных исследований показывают, что существует прямая корреляционная связь между количеством ХС в пище и уровнем ХС в крови, поэтому ограничение приема пищевого ХС — необходимый шаг перед началом интенсивной фармакотерапии АС. Следует подчеркнуть, что уменьшать количество ХС можно и путем его повышенного выведения из организма. Это происходит после длительного приема синтетического сорбента холестирамина в дозе 18–24 г в день, но это крайне неудобно для пациента, так как вызывает выраженные нарушения деятельности желудочно-кишечного тракта. Следовательно, по-прежнему актуален направленный поиск биологически активных веществ различного происхождения, которые корректируют нарушение липидного обмена, особенно среди соединений, близких естественным метаболитам организма. С этой целью применяются как природные ферменты, так и препараты, полученные биотехнологическим путем. Препараты ферментов — амилазы, липоксигеназы, липазы, галактозидазы, пектиназы, пепсина и многих других — находят широкое применение в пищевой промышленности и медицинской практике. Эти ферменты являются действительно высоко активными, а главное, нетоксичными катализаторами, которые обладают исключительной субстратной специфичностью, без них в организме невозможны многие жизненно важные биохимические процессы. Например, при инфаркте миокарда весьма информативны диагностические пробы с ферментами аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), лактатдегидрогеназа (ЛДГ) и КФ (креатинфосфат). Лактат и глюкозооксидаза используются для определения концентрации глюкозы в крови и моче. Липазы требуются для гидролиза жиров и эфиров жирных кислот. Препарат фермента супероксиддисмутазы применяют в качестве метаболического средства для лечения гипоксии, болезней сердца, при трансплантации почек. Протеолитические ферменты (стрептокиназа, урокиназа) необходимы для растворения тромбов, удаления из организма токсических веществ [1, 2].

Источником фермента холестериноксидазы (ХСО) [EC1. 1. 3. 6. ] являются бактерии Streptomices lavendulae. ХСО относится к классу оксидоредуктаз, имеет молекулярную массу 55 кДа и катализирует окислительно-восстановительные реакции, в частности окисление гидроксильного радикала ХС в положении С3 с образованием кетона (холест-4-ен-3-он) и перекиси водорода. ХСО применяют в лабораторной диагностике для определения в сыворотке крови уровня общего ХС и ХС липопротеинов высокой плотности (ЛПВП). В научной литературе отмечен значительный интерес к проблемам, связанным с изучением модификаций ХСО. Современное биотехнологическое применение ХСО, получаемой из различных источников, ее новые физико-химические, биологические и физиологические свойства активно изучаются во многих зарубежных лабораториях [2, 4, 6, 8].

Наше внимание привлек оригинальный отечественный препарат фермента ХСО природного происхождения. Технология получения субстрации ХСО из Streptomices lavendulae штамм ВКМА-5921 почвенного происхождения была разработана в Институте антибиотиков и ферментов медицинского назначения (Санкт-Петербург).

Цель исследования — выявить биологическую активность, гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действие бактериального ферментного препарата ХСО из источника (Streptomices lavendulae штамм ВКМА-5921) в модельных опытах in vitro и in vivo.

МЕТОДИКА

Экспериментальные исследования проведены в два этапа. Первый, начальный этап был необходим для выявления специфического действия ХСО. Второй этап посвящен задаче определения влияния ХСО на развитие умеренно высокой ДЛП в модельных опытах на трех видах экспериментальных животных.

В начале первого этапа изучали способность препарата ХСО связывать ХС из пищевых продуктов в опытах in vitro, затем исследовали биологическую активность in vivo (острую и хроническую токсичность на мышах и крысах) и антиатеросклеротическое действие на кроликах. Всего было использовано следующее количество половозрелых экспериментальных животных (самцов): 100 мышей (18–20 г), 350 крыс (180–200 г), 30 кроликов (2,5–2,7 кг), 5 собак (15–18 кг). Эксперименты выполнены в соответствии с Правилами работы с лабораторными животными, которых содержались в условиях искусственного освещения в помещении со свободным доступом к воде и корму.

Во втором этапе серия опытов проведена на более взрослых самцах животных: 155 крысах (250–300 г), 20 морских свинках (360–380 г) и 18 кроликах (3,0–3,5 кг), которых содержались в тех же стандартных условиях вивария. Опытные образцы ферментного препарата ХСО вводили ежедневно, перорально, в дозах, рассчитанных в единицах активности (от 0,16 до 10 ЕД).

Экспериментальную, алиментарную ДЛП (гиперлипидемию) у крыс, морских свинок и кроликов вызывали в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению новых гиполипидемических и антиатеросклеротических средств» (2012). Для этого использовали атерогенный рацион — гиперхолестериновую (ГХС) диету. У крыс умеренно высокую гиперлипидемию вызывали применением специальной ГХС диеты, скармливая опытный рацион, обогащенный пищевым холестерином (ХС) в виде 5 % прогретой смеси с подсолнечным маслом и повреждающим тиреоидсупрессорным агентом — метилтиоурацилом (МТУ 0,12 %) в течение 20 дней. Гиперлипидемию у морских свинок создавали кормлением ГХС диетой, содержащей избыточное количество пищевого ХС (0,5 г/кг) и смесью жиров (подсолнечное масло / свиной жир 3 : 1) в течение 20 дней. Умеренно высокую гиперлипидемию у кроликов моделировали, используя пищевой ХС (0,5 г/кг), перемешанный вместе с небольшим количеством капусты, в течение 12–24 дней. Перед окончанием опытов всех подопытных животных отсаживали на голод в течение 18 ч. Крыс и морских свинок забивали быстрой декапитацией, кроликов — мгновенной воздушной эмболией. В полученной крови и печени определяли содержание общего ХС (ОХС), триглицеридов (ТГ), ХС липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) с помощью наборов реактивов Ranbaxy (Великобритания). По общепринятой формуле А.Н. Климова рассчитывали важный коэффициент — индекс атерогенности крови (ИА):

ОХС – ХС ЛПВП / ХС ЛПВП.

Кроме того, сыворотку крови крыс, морских свинок и кроликов исследовали, используя метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности калия бромида (KBr) для анализа распределения спектра липопротеинов: ЛП промежуточной плотности (ЛППП), ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП), ЛП низкой плотности (ЛПНП), ЛПВП. Статистическую обработку данных производили, сравнивая средние значения величин, с помощью однофакторного ANOVA теста при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение биологической активности препарата ХСО для коррекции экспериментального АС в опытах in vitro и in vivo коллектив авторов проводил в течение трех лет в четырех сериях исследований комплексно — в лаборатории экспериментальной фармакотерапии и отделе биохимии Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург).

Первый, начальный этап исследований выявил отчетливую специфическую активность тестируемого препарата — микробного ферментного препарата ХСО. Согласно протоколам опытов были получены следующие результаты.

В первой серии исследований в опытах in vitro было показано, что микробный препарат фермента ХСО в суммарной дозе 300–400 ЕД проявляет специфическую биологическую активность в уменьшении концентрации ХС в натуральных пищевых продуктах. Так, после добавления препарата ХСО с исходной концентрацией 0,16 ЕД/мл активности к 1 л цельного 6 % молока было обнаружено, что после инкубации в термостате при 37 ^оС в течение 3 ч наблюдалось снижение уровня общего ХС на 48 % (p < 0,05). После аналогичной инкубации пяти яичных желтков (с исходным содержанием ХС 15,64 мг/мл) концентрация ХС в них уменьшилась на 51 % (p < 0,05). Кроме того, при инкубации смешанных образцов в течение 3 ч при комнатной температуре концентрация в яичных желтках была в 1,5 раза ниже, чем в исходном продукте. Важно подчеркнуть, что при этом способе пищевые продукты не потеряли своих вкусовых и естественных качеств.

Во второй серии исследований в опытах in vivo у мышей и крыс определяли острую токсичность ХСО. Хроническую токсичность препарата изучали в длительных экспериментах (крысы — 3 месяца) и (собаки — 5 месяцев). Острую токсичность ХСО у мышей и крыс определить не удалось, так как даже большие дозы ХСО не оказывали патологического действия. Обнаружено, что пероральное введение препарата ХСО в опытах в дозах 300–400 ЕД животные переносили без осложнений. Кроме того, для выяснения влияния на жизненно важные системы и органы были проведены хронические опыты на крысах и собаках. Установлено, что ежедневное применение ХСО пероральной дозы с исходной активностью от 0,16 до 1,0–20,0 ЕД/мг не оказывает токсического действия на организмы крыс и собак при длительном применении (3 и 5 месяцев соответственно). Анализ деятельности желудочно-кишечного тракта, крови по форменным элементам и морфологии органов (сердце, печень, почки, надпочечники, селезенка) не выявил серьезных патологических изменений у опытных животных.

В третьей серии опытов моделирования на кроликах алиментарного АС (3 месяца) без использования ферментного препарата ХС было отмечено появление и развитие выраженных атеросклеротических повреждений в аортах опытных животных при ежедневном скармливании яичных желтков. В то же время в аортах группы кроликов, получавших в тех же условиях в качестве препарата сравнения гиполипидемический препарат клофибрат, наблюдались начальные диффузные поражения стенки аорты.

В четвертой серии опытов при изучении переносимости ХСО в эффективной дозе 20 ЕД у кроликов (3 месяца) и собак (5 месяцев) обнаружено, что ежедневное пероральное введение тестируемого препарата в разных дозах и яичных желтков не вызывало никаких поражений в аортах экспериментальных животных.

Таким образом, в опытах in vitro и in vivo была установлена низкая токсичность, биологическая активность и антиатеросклеротическое действие изучаемого микробного препарата ХСО.

На втором этапе исследований была поставлена задача — выяснить, в какой степени препарат ХСО может влиять на развитие умеренно высокой алиментарной ДЛП у крыс, морских свинок и кроликов. Использование в опытах трех видов экспериментальных животных (грызунов) обусловлено особенностями липидного спектра их крови, который различается следующим образом. У кроликов основное количество ХС распределено по фракциям атерогенных липопротеинов (ЛПОНП, ЛППП и ЛПНП) и антиатерогенных ЛПВП равномерно. У крыс основной пул ХС находится в антиатерогенных ЛПВП, а у морских свинок — в атерогенных фракциях ЛПОНП и ЛПНП. Следует отметить, что морские свинки более чувствительны к созданию моделируемой ДЛП, чем кролики и крысы. Моделирование алиментарной ДЛП (гиперлипидемии) у морских свинок осуществляли пероральным введением с помощью зонда прогретой смеси жиров и избытка пищевого ХС в течение 20 дней. Крысы менее чувствительны к воздействию скармливания атерогенного рациона, поэтому им необходимо длительно вводить ГХС диету не только со смесью жиров и избыточным количеством ХС, но и использовать в высоких дозах такие повреждающие агенты, как МТУ, холевая кислота, витамин D₂ в течение 21–30 дней. Разработкой и внедрением алиментарных моделей ДЛП для экспериментальной работы занималась одна из авторов данной статьи — И.В. Окуневич [7].

 

Таблица 1. Влияние препарата холестериноксидазы на показатели липидного обмена в сыворотке крови и печени морских свинок при пероральном введении в течение 20 дней

Группа животных	ХС сыворотки	ТГ сыворотки	ХС печени	ТГ печени
1. Интактные морские свинки	1,19 ± 0,13	0,61 ± 0,14	2,5 ± 0,07	5,8 ± 0,4
2. ГХС диета	6,49 ± 0,72*	18,0 ± 0,36*	13,8 ± 0,09*	26,5 ± 3,2*
3. ГХС диета + ХСО	4,14 ± 0,54#	14,3 ± 0,27#	10,5 ± 0,08#	20,0 ± 1,7#
Примечание: * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2 при p < 0,05; # различия достоверны в сравнении групп 2 и 3, при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды, ГХС — гиперхолестериновая.

 

Таблица 2. Влияние препарата разных доз холестериноксидазы на показатели липидного обмена в сыворотке крови крыс при пероральном введении в течение 30 дней

Группа животных	ХС сыворотки	ТГ сыворотки	ХС ЛПВП	Индекс атерогенности
1. Интактные крысы	1,40 ± 0,03	0,78 ± 0,02	0,93 ± 0,07	0,50
2. ГХС диета	4,69 ± 0,13*	0,42 ± 0,05*	0,55 ± 0,06*	7,43
3. ГХС диета + ХСО 2 ЕД	4,01 ± 0,15*, #	0,56 ± 0,07*	0,64 ± 0,08*, #	5,26
4. ГХС диета + ХСО 4 ЕД	3,96 ± 0,17*, #	0,52 ± 0,04*	0,73 ± 0,06*, #	4,43
5. ГХС диета + ХСО 8 ЕД	3,78 ± 0,31*, #	0,50 ± 0,03*	0,81 ± 0,09*, #	3,66
6. ГХС диета + ХСО 10 ЕД	2,92 ± 0,18*, #	0,51 ± 0,08*	0,96 ± 0,08*, #	2,04
7. ГХС диета + ХСО 20 ЕД	2,79 ± 0,27*, #	0,49 ± 0,06*	0,97 ± 0,05*, #	1,74
Примечание: * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2 при p < 0,05; # различия достоверны в сравнении групп 2 (ГХС диета) и 3, 4, 5, 6, 7, при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды, ЛПВП — липопротеины высокой плотности, ГХС — гиперхолестериновая.

Таблица 3. Влияние препарата холестериноксидазы на показатели липидного обмена в сыворотке крови и печени крыс при пероральном введении в течение 13 дней (диета — 22 дня)

Группа животных	ХС сыворотки	ТГ сыворотки	ХС печени	ТГ печени
1. Интактные крысы	1,32 ± 0,08	0,73 ± 0,06	4,45 ± 0,38	7,53 ± 0,91
2. ГХС диета	3,17 ± 0,13*	0,42 ± 0,05*	21,15 ± 0,96*	23,4 ± 1,03*
3. ГХС диета + ХСО 2 ЕД	1,71 ± 0,05*, #	0,32 ± 0,07*	14,48 ± 1,03*, #	12,0 ± 1,13*, #
Примечание: * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2 при p < 0,05; # различия достоверны в сравнении групп 2 и 3 при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды, ГХС — гиперхолестериновая.

 

Таблица 4. Влияние препарата холестериноксидазы, вводимой перорально в течение 12 и 24 дней, на изменение уровня липидов сыворотки крови у кроликов с дислипопротеинемией

Группа животных	n	ХС сыворотки крови (ммоль/л)			ТГ сыворотки (ммоль/л)			Индекс атерогенности, ЕД
		Начало опыта	Через 12 дней	Через 24 дня	Начало опыта	Через 12 дней	Через 24 дня	24 дня
1. Интактные морские свинки	5	1,1 ± 0,21	2,0 ± 0,44	1,4 ± 0,10	0,94 ± 0,10	0,90 ± 0,28	1,04 ± 0,08	1,0
2. ГХС диета	5	1,2 ± 0,16	29,7 ± 3,80*	45,0 ± 2,82*	0,62 ± 0,11*	1,67 ± 0,32*	2,45 ± 0,24*	149,0
3. ГХС диета + + ХСО	8	1,2 ± 0,05	24,5 ± 2,70*, #	11,7 ± 2,64*, #	0,91 ± 0,15*, #	0,42 ± 0,11*, #	0,97 ± 0,21*, #	12,0
Примечание: n — число животных в группе, * различия достоверны в сравнении групп 1 и 2, *, # различия достоверны в сравнении с группами 2 и 3, при p < 0,05. ХС — холестерин, ХСО — холестериноксидаза, ТГ — триглицериды.

 

Полученные во втором этапе результаты опытов по изучению влияния ХСО на развитие умеренной алиментарной ДЛП представлены в табл. 1–4. Введение препарата ХСО морским свинкам способствовало снижению уровня липидов в сыворотке крови и в печени данных животных (см. табл. 1). Так, уровень ХС в крови снизился на 49 %, в печени — на 26 %, содержание в сыворотке крови уменьшилось на 21 %, в печени — на 25 %, что свидетельствовало о выраженном гиполипидемическом действии изучаемого препарата. При тестировании влияния разных доз ХСО на модели алиментарной ДЛП у крыс (см. табл. 2) обнаружено, что при увеличении дозирования препарата наблюдалось достоверное снижение общего ХС сыворотки крови (группы 3–7 в сравнении с группой 2). Отмечено также позитивное увеличение концентрации ХС антиатерогенных ЛП — ХС ЛПВП (сниженной в результате моделирования ДЛП). При этом при анализе степени атерогенности сыворотки крови обнаружено снижение величины расчетного коэффициента: ИА составляет от 5,26 до 1,74 (группа 2 и опытные группы 3–7). В следующем эксперименте на модели ДЛП у крыс на ГХС диете было показано гиполипидемическое действие ХСО у крыс, получавших тестируемый препарат ХСО: ХС в сыворотке крови снижался на 47 %, в печени — на 34 %. Из-за использования в атерогенном рационе тиреоид-супрессорного агента МТУ уровень ТГ сыворотки крови не увеличивался. Липидснижающий эффект ХСО — снижение ТГ под влиянием препарата — наблюдался только в печени (см. табл. 3, группы 3 и 2). В табл. 4 приведены результаты, полученные после перорального введения ХСО кроликам. Из данных видно, что через 12 дней и, в большей степени, через 24 дня кормления животных гиперхолестериновой диетой значительно увеличилось содержание ХС в сыворотке крови и величина ИА (более чем в 12 раз) по сравнению с нормальными животными (группы 3 и 2). Результаты опытов, проведенных на трех видах экспериментальных животных (грызунов), свидетельствуют об имеющемся у препарата ХСО гиполипидемическом действии в условиях моделирования алиментарной ДЛП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в двухэтапном экспериментальном исследовании установлены биологическая активность, гиполипидемическое и антиатеросклеротическое действия ферментного препарата микробного происхождения холестериноксидазы. Полученные данные расширяют наше представление о фармакологическом действии фермента холестериноксидазы, что может иметь перспективу его внедрения в практику.

About the authors

Irina V. Okunevich

Institute of Experimental Medicine

Author for correspondence.
Email: irina_okunevich@mail.ru

Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, S.V. Anichkov Department of Neuropharmacology

Russian Federation, St. Petersburg

Natalia N. Klyueva

Institute of Experimental Medicine

Email: nnklyueva@gmail.com

Candidate of Biological Sciences, Researcher of the Department of Biochemistry

Russian Federation, St. Petersburg

Nina S. Parfenova

Institute of Experimental Medicine

Email: nina.parf@mail.ru

Candidate of Medical Sciences, Senior Researcher of the Department of Biochemistry

Russian Federation, St. Petersburg

Elena V. Belova

Institute of Experimental Medicine

Email: irina_okunevich@mail.ru

Candidate of Biological Sciences, Researcher of the Department of Biochemistry

Russian Federation, St. Petersburg

References