Strategies for search of pharmacological drugs against SARS-CoV-2 on the base of studying the structural-genetic features of coronaviruses SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Исследователи, изучающие семейство оболочечных коронавирусов (+)ssРНК-вирусов, инфицирующих позвоночных животных [133], постоянно встречаются с необходимостью определить, принадлежит ли вновь возникший вирус, вызывающий тяжелое заболевание у людей, к существующему виду у животных или к еще не установленному виду. Это произошло, например, с классификацией короновирусов (SARS) [30], с ближневосточным респираторным синдромом (MERS) [214] и с COVID-19, обнаруженным в Китае в 2019 г. и признанным в настоящее время пандемией [19, 193]. Каждый раз вирус помещался в таксономию с использованием информации, полученной на основе секвенированной классификации семейств [170, 208, 209].

В биологической номенклатуре семейство Coronaviridae состоит из многочисленных вирусов, заражающих человека, а также различные виды животных, включая сельскохозяйственные (кошек, собак, коров, верблюдов, свиней) и дикие (летучих мышей, панголинов, цивету и птиц). Современная систематика коронавирусов включает 39 видов в 27 подродах, пяти родах и двух подсемействах, которые относятся к семейству Coronaviridae, подсемейству Orthocoronavirinae, роду Betacoronavirus, подроду Sarbecovirus, подотряду Cornidovirineae, отряду Nidovirales и царству Riboviria [36, 66, 163, 203] (рис. 1).

 

Рис. 1. Общебиологическая классификация вирусов

 

Orthocoronavirinae, содержащее коронавирусы человека, состоит из четырех родов: альфа-коронавирусы, бета-коронавирусы, гамма-коронавирусы и дельта-коронавирусы. Коронавирусы (CоV) поражают различные органы и ткани и действуют как патогены, вызывая широкий спектр заболеваний, включая тяжелую респираторную инфекцию человека, называемую атипичной пневмонией. Обычно вирусы этого семейства индуцируют острую инфекцию, проявляющуюся признаками воспаления, характеризующимися свойствами синдрома «цитокинового шторма» [88, 210].

Структурно коронавирусы как оболочечные вирусы заключены в липидную оболочку и несут геномную (+)ssРНК, которая переносится вирусными частицами, внедряется в клетку и направляет синтез вирусных белков, а также субгеномных РНК и последующую репликацию вирусного генома и сборку вирусных частиц [133, 213]. В зависимости от вида, коронавирусная геномная РНК состоит из 25–30 тыс. нуклеотидов и несет 22–29 вирусных генов, кодирующих соответствующие белки, четыре из которых (N, S, M, E) играют основную структурную роль в вирусных частицах. Кроме того, в вирионах можно обнаружить ряд вспомогательных неструктурных вирусных белков, функционирующих, например, как ионные каналы (виропорины) [42].

В патогенезе инфекционного процесса в дыхательных путях человека при поражении коронавирусами SARS-CoV, MERS-CoV и COVID-19 можно выделить две стадии: раннюю (этиотропную) и позднюю (патогенетическую) [121, 128]. На первом этапе, когда размножение и накопление вируса преобладают при недостаточном иммунном ответе хозяина, применение химиотерапевтических средств, блокирующих размножение вируса, целесообразно для подавления развития заболевания. В данном обзоре рассмотрены 8 основных химиотерапевтических классов, направленных на строго определенные вирусные мишени: ингибиторы вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы, ингибиторы основной вирусной протеазы M^pro, ингибиторы вирусного белка S, позволяющего вирусу проникать в клетку-мишень, ингибиторы градиента рН вируса в клеточных эндосомах, ингибиторы вирусных хеликаз и топоизомераз, а также препараты экзогенных рекомбинантных интерферонов и соединения природных и рекомбинантных вируснейтрализующих антител. На втором этапе, размножение вируса уменьшается, но зато развиваются угрожающие патологические процессы избыточного воспаления, острого респираторного дистресс-синдрома, отека легких, гипоксии, вторичной бактериальной пневмонии и сепсиса. Следовательно, последующий патогенетический терапевтический подход, включающий экстракорпоральную оксигенацию крови, детоксикацию, а также препараты уменьшающие или блокирующие негативные реакции адаптивного иммунитета («цитокиновый шторм»), представляется наиболее эффективным способом лечения пациента.

КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ, ОСНОВАННАЯ НА БОЛЕЗНЯХ

Номенклатура вирусов — это в известной степени формальная система названий, используемая для обозначения вирусов и таксонов. Названия почти всех вирусов внутри вида происходят из-за исторического восприятия вирусов как возбудителей специфических заболеваний у конкретных хозяев, а также то, как мы обычно каталогизируем и классифицируем вновь открытые вирусы, однако все больше появляется вирусов, которые не были связаны с какой-либо известной болезнью в их соответствующих хозяевах (рис. 2).

 

Рис. 2. Филогенетическое древо коронавирусов, циркулирующих среди летучих мышей и людей, включая 5 видов рода Betacoronavirus, связанных с тяжелым острым респираторным синдромом (цит. по: [75] с изменениями)

 

Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ), являющаяся учреждением Организации Объединенных Наций (ООН), направленная на борьбу с инфекционными заболеваниями, часто прибегает к традиционному подходу увязки названий конкретных вирусных заболеваний и оценки новизны вируса путем явной неспособности обнаружить возбудителя с помощью установленных диагностических методов.

По международной классификации (International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV) вирусы группируются в таксоны по иерархической схеме рангов, в которой вид представляет самый низкий и наиболее густонаселенный ранг, содержащий наименее расходящиеся группы (таксоны) вирусов. ICTV формирует исследовательскую группу для каждого семейства вирусов [56]. Исследовательские группы отвечают за отнесение вирусов к вирусным видам и таксонам более высокого ранга, таким как роды, подроды, семейства и подсемейства. В этом смысле они играют важную роль в продвижении концепции видов вирусов и подчеркивают свою значимость [76].

Систематика семейств Coronaviridae разрабатывается исследовательской группой по коронавиридам, являющейся рабочей группой ICTV [101]. Рабочая группа отвечает за оценку места новых вирусов через их связь с известными вирусами в установленных таксонах, включая места размещения, относящиеся к виду «Тяжелого острого респираторного синдрома, связанный с коронавирусом». В классификации нидовирусов виды считаются биологическими единицами, разграниченными генетическим методом [115], в то время как в целом виды вирусов воспринимаются как искусственные конструкции [181]. Поэтому название вида выделено курсивом, начинается с заглавной буквы и не должно быть прописано в сокращенной форме [101]; отсюда и название вида — «Тяжелый острый респираторный синдром, связанный с коронавирусом». Согласно действующей международной классификации болезней [100], MERS и SARS классифицируются как 1D64 и 1D65 соответственно.

Хотя эти вирусы были изолированы в разное время и в разных местах от разных носителей, то есть от человека и животных (с клиническими заболеваниями и без них), все они принадлежат к этому виду [36]. Филогенетическая связь между SARS-CоV, MERS-CоV, SARS-CоV-2 и их взаимосвязь представлена на рис. 3.

 

Рис. 3. Наименования коронавирусов в связи с таксономией вирусов и болезнями, вызванными этими вирусами во время трех зоонозных вспышек ( — первичное имя;  — оригинальное имя)

 

ОБЩАЯ СТРУКТУРА БОЛЕЗНЕТВОРНЫХ КОРОНАВИРУСОВ

Как следует из криоэлектронной томографии и криоэлектронной микроскопии, вирионы коронавируса имеют сферическую форму с диаметрами примерно 65–125 нм (рис. 4) [162]. Клубковидные шипы на поверхности вириона являются наиболее заметной особенностью коронавирусов. Эти шипы придают им солнечный короноподобный вид, от которого происходит название «коронавирус». Нуклеокапсиды спирально симметричны и упакованы оболочкой вириона [67]. Структура и патогенез коронавирусов, включая SARS-CoV-2, описаны в ряде основополагающих работ [17, 20, 125, 140].

 

Рис. 4. Электронная микрофотография зрелых вирионов SARS-CoV-2 (цит. по: [127])

 

ОСНОВНЫЕ СТРУКТУРНЫЕ БЕЛКИ КОРОНАВИРУСОВ

Белок S (англ. spike protein) — это крупный многофункциональный вирусный трансмембранный белок класса I, размер которого варьирует от 1160 аминокислот в вирусе инфекционного бронхита у домашней птицы до 1400 аминокислот в коронавирусе кошек [29]. У коронавирусов человека белок S — это триммер, расположенный на поверхности вириона, что придает вириону корончатый вид. Что касается его функции, то он опосредует проникновение инфекционных частиц вириона в клетки путем образования прикреплений между частицами вириона и мембранами клетки-хозяина посредством взаимодействия с различными клеточными рецепторами [30]. Он играет важную роль в тканевом тропизме и определении хозяина, кроме того белок S способен индуцировать иммунный ответ реципиента [118]. В белках S во всех коронавирусах можно выделить два рабочих домена, S1 и S2 [111]. S1 функционирует как рецептор-связывающий домен (анг. receptor binding domain) [98], а S2 действует как субъединица мембранного синтеза. В домене S1 можно выделить два субдомена, названных N-терминальным доменом и С-терминальным доменом. Показано также, что С-терминальный домен S1 содержит рецептор-связывающий мотив [118]. Оба субдомена S1 и S2 действуют как рецептор-связывающие домены, эффективно взаимодействующие с различными рецепторами клеточной мембраны [175].

Белок M является наиболее распространенным структурным белком коронавирусного вириона. Это небольшой (~25–30 кДа) белок с тремя трансмембранными доменами, который отвечает за поддержание формы вириона [199]. Аминокислотные последовательности белка M различны у разных коронавирусов, однако в целом структурное сходство сохраняется [168]. Белок имеет короткий N-концевой гликозилированный домен вне вириона и гораздо больший С-концевой домен внутри вириона, который внедряется на 6–8 нм в вирусную частицу [179]. Большинство М-белков котрансляционно вводятся в мембрану вирусов без последовательности сигналов. Вирусная основа поддерживается взаимодействиями между белками M. Недавние исследования показали, что белок M существует в вирионе в качестве димера и может принимать две различные конформации, позволяющие белку содействовать кривизне мембраны, а также связываться с нуклеокапсидом [199].

Белок Е является самым маленьким структурным белком (~8–12 кДА) коронавирусов. Тем не менее он принимает участие во многих процессах в патогенезе, сборке и высвобождении вируса. Вирулентность вируса также связана с белком Е [165]. Белки Е из разных коронавирусов очень разнообразны по своим аминокислотным последовательностям, но характеризуются общей 3D-структурой [208]. Белок Е состоит из трех доменов: короткого гидрофильного аминотерминального домена, большого гидрофобного трансмембранного домена и терминального домена C [210]. Удаление гена, кодирующего белок Е, приводит к замедлению амплификации вируса, однако этот белок, по-видимому, не является определяющим для репликации SARS-CoV [55]. Помимо своей основной роли в сборке и высвобождении вируса, белок Е имеет и другие функции, например контролирует активность ионных каналов. При сравнении аминокислотной последовательности белка Е SARS-CoV с белком E SARS-CoV-2 (2019-nCoV) обнаружили ее идентичность без каких-либо изменений [187].

Белок N является единственным структурным белком, присутствующим в нуклеокапсиде. Он состоит из трех сильно консервативных и нескольких отдельных доменов: N-терминального домена (NTД), РНК-связывающего домена или области линкера (LKR) и C-терминального домена (CTД) [176]. NTД связывается с 3′-концом вирусной РНК и весьма вариабелен по аминокислотной последовательности от вируса к вирусу [66]. Область LKR, именуемая также СР (серин и аргинин) заряжена положительно из-за ее аминокислот, богатых серином и аргинином [115]. Установлено in vitro, что СР взаимодействует непосредственно с РНК и играет свою определенную роль в клеточной сигнализации [172, 206]. Белок N специфичен к двум субстратам РНК, это транскрипционная регуляторная последовательность (TRS) [158, 120] и геномный сигнал упаковки капсида [210]. Кроме того, белок N может также выступать в качестве вирусного супрессора РНК-блокатора в клетках млекопитающих [52]. Поскольку белок N сильно фосфорилирован [173], то он может изменять свою конформацию для повышения сродства к вирусной и невирусной РНК. В дополнение к сказанному отметим, что в процессе репликации белок N связывается с nsp3 [91] и белком M [7, 15]. В результате при взаимодействии эти белки помогают осуществлять упаковку вирусного капсида.

Гемагглютинин-эстераза (ГАЭ) является структурным белком, присутствующим в подсемействе бетакоронавирусов. Он действует как гемагглютинин, который связывает сиаловые кислоты с поверхностными гликопротеинами. ГАЭ также проявляет активность ацетилэстеразы [49, 52, 182]. Эти действия, как полагают, опосредуются белком S и усиливают вход вируса в клетки альвеолярного эпителия [50].

СТРУКТУРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2

Cтруктура SARS-CoV. Частицы вируса SARS-CоV имеют сферическую форму со средним диаметром 78 нм. Вирус содержит спиральный нуклеокапсид, окруженный оболочкой [73], покрытый палочкообразными длинными огибающими частицами длиной около 20 нм, с типичными корональными признаками. Генная структура SARS-СоV аналогична генной структуре других коронавирусов. Основная последовательность генов — это 5′-конец, репликаза, белок S, оболочечный белок E, мембранный белок M, нуклеокапсид [N], 3′-конец. Имеются также короткие нетранслируемые области на обоих концах. Последовательности остальных пяти неструктурных белков распределены между ORF S и N [60].

Установлено, что геном SARS-CoV содержит в общей сложности 11 орфов (ORF) и кодирует 23 зрелых белка [154]. Среди них два основных орфа (ORF1a и ORF1b) составляют около двух третей размера генома и кодируют два важных полипептида, pp1a (~450 кДа) и pp1ab (~750 кДа). Показано, что белки вируса транслируются одним длинным полипептидом, из которого затем высвобождаются две протеазы: M^pro (англ. major protease — «главная протеаза») [116] и PL^pro (англ. papain-like protease — папаин-подобная протеаза). PL^pro протеаза выполняет важнейшую функцию в метаболизме вируса, так как «нарезает» сплошной прополипептид вируса на отдельные функциональные белки [33, 142, 187]. В процессе протеолиза полипептиды pp1a и pp1ab кроме структурных белков расщепляются на ряд неструктурных белков, наиболее важными из которых являются РНК-зависимая РНК-полимераза, АТФазы и хеликаза (рис. 5).

 

Рис. 5. Взаимосвязь структурных и неструктурных полипептидных мишеней патогенных коронавирусов

 

Структура MERS-CоV. Геном MERS-CoV состоит из генов, кодирующих репликазу и структурные белки, подобные другим коронавирусам. Вирус имеет 10 орфов и кодирует 16 неструктурных белков, участвующих в процессе транскрипции и репликации вируса [37, 169]. В 2020 г. были опубликованы данные об особенностях кристаллической структуры хеликазы генома MERS-CoV, связанного с AПФ2 [161].

Структура SARS-CоV-2. В целом, структура SARS-CoV-2 разделяет все типичные характеристики с другими коронавирусами [140]. S. Wrapp и соавт. подробно рассмотрели структуру белка S SARS-CoV-2 и представили данные о его структуре с разрешением 3,5 Å [186]. Исследователи Y.W. Chen и соавт. сообщили об особенностях неструктурных белков 3CL [44]. Китайские ученые R. Yan и соавт. [196] обнаружили сложное взаимодействие транспортера аминокислот B⁰AT1 с рецептором AПФ2 клеток человека, что позволило получить важные сведения о молекулярной основе коронавирусной инфекции. Позже были опубликованы данные о кристаллической структуре области рецепторсвязывающего домена S1 белка S SARS-CoV-2, связанного с AПФ2 [113]. Архитектура SARS-CoV-2 с постфузионным белком S наблюдалась с помощью Cryo-EM, что позволило получить подробное изображение диссоциированных доменов белка S [127, 171].

ИНФИЦИРОВАНИЕ (ПОПАДАНИЕ КОРОНАВИРУСА В КЛЕТКУ ЧЕЛОВЕКА)

Внедрение SARS-CoV. Подобно другим коронавирусам, SARS-CoV проникает в клетки путем эндоцитоза и слияния мембран, образуя комплекс рецептор – клетка – AПФ2 [60, 111]. SARS-CoV входит в клетки-мишени и может ингибироваться полианионными соединениями, что позволяет предположить, что белок оболочки SARS-CoV может быть положительно заряжен. В то же время проникший в клетку вирус должен находиться в эндосоме с низким pH для получения эффективной распаковки вириона, что указывает на ее pH-зависимый эффект [168]. Вирусная РНК реплицируется в уникальных бутылкообразных бислойных мембранных компартментах [79]. В ряде исследований было установлено, что внедрение SARS-CоV может вызывать ультраструктурные изменения как in vivo, так и в культивируемых клетках, включая образование микровезикул, эндосом и нуклеокапсидных включений в цитоплазме [73].

Внедрение MERS-CоV. Установлено, что MERS-CоV способен заражать и убивать не только клетки альвеолярного эпителия, но и Т-клетки [47]. MERS-CоV проникает в клетки человека, связываясь с рецептором DPP4, экспрессируемым в клетках почки и в других органах [16], также он использует протеазы хозяина для проникновения в клетки легких. Фурин в межклеточном пространстве активирует белок S на вирусной оболочке, опосредуя слияние мембран и проникновение вируса в клетки человека [143, 213]. Таким образом, подобно SARS-CoV, MERS-CоV может преодолевать естественный иммунный ответ человека, затем производить высокие титры вирионов и индуцировать дисбаланс цитокинов [81, 169].

Особенности внедрения SARS-CoV-2. В 2003 г. методом масс-спектрометрии было показано, что рецептор AПФ2 связывается с белком S коронавируса SARS-CoV [122], позже было подтверждено, что AПФ2 является также рецептором и для SARS-CoV-2, необходимым для проникновения коронавируса в клетки человека [202]. Китайские ученые в 2020 г. провели обширные сравнительные исследования и составили самый большой в мире атлас клеток почек человека с 42 589 клетками и определили 19 ведущих кластеров с помощью иерархического кластерного анализа [191].

Исследователи установили, что гены AПФ2 и клеточной трансмембранной сериновой протеазы TMPRSS2 были значительно коэкспрессированы в подоцитах и клетках проксимальных извитых канальцев почек человека. Сравнительный анализ с другими клетками человека показал, что экспрессия AПФ2 в клетках почек была не меньше, чем в эпителиоцитах легких, пищевода, тонкого кишечника и толстой кишки. Эти данные позволяют предположить, что клетки почки человека, несущие АПФ2, также могут быть очередным органом-мишенью для SARS-CoV-2.

Что касается предрасположенности различных групп населения к SARS-CоV-2, то китайские ученые [43] показали, что экспрессия AПФ2 у азиатов была аналогична экспрессии AПФ2 у людей других рас и не имела гендерных различий. Было также установлено, что AПФ2 значительно повышается после коронавирусной инфекции, включая SARS-CoV и SARS-CoV-2 [184]. Анализ открытых данных показывает, что уровень экспрессии AПФ2 в клетках жировой ткани был выше, чем в клетках легких, что указывает на то, что жировая ткань также является потенциальной мишенью для SARS-CoV-2 [94].

В настоящее время известно, что SARS-CoV-2 преимущественно заражает клетки респираторного эпителия, но в работах второй половины 2020 г. продемонстрировано, что SARS-CoV-2 также может заражать Т-лимфоциты [185], клетки селезенки и клетки лимфатических узлов [201]. Таким образом, данные всех выполненных исследований подтверждают, что AПФ2 является не только участником ренин-ангиотензиновой системы человека [58], но его клеточный рецептор служит для связи с белком S SARS-CoV-2. Анализ рецептор-связывающего мотива (RBM) SARS-CoV, являющегося частью рецептор-связывающего домена S1, показал, что именно он вступает в контакт с рецептором AПФ2 человека [124]. Установлено также, что большинство аминокислотных остатков, необходимых для связывания рецептора AПФ2 с RBM SARS-CoV, сохранены и в SARS-CoV-2 [184]. M. Hoffmann и соавт. в эксперименте при блокировании рецептора AПФ2 в клетках Vero обнаружили, что вирулентность SARS-CoV-2 резко понижалась, и что клеточная сериновая протеаза TMPRSS2 при этом также играла важную роль [88].

Таким образом, сравнительными исследованиями коронавирусов, выполненными в настоящее время, установлено, что вирион SARS-CoV-2 проникает в клетку путем эндоцитоза: S-белок, прикидываясь «своим», связывается с клеточным рецептором AПФ2, вследствие чего мембраны вируса и клеточной эндосомы сливаются и после ее закисления и разрушения РНК вируса выходит во внутриклеточное пространство. При активации геном вируса транслируется в полипептиды (pp1a и рр1ab), с помощью которых формируется копия РНК вируса и восемь мРНК-шаблонов для генерации вирусных белков в просвете (ERGIC) между эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР) и аппаратом Гольджи. Впоследствии компоненты вируса в клеточной цитоплазме собираются в вирионы и путем экзоцитоза выходят из клетки для последующего заражения соседних клеток.

СТРАТЕГИЯ ПОИСКА ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Против SARS-CoV-2

Неослабевающий интерес исследователей к коронавиридам в настоящее время вызван необходимостью срочно создать лекарства против опасного типа пневмонии человека, вызванной новым штаммом бета-коронавируса — SARS-CoV-2 [132, 133]. Этот штамм оказался близок к бета-коронавирусу, SARS-подобному коронавирусу, а также к тем, которые индуцируют SARS (тяжелый острый респираторный синдром) и MERS (ближневосточный респираторный синдром), которые вызвали в 2003 и 2012 гг. вспышки тяжелой пневмонии у людей, впоследствии названной атипичной пневмонией. Эти инфекции не вызвали широкого пандемического распространения, но продемонстрировали для человечества угрожающую картину из-за высокого уровня смертности, достигающего 9,6–35,5 % [69, 90].

Тем не менее, несмотря на 15-летнюю историю контакта с опасными коронавирусами и ожидание новых вспышек, человечество не успело разработать специфичного противокоронавирусного средства [160]. Во время прежних вспышек применяли препараты широкого спектра действия рибавирин и интерферон-альфа [10]. Применительно к вирусам это означает, что эффект не гарантирован, а возникающие побочные осложнения не вполне предсказуемы. Недавно была продемонстрирована эффективность рибавирина против SARS-CoV-2 [104], но нужны более расширенные и тщательные клинические исследования.

Таким образом, анализ современных исследований [8, 31] по поиску препаратов против коронавирусов позволяет выделить 8 основных классов фармакологических лекарственных средств, действующих на различные вирусные мишени, которые позволяют блокировать внедрение и воспроизводство коронавируса и подавлять развитие заболевания у человека. Эти лекарственные средства разрабатываются на основе современных знаний о жизненном цикле коронавируса и патогенетических механизмах, лежащих в основе коронавирусной инфекции, они включают:

1) ингибиторы вирусной полимеразы;

2) ингибиторы коронавирусной протеазы M^pro;

3) ингибиторы клеточных протеаз человека;

4) ингибиторы входа вирионов в клетку, то есть ингибиторы белка S;

5) ингибиторы вирусной хеликазы и топоизомеразы;

6) искусственные дефензины, разрушители вирионов;

7) препараты рекомбинантных интерферонов α2 и β1;

8) препараты, содержащие специфичные противовирусные антитела.

Рассмотрим подробнее выделенные направления.

1. Ингибиторы вирусной полимеразы.

Вирусная полимераза (РНК-зависимая РНК-полимераза) является стандартной терапевтической мишенью, так как ее блокада подавляет репликацию вирусного генома и образование вирионов. К настоящему времени существуют разнообразные мультиспецифические ингибиторы РНК-полимеразы различных вирусов, что обусловлено выраженными структурными и функциональными сходствами этого фермента, существующими среди многих вирусов [146, 148].

Рибавирин (фуранозилкарбоксиамид, лат. ribavirinum) — ингибитор полимеразы относится к числу ингибиторов РНК-зависимой РНК-полимеразы коронавирусов, причем ранее было показано, что он проявляет высокую блокирующую активность в отношении различных вирусов [164], в концентрации 10–25 нМ с индексом селективности (IC₅₀) более 100 [138].

Установлено, что рибавирин как аналог гуанозина (рис. 6) препятствует репликации РНК- и ДНК-содержащих вирусов. Однако противовирусная активность рибавирина не ограничивается интерференцией только с полимеразами, но особая структура рибавирина также препятствует трансляции РНК, поскольку для этого вирусная РНК использует природный гуанозин. Кроме того, чтобы еще больше способствовать дестабилизации вирусной РНК, рибавирин ингибирует естественное производство гуанозина в клетке путем прямого ингибирования инозинмонофосфатдегидрогеназы [80].

 

Рис. 6. Структурная формула рибавирина

 

Отметим, что поскольку атипичная пневмония, SARS, MERS и COVID-19 развиваются в основном в клетках эпителия дыхательных путей, то наиболее подходящей лекарственной формой могут служить аэрозольные ингаляции рибавирина, проявляющие эффективную противовирусную активность при нетоксичных концентрациях в эпителиальном клеточном слое дыхательных путей и, таким образом, могут служить наиболее подходящим лекарственным препаратом против коронавирусов [64, 104]. Это основано на низкой биодоступности клеток легких при пероральном введении по сравнению с аэрозольным рибавирином (1 % и более 70 % соответственно) и его последующей активации, происходящей в альвеолярных эпителиальных клетках [72]. Считается, что прямое аэрозольное воздействие на альвеолярный эпителий может быть наиболее активным и эффективным на ранней стадии начала инфекции, так как сопровождается блокированием репликации вируса в молчащей фазе, когда патологические явления воспаления и отека еще не достигли опасного уровня.

В настоящее время китайские врачи, применявшие рибавирин как монопрепарат для лечения COVID-19, отмечают его небольшую эффективность и рекомендуют использовать это лечебное средство в сочетании с другими препаратами [92], такого же мнения придерживаются и исследователи из США [104].

Другим кандидатом препаратов для борьбы с коронавирусами могут быть фавипиравир (лат. favipiravirum) и его рибозилированные производные [61]; они проявляют высокий противовирусный потенциал и селективность в отношении различных РНК-содержащих вирусов (рис. 7) [57]. На рисунке показано, что лечебное действие фавипиравир приобретает при поступлении в клетки человека и превращении его в активную форму.

 

Рис. 7. Схема действия фавипиравира на процесс репликации вируса, проникшего в клетку человека (цит. по: [62] с изменениями)

 

В настоящее время фавипиравир в качестве лекарственного средства Авифавир, Арепливир и Коронавир разрешен Минздравом РФ для лечения COVID-19 [1, 3, 9]. Арепливир, в качестве лекарства от коронавируса, ингибирует цитохром CYP2C8 и альдегидоксидазу, но не влияет на систему цитохрома Р450. Максимальная действующая концентрация достигается в течение 1,5 ч. Степень связывания с белками плазмы составляет до 54 %, частично метаболизируется ксантиоксидазой до гидроксилированной формы.

Следует также отметить отечественный антивирусный препарат Арбидол (лат. umifenovirum, производное фавипиравира) [2], который показал свою эффективность при лечении пациентов COVID-19 [58, 132, 197].

Еще одним перспективным препаратом, блокирующим репликацию, является ремдесивир (лат. remdesivirum), полученный из фосфорилированного 1′-цианзамещенного аденозина (рис. 8). Он является препаратом широкого спектра действия, обладающим высоким противовирусным потенциалом в отношении различных вирусов, включая коронавирусы [63, 126, 130, 160]. Отметим основополагающие работы, выполненные C.J. Gordon и соавт. [77], в которых детально исследован механизм ингибирования ремдесивером РНК-зависимой РНК-полимеразы. В настоящее время ремдесивир включен FDA (США) для лечебной терапии COVID-19 при тяжелых формах пневмонии [144, 160].

 

Рис. 8. Схема превращения ремдесивира в фармакологически активную фосфорилированную форму в клетках человека

 

2. Ингибиторы внедрения вирионов в клетки человека.

Ранее уже упоминалось, что началом инфицирования является вирусный белок S (~150 кДa), который инициирует проникновение коронавирусов в клетки-мишени [15, 67]. Внутри клетки этот белок подвергается целенаправленному расщеплению на две отдельные субъединицы, S1 и S2, строго на определенном участке протеолитического расщепления (позиция 641–687) [51, 106].

Следовательно, процесс эффективного ингибирования этого белка может происходить либо непосредственно, либо на этапе протеолитического расщепления. В качестве потенциального ингибитора предлагается использовать хлорохин (лат. сhloroquinum) или гидроксихлорохин. В качестве действующего лекарства хлорохин широко используется в медицинской практике для лечения малярии. Ранее в экспериментах было показано, что этот препарат проявляет выраженную активность в отношении коронавирусов в клеточных культурах и на моделях животных [152]. Механизм его действия против отдельных вирусов обусловлен изменением внутриклеточного рН, что сопровождается изменением рН в эндосомах внутри клетки [153], мешающее рН-зависимым конформационным переходам белков слияния вируса до активного состояния, в результате чего эти процессы приводят к замедлению депротеинизации вируса («раздевание» вируса) в эндосомах внутри клетки и, соответственно, блокируют дальнейшее заражение клеток-мишеней. Кроме того, хлорохин может изменить гликозилирование клеточных рецепторов, включая рецептор AПФ2 и, таким образом, изменяет вирулентность как SARS-CoV, так и SARS-CoV-2 [50, 179].

Основываясь на этих данных, хлорохин был рекомендован для лечения COVID-19 и, по мнению китайских ученых, продемонстрировал положительные эффекты у ряда пациентов [70]. Недавно появилась обзорная работа американских ученых, продемонстрировавших при анализе данных значительного количества пациентов, лечебный эффект перепрофилированных препаратов (рис. 9) [55]. Исследователи использовали при анализе различные дополнительные факторы: возраст, пол, расовую и этническую принадлежность, индекс массы тела, наличие сердечно-сосудистого заболевания или факторов риска: диабета, заболевания легких, курения, слабого иммунитета, а также исходно тяжелое течение COVID-19. В выборку попали сведения о 96 тысячах пациентов с подтвержденным диагнозом COVID-19 из 671 госпиталя на шести континентах.

 

Рис. 9. Обобщенные данные по применению перепрофилированных препаратов для лечения пациентов с COVID-19 (цит. по: [55] с изменениями)

 

3. Ингибиторы главной коронавирусной протеазы M^pro.

Геномы коронавирусов — самые большие среди РНК-содержащих вирусов, при этом размер генома SARS-CoV-2 составляет около 30 тыс. нуклеотидов [97]. SARS-CoV-2 имеет довольно сложноустроенный жизненный цикл (рис. 10).

 

Рис. 10. Схема жизненного цикла коронавируса SARS-CoV-2 и его мишеней для воздействия лекарственных препаратов. АПФ-2 — клеточный рецептор для прикрепления SARS-CoV-2, TMPRSS2 — клеточная трансмембранная сериновая протеаза для прикрепления SARS-CoV-2, RdRp — РНК-зависимая РНК-полимераза, ЭПР — эндоплазматический ретикулум, NFAT — ядерный фактор активированных Т-клеток

 

Поэтому такой сложноустроенный механизм (SARS-CoV-2) легко «сломать», так как потенциальных мишеней для лекарственного воздействия на SARS-CoV-2 достаточно (рис. 10). Но хорошее лекарство должно защищать не только от текущей пандемии COVID-19, но и от других сходных инфекций, которые могут появиться в любой момент при возникновении новых разновидностей коронавирусов. При поиске лекарств необходимо исходить из эволюционно стабильных компонентов вируса, то есть «прицеливаться» в белки, которые в ходе эволюции у коронавирусов менялись мало (это так называемые консервативные белки). Одним из этих белков является главная протеаза вируса (M^pro) — ее и используют как главную мишень для разработки противокоронавирусных лекарств [8, 54, 145, 158, 206], в том числе методами перепрофилирования [114]. Учитывают при этом, что протеазы разных вирусов могут различаться и по структуре, и по механизму катализа. Например, протеаза ВИЧ — аспартатная, а протеаза вируса гепатита C — сериновая [51], то есть они относятся к разным классам и имеют разный механизм действия. Так, каталитический домен протеазы, являющийся сериновой протеазой коронавируса по 3D-укладке похож на химотрипсин [6].

Сейчас известно, что при трансляции вирусной РНК CoV образуется длинный прополипептид (~750 кДа), который в последующем подвергается расщеплению аутопротеолизом на 14–16 фрагментов (nsp1-nsp16), в зависимости от типа вируса [18]. Затем nsp12 может функционировать в качестве активной вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы и регулирует репликацию вирусного генома и последующий синтез вирусных белков на первом этапе репликации коронавируса после попадания в клетки-мишени [68]. Оказалось, что расщепление полипептида 1ab (pp1ab) опосредовано его собственным доменом 5 (nsp5 — протеазный домен M^pro), проявляющим специфичность целевых протеолитических сайтов, близких к протеазам пикорнавируса и ВИЧ [104], поэтому протеаза M^pro, как показано в настоящее время [54, 128, 160], становится чувствительной к ингибиторам лопинавир/ритонавир. У некоторых вирусов два начальных разрыва внутри полипептида 1ab выполняются белком Nsp3, несущим папаиноподобный домен цистеиновой протеазы PL2^pro [117]. Таким образом, лопинавир/ритонавир, моделирующие протеолитические целевые участки в вирусных белках, проявляли выраженный терапевтический эффект против SARS и MERS [128, 160, 198]. Структурное сходство в протеазном домене nsp5 вирусов SARS, MERS и COVID-19 позволяет однозначно рекомендовать его в качестве мишени для поиска препаратов для лечения атипичной пневмонии при COVID-19 [128, 193]. Использование таких препаратов может быть особенно эффективным во время ранней стадии инфекции, когда происходит начальная стадия репликации SARS-CoV-2 [32, 119].

4. Ингибиторы вирусной хеликазы и топоизомеразы.

В настоящее время всеми признано, что сверхспиральная надмолекуляная структура ДНК эукариот и прокариот регулируется сложной ферментной системой, состоящей из хеликаз и топоизомераз [4, 59, 147].

При этом установлено, что хеликазы суперсемейств I и II (SF1H и SF2H) многих (+)ssРНК- содержащих вирусов входят в состав репликативного комплекса и участвуют, наряду с РНК-полимеразой, в репликации вирусных геномов. (+)ssРНК-содержащие вирусы контролируются путем разрушения вирусных РНК, направляемых специфическими малыми РНК. Геномы вирусов кодируют супрессоры РНК-сайленсинга, подавляющие защитный ответ хозяина, основанный на РНК-интерференции, что делает возможной эффективную репликацию вируса. Была предложена гипотеза, согласно которой эта новая функция, приобретенная ретротранспозонами в результате горизонтального переноса генов, может способствовать частичному выходу из-под контроля, осуществляемого клеточной системой РНК-сайленсинга [12].

Уже установлено, что (+)ssРНК вируса SARS-CoV-2 при проникновении в клетку инициирует и контролирует производство вирусного прополипептида, содержащего 7098 аминокислотных остатков, который затем в процессе аутолиза распадается на шестнадцать небольших полипептидов, контролирующих жизненный цикл вируса [67]. Выявлены также особенности структуры хеликазы коронавирусов [53, 85].

Поскольку в настоящее время COVID-19 инфицированы свыше 15 млн человек в мире, то открытие молекулярных мишеней этого вируса является большим достижением современной науки. Отметим, что до 2020 г. ключевые биологические функции неструктурного белка Nsp2 SARS-CoV были неизвестны. В настоящее время использование базы данных Genbank и поиск на основе гомологии последовательностей среди известных белковых аминокислотных последовательностей позволили понять функции этого белка [22, 38]. Удалось показать, что РНК-топоизомеразная активность функционально близка ДНК топоизомеразам типа I, аналогичная активность была обнаружена в белке Nsp2 SARS-CoV-2 [22] путем поиска гомологии с Vibrio haemolyticus Type I и ДНК-топоизомеразой типа IV, а также с гиразой E. coli и ДНК-праймазой. Исследователи предположили, что РНК-топоизомеразная активность SARS-CoV-2 необходима для высвобождения узлов РНК–РНК и супервитков во время синтеза гомологичных РНК-цепей с последующим синтезом субгеномной РНК [21, 84].

Наконец, после компьютерных сопоставлений по гомологии исследователи пришли к выводу, что белок Nsp2 функционально можно отнести к DNA топоизомеразе типа IV и типа I Vibrio haemolytica, где NH₂-концевые домены topoVI имеют сходство с COOH-концевыми доменами белка Nsp2, а COOH-домены topo I имеют сходство с NH₂-концевыми доменами Nsp2. Таким образом, белок Nsp2 является РНК-топоизомеразой коронавируса и сильным кандидатом в качестве мишени на разработку лекарственных препаратов и вакцин против SARS-CoV-2. Кроме того, небольшой пептид (HN₂-LVN-KFL-ALC-ADS-III-GGA-KLK-ALN-LGE-TFV-CO2H) Nsp2 длиной 30 аминокислот может быть хорошей пептидной основой для создания вакцины против коронавируса. Исследователи также синтезировали праймер nsp2F1 (5′-CCTGATAGTCTTGCCGA-3′) и праймер nsp2R1 (5′-GAGCAGTTTCAAGAGTGCGG-3′), пригодные для диагностики инфекции COVID-19 методом ПЦР в реальном времени.

В других исследованиях с использованием молекулярного докинга показано, что производные триазолов также могут служить потенциальными ингибиторами коронавирусных хеликаз [203].

Резюмируя, отметим, что разработка лекарственных средств, блокаторов хеликазы и топоизомеразы SARS-CoV-2, является перспективным направлением для практических фармакологов (рис. 11) [46, 84].

 

Рис. 11. Вероятные клеточные мишени для разработки лекарств против SARS-CoV-2 (цит. по: [84] с изменениями). АПФ-2 — клеточный рецептор для прикрепления SARS-CoV-2, NSP — неструктурный белок (англ. Nonstructural protein), АТФ — аденозинтрифосфат, ΦΦ — фосфаты

 

Подтверждением вышесказанному являются результаты молекулярного докинга перспективных препаратов. Среди них следует отметить 4 противоопухолевых лекарственных препарата, классических ингибитора топоизомераз — amrubicin, daunorubicin, idarubicin, teniposid [96].

5. Ингибиторы клеточных протеаз человека.

Установлено, что клеточная трансмембранно-связанная сериновая протеаза TMPRSS2 участвует в активации белка S [106, 130], вследствие чего ингибиторы, нацеленные на эту протеазу, могут подавлять инфицирование клетки и распространение вируса в месте инфекции [88]. Этот терапевтический подход может быть применен в клинической практике при использовании уже проверенных на других вирусах ингибиторов протеаз, например, апротинина [6], камостата и нафамостата [88].

Необходимо также отметить, что эти aнтипротеазные агенты оказывают сильное противовоспалительное действие посредством ингибирования некоторых провоспалительных цитокинов и соответствующих им сигнальных путей [7, 211], в свою очередь эти действия могут заблокировать определенные патогенетические эффекты, то есть уменьшить воспаление легких и отек, что может действовать благотворно на течение второго этапа инфекционного процесса. В настоящее время понятно, что патогенетические механизмы, связанные с излишней активацией протеаз и последующим приростом активных провоспалительных цитокинов, могут оказывать доминирующее влияние на тяжесть заболевания [24, 186].

Последние данные из Китая позволяют предположить, что наряду с сериновой протеазой TMPRSS2 [86, 105] и другие клеточные протеазы, а также фурин и эндосомальный катепсин L клеток хозяина также могут быть вовлечены в протеолитическую активацию белка S [24, 51, 88]. Следовательно, если бы была подтверждена роль фурина, активирующего белки ряда вирусов, как считают некоторые ученые [103, 150], то в качестве противовирусных препаратов можно было бы рекомендовать использовать известные природные растительные ингибиторы [146], а также проверенные синтетические олигопептидные ингибиторы [163, 190].

6. Искусственные дефензины как разрушители вирионов.

Основными мишенями для дефензинов в первую очередь являются бактерии, и лишь во вторую — оболочечные и безоболочечные вирусы. Антивирусная активность дефензинов была изучена на многих вирусах, включая вирус ВИЧ, вирус папилломы человека, вирус герпеса простого, дыхательный синцитиальный вирус и несколько других [5, 8, 191]. В 2020 г. появилась экспериментальная работа, в которой виртуальным докингом изучили взаимодействие дефензинов человека с поверхностным белком S SARS-CoV-2 [108]. Однако лечебная терапия коронавирусных инфекций, даже в эксперименте, основанная на препаратах дефензинов, находится пока в доклинических и преклинических исследованиях (табл. 1).

 

§     Таблица 1. Стадии исследования дефензинов и дефензиноподобных препаратов
Название препарата	Фирма- изготовитель	Фаза исследования	Исходные условия применения
Brilacidin (аналог дефензина)	Innovation Pharmaceuticals Inc.	Вторая клиническая	Бактериальные поражения кожи; поверхность бактерий; оральные микозы; поверхность вирусов
α-Дефензин-5 человека	Therapeutics ApS	Доклиническая	Астмa; воспаление кишечника; метаболический синдром

 

Тем не менее, основываясь на функциональных свойствах дефензинов, фирмой Innovation Pharmaceuticals Inc. был синтезирован препарат брилацидин (лат. Brilacidinum), структурно напоминающий дефензин, в качестве препарата для обработки поверхности кожи, пораженной Staphylococcus aureus, включая устойчивый к метицилину S. aureus и чувствительный к метицилину S. aureus при острых бактериальных инфекциях. Предполагается, что этот препарат будет пригоден для лечения воспаления слизистой оболочки бронхов легких. Брилацидин как аналог дефензина является разрушителем бактериальной мембраны, а также выборочно поражает поверхность вирусов. В 2020 г. фармацевтическая компания планирует продвинуть брилацидин как потенциально новый способ лечения коронавируса COVID-19. В качестве аналога дефензина, брилацидин мог бы усилить естественный иммунный ответ организма человека в борьбе против COVID-19 [34].

7. Препараты рекомбинатных интерферонов α2 и β1.

Препараты, содержащие человеческий рекомбинантный интерферон классов α2 и β1, были использованы в терапии пациентов различной этиологии, связанных с инфекциями, инициируемых SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-nCoV [48, 198]. Было установлено, что интерферон-β1 оказывает незначительное лечебное действие, тогда как интерферон-α2 вообще не проявлял активности, однако наиболее выраженная активность наблюдалась после применения интерферона-β1 в комбинации с рибавирином [138, 160, 199]. При выборе стратегии лечения следует учитывать, что препараты интерферона проявляют пиковую эффективность только на ранних стадиях заболевания, когда реакция человека еще не слишком сильная или не достигла своего пика [39, 90, 139]. Поэтому, использование препаратов на основе экзогенного интерферона вряд ли будет рациональным на более поздних стадиях заболевания из-за большого количества эндогенных интерферонов, вырабатываемых в ответ на острую коронавирусную инфекцию. Наконец, введение препаратов на основе экзогенного интерферона на поздних стадиях заболевания за счет дальнейшего повышения предварительно заданного высокого уровня эндогенных интерферонов может способствовать развитию «цитокинового шторма» и воспаления в очаге инфекции, тем самым ухудшая течение заболевания [39, 210].

8. Препараты, содержащие специфичные противовирусные антитела.

Такой подход к терапии коронавирусной инфекции подразумевает введение антител, способных нейтрализовать инфекционные свойства этого вируса. Кроме того, введение антител может также использоваться для ранней профилактики заболеваний, называемой пассивной иммунизацией. Существуют две основные возможности для использования противовирусных антител [28, 74, 135]: во-первых, это разработка и создание специализированных вируснейтрализующих антител (или их активных противовирусных доменов) с использованием генной инженерии и биотехнологии [195]. Такие препараты, специфичные для коронавирусов, включая SARS-CoV-2, еще не созданы [159]; во-вторых, это специфичный противовирусный иммуноглобулиновый препарат, полученный более традиционным и простым методом от выздоравливающих пациентов, или от реконвалесцентов после COVID-19, или от животных, вакцинированных вирионами SARS-CoV-2 или его компонентами [23, 109, 212]. Опубликованы первые сообщения об успешном введении противовирусных иммуноглобулинов, полученных из плазмы реконвалесцентов с MERS и COVID-19, которые были использованы для лечения атипичной пневмонии в Китае во время вспышки атипичной пневмонии SARS-CoV-2 в 2020 г. [110]. Однако, для успешного применения таких препаратов необходимо, чтобы реконвалесцентные сывороточные иммуноглобулины содержали высокий титр (не менее 1 : 640) анти-CоV антител [14, 22, 26, 60].

Известно, что реконвалесцентная плазма выздоровевших пациентов была впервые использована в Китае в феврале 2020 г. для успешного лечения тяжелобольных пациентов с COVID-19 [60]. Было показано, что в донорской плазме с высоким титром антител к SARS-CoV-2 не обнаруживались вирионы SARS-CoV-2 [41]. Врачи отмечали, что уже через 12–24 ч после трансфузии основные симптомы воспаления значительно уменьшились параллельно с увеличением количества лимфоцитов и насыщения крови кислородом. Наблюдалось также улучшение общих показателей жизнедеятельности. Хотя точные механизмы, лежащие в основе лечебного механизма, неизвестны, есть основания предполагать, что антитела могут связывать вирус и предотвращать взаимодействие вируса с клеткой-хозяином, а следовательно, предотвращать инфекцию. Кроме того, NK-клетки и другие иммунные клетки могут также участвовать в уничтожении вируса с помощью антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности.

Кроме того, ранее было отмечено, что инфекционность коронавируса к иммунным клеткам усиливается некоторыми типами искусственных антител, нацеленных на белок S SARS-CoV [182]. К счастью, пока такие антитела еще не были идентифицированы в сыворотке крови выздоравливающих пациентов с COVID-19 [183].

Тем не менее ряд инфекционистов считают, что следует учитывать потенциальные риски, связанные с использованием реконвалесцентной плазмы, включая передачу неизвестных пока патогенов и аллергическую реакцию, следовательно, эта стратегия может применяться только в случае чрезвычайной клинической ситуации после проведения стандартных лечебных процедур. Поэтому, как уже отмечалось, специфический иммуноглобулин может быть гораздо лучшим вариантом лечения тяжелобольных пациентов с COVID-19.

ОСОБЕННОСТИ ПЕРЕПОЗИЦИОНИРОВАНИЯ (ПРИМЕНЕНИЯ ЛЕКАРСТВ ПО НОВЫМ ПОКАЗАНИЯМ) ПРОТИВ COVID-19

В ряде статей [31, 45, 71, 86, 156] обсуждается применение лекарств по новым показаниям целого ряда препаратов, пригодных в качестве лекарств для лечения COVID-19. Основное преимущество такого подхода заключается в том, что перепрофилированный препарат ранее уже был оценен на предмет его безопасности доклиническими и клиническими испытаниями, что позволяет сэкономить значительное количество времени, материальных ресурсов и денег [131, 149, 166]. Действительно, большинство препаратов, которые в настоящее время исследуются на эффективность против SARS-CoV-2, являются перепрофилированными известными лекарственными средствами [50, 89, 167].

Можно выделить два основных направления, которые используют современные исследователи для перепозиционирования, или перепрофилирования (англ. repurposing), существующих лекарственных препаратов. Во-первых, это различные математические методы на основе компьютерных технологий и, во-вторых, — экспериментальное тестирование перепрофилированных препаратов на клеточных линиях и на мышиных моделях. Остановимся подробнее на анализе этих направлений.

А. Использование компьютерных технологий.

В настоящее время одним из самых распространенных подходов является поиск новых лекарственных средств при помощи математических методов с использованием компьютеров. При моделировании взаимодействий в этих исследованиях используются хорошо изученные лекарственные мишени, которые включают протеазу клеток человека TMPRSS2 [65], вирусную протеазу М^pro [40, 113, 203], вирусный белок S [78], оболочечный белок Е ионного канала [83], 2′-О-рибозометилтрансферазу [105], нуклеокапсидный белок N [155] и РНК-зависимую РНК-полимеразу [64].

1. Молекулярный докинг. Самым известным из них является методика молекулярной стыковки (англ. molecular docking). В докинге виртуально оценивается, возможно ли проникновение молекулы в связывающий домен биологической мишени и эффективное взаимодействие с ней [11]. Это один из самых известных и эффективных методов компьютерного моделирования связывания лекарства с рецептором. Чаще всего при поиске новых лекарств используют библиотеки известных соединений в существующих международных базах данных и трехмерную структуру молекулярной мишени. При этом самой используемой в настоящее время является трехмерная структура основных белков SARS-CoV-2 (она доступна в банке данных PDB под шифром 6LU7), как потенциальных мишеней для ингибиторов [178, 202]. В дальнейшую разработку поступают вещества, показавшие по результатам моделирования максимальную энергию связывания. Такой подход называется виртуальным скринингом.

В 2020 г. с помощью специальных программ по международным базам данных находят белки, сходные по последовательности с исследуемым, имеющие общее с ним эволюционное происхождение (это называется гомологией), и, что важно, для них уже расшифрована трехмерная структура. Ее используют в качестве шаблона, на который с помощью других программ буквально «нанизывают» исследуемый белок — предполагая, что так он будет сворачиваться (3D-структура) в естественных условиях [64, 102].

Основываясь на результатах виртуального скрининга SARS-CoV-2 3CLpro [18], препараты рилапладиб, саквинавир, оксолиновая кислота, элвитегравир, батефентерол, ситафлоксацин, CP-609754, GSK-256066, алатрофлоксацин и кварфлоксин были выбраны как лучшие соединения из коммерческих лечебных препаратов на основе хинолина. Из этих соединений только саквинавир (8,5 ккал/моль) взаимодействует с активным каталитическим доменом (Cys145 и His41) SARS-CoV-2 2CLpro. Показано, что саквинавир образует 7 гидрофобных взаимодействий (Cys145, Met165, Met49, Leu27, Leu167, Leu141 и Phe140), 12 полярных взаимодействий (His41, Asn142, His163, Ser144, Ser46, Thr25, Thr26, Thr24, Gln192, Gln189, Thr190 и His164), одно отрицательно заряженное взаимодействие (Glu166) и одно взаимодействие глицина (Gly143) с SARS-CoV-2 3CLpro. Таким образом, для развития сильных взаимодействий в каталитической диаде CysHis авторами было сделано заключение, что саквинавир будет препятствовать активности 3CL^pro.

Подобный подход применили и китайские ученые, которые использовали в качестве шаблона для моделирования 3D-структуру M^pro SARS-CoV, установленную еще в 2002 г. [189]. Эта структура доступна теперь всем исследователям в банке данных PDB (www.rcsb.org) [126]. В этих исследованиях библиотека для докинга включала 1900 наименований лекарств. Но только более трети из них имели высокие значения расчетной энергии связывания. Сократить круг поиска помог отбор молекул, связывающихся с вирусной протеазой аналогично уже известным веществам. Этот поиск также проводился с помощью компьютерной техники. Таким образом список препаратов сократили до 159. Затем исследователи визуально отобрали модели 15 структур полученных комплексов. Их и использовали для более точного метода — моделирования движений молекул во времени (молекулярной динамики). В результате всех этих действий был отобран нелфинавир — известное противовирусное средство, которое в настоящее время используется для лечения ВИЧ. Исследователи посчитали потенциально интересными также питавастатин препарат для снижения холестерина, антипсихотропный препарат перампанел и празиквантел, применяющийся для лечения гельминтозов.

В дальнейшем ученые использовали антиВИЧ-препараты как инструмент для последовательного сравнения связывающих участков протеазы M^pro SARS-CoV и SARS-CoV-2 [129]. Таким образом, компьютерное моделирование (докинг) показало, что исследуемые домены в протеазах связывают лекарство сходным образом. Затем руководствуясь этими данными и используя в качестве библиотеки базу данных DrugBank исследователи провели виртуальный скрининг и выявили 10 предполагаемых ингибиторов, однако химическая структура полученных соединений оказалась довольно пестрая: от антипсихотропных до противогрибковых препаратов.

Другой группой китайских ученых были получены более надежные результаты [122], так как их исследовательская библиотека включала уже 8000 подходящих препаратов. В результате скрининга отобрали 690 кандидатов. При этом авторы исключили, по их мнению, «неинтересные» вещества: красители, токсичные вещества, препараты, применяемые в неврологии и противоопухолевые лекарства со значимыми побочными эффектами. Из оставшихся 50 было выделено четыре соединения: прулифлоксацин (фторхинолоновый антибиотик), биктегравир (ингибитор протеазы ВИЧ), нелфинавир (еще один ингибитор протеазы ВИЧ) и тегобувир (препарат, используемый для лечения гепатита С).

В США исследователи, работающие в университете Ванкувера [175], применили разработанный ими метод «глубокого докинга» для поиска активных молекул состыковывая их с 3D-структурой М^pro SARS-CoV-2 [177]. Такой подход позволил им проверить гораздо больше соединений, чем при обычном докинге: ведь компьютер по соответствующей программе умеет «предугадывать», какая энергия получится при докинге, и отбрасывать неподходящие молекулы. Применяя этот подход, авторы смогли провести виртуальный скрининг более 1,3 млрд молекул, взятых из базы данных ZINC. В числе выявленных ими подходящих веществ оказался препарат для лечения ВИЧ — лопинавир (в настоящее время, уже используемый для лечения COVID-19). Было также отмечено, что соединение № 80 (имени у этого вещества пока нет) — это ингибитор протеазы SARS-CoV (это было установлено в 2002 г.). Однако 99 % выявленных соединений пока не синтезировано — это еще предстоит сделать.

Таким образом, и молекулярный докинг и виртуальный скрининг продемонстрировали свою привлекательность в деле поиска перспективных препаратов для ускорения борьбы с коронавирусом SARS-CoV-2. Исследования с использованием такого компьютерного инструмента продолжаются очень активно, однако необходимо иметь в виду, что у этих работ пока нет достаточного экспериментального подтверждения эффективности этих препаратов против COVID-19.

2. Перепозиционирование (перепрофилирование) на основе структурного соответствия. Дальнейшим развитием цифровых методов в поиске перспективных лекарств является использование подходов на основе обучающих программ и искусственного интеллекта. Основной мотивацией ученых послужило то, что применение искусственного интеллекта уже привело к неплохим результатам: сейчас искусственный интеллект предсказывает пути синтеза неорганических материалов [107], а также определяет, как образуется 3D-структура белка [165]; также с его помощью удалось разработать новые ингибиторы DDR-киназ [202]. В XXI в. эти методы стремительно входят в практику фармацевтических компаний, однако необходимость в лечебных препаратах против коронавируса SARS-CoV-2 требует, чтобы их применение наступило уже сейчас.

В настоящее время компания InSilico Medicine Hong Kong Ltd одна из первых предложила использовать свои протоколы для разработки новых противокоронавирусных препаратов. Суть их состоит в том, чтобы «заставить» компьютер сгенерировать структуру препарата [204], причем генерировать предполагалось на основе 3D-структуры вирусной протеазы M^pro. Сотрудники фирмы использовали информацию о почти 6 тыс. известных антипротеазных соединений. Компания применила весь имеющийся у нее арсенал архитектуры нейронных сетей: сети-автокодировщики, состязательные сети (в таком методе две нейронные сети соревнуются между собой), языковые модели (работающие по принципу предсказания следующего слова в предложении). Затем созданные компьютером молекулы подвергались фильтрации и отсеву по определенным критериям: по физико-химическим параметрам, по отсутствию «нехороших» групп, по предсказанной активности, по качеству докинга на модели протеазы, по показателям новизны и разнообразия.

Моделируя структурное соответствие исследователями S. Chatterjee и соавт. [40] был выполнен виртуальный скрининг, основанный на базе данных DrugBank, что привело к 20 попаданиям против вирусной протеазы 3CL^pro. Был проведен расчет энергии связи для основных комплексов протеазы. Среди первых пяти попаданий нафарелин и икатибант имели энергию связи 712,94 и 851,74 кДж/моль соответственно. Основываясь на энергии связывания и стабильности белково-лигандного комплекса, ученые предлагают эти два препарата в качестве эффективных ингибиторов против основной вирусной протеазы SARS-CoV-2.

Японские ученые C. Wu и соавт. [188] провели масштабные исследования по всем возможным мишеням в составе коронавируса, проведя скрининг методом молекулярного докинга существующих лекарств и натуральных соединений. По каждой мишени был получен список из 40 «наилучших» препаратов. В частности, для ритонавира было найдено две возможные мишени, для лопинавира — даже четыре, но ингибиторов главной протеазы среди них не оказалось. Зато рибавирин — аналог нуклеозида, для которого было ожидаемо действие на репликацию и синтез белка, оказался лидером по связыванию с папаин-подобной протеазой PL^pro. Сходными свойствами обладал валганцикловир — противогерпетическое средство, тоже нуклеозидной природы. Результаты скрининга против M^pro напоминают данные американских исследователей, которые отобрали препарат, используемый против вируса ВИЧ — ампренавир и блокатор нейтральной эндопептидазы — кандоксатрил [179]. Этих данных достаточно, чтобы показать, что компьютерные технологии способны предложить весомое количество предварительных данных по отбору препаратов, в том числе методом перепрофилирования для борьбы с коронавирусом. Однако будут ли они пригодны в качестве лечебных средств — покажет время, так как необходима серьеозная экспериментальная проверка их эффективности и безопасности.

P. Richardson и соавт. [152] использовали искусственный интеллект для перепрофилирования выпускаемых в настоящее время лекарственных препаратов. Предварительно они ввели машине важные данные из научной литературы, в частности, тот факт, что белок AПФ2, с которым связывается коронавирус, участвует в эндоцитозе. Из экспериментов известно, что AПФ2-ассоциированная протеинкиназа-1 является важным регулятором эндоцитоза. Следовательно, блокирование протеинкиназы-1 может предотвратить эндоцитоз вируса. На основании этого искусственный интеллект протестировал 300 наиболее известных ингибиторов протеинкиназы-1, а исследователи выбрали из них 40 для будущей проверки в клинической практике. Из оставшихся сорока убрали препараты, обладающие выраженными побочными эффектами и требующие высоких дозировок лекарств. Среди выделенных шести высокоактивных ингибиторов особенно интересным оказался бариситиниб (известное лекарство для лечения ревматоидного артрита), являющийся ингибитором янус-киназы. Кроме того, выявили, что он ингибирует не только протеинкиназу-1, но и циклин G-ассоциированную киназу, которая также принимает участвует в эндоцитозе. На основании этого сотрудники фирмы предположили, что бариситиниб можно использовать для профилактики и лечения пациентов с COVID-19. В публикации [11] утверждается, что по работе P. Richardson и соавторов американцем Лемоником опубликованы критические замечания. Ученый считает, что использование искусственного интеллекта — это просто продвинутый научный поиск, доступный и научному работнику. Спрашивается, зачем нужен искусственный интеллект? Однако следует согласиться с большинством исследователей, которые считают, что такой подход может оказаться полезным в будущем. В дополнение к сказанному отметим, что сотрудники фирмы позже все же провели компьютерный скрининг, в ходе которого был отобран препарат цинансерин — антагонист серотонина, разрабатывавшийся ранее как фармакологическое средство для воздействия на нервную систему. Кроме того, уже продемонстрирована антивирусная эффективность препарата на клеточной культуре [98]. В другой работе D.D. Nguen и соавт. [141] использовали сверточные нейронные сети, работающие по принципу нейронных сетей в зрительных центрах коры головного мозга. Используя эту технологию и выбранную компьютерную модель, они протестировали около 1400 известных лекарственных препаратов для их перепрофилирования в качестве средства для лечения пациентов с COVID-19. По наибольшей активности выбрали несколько препаратов: противоопухолевое таргетное средство, ингибитор протеасом бортезомиб, антипсихотропный и успокоительный препарат флуразепам и таргетный препарат для лечения лейкемии понатиниб, а также ингибитор протеазы вируса гепатита С боцепревир, причем авторы отметили его как имеющий высокую предсказанную аффинность к протеазе M^pro коронавируса. Предсказанная аффинность препарата составила 9,36 ккал/моль, что является высоким показателем. Самим неподходящим оказался фосфорорганический яд изофлурофат — активность которого составила всего 4,94 ккал/моль, что весьма мало по меркам молекулярного докинга.

Исследователи из Кореи [27] в качестве ключевого элемента ввели в нейронную сеть константу связывания препаратов с вирусными белками и провели поиск активных молекул среди коммерчески доступных лечебных препаратов. В результате этой работы отобрали четыре эффективных препарата: ритонавир, используемый против ВИЧ, отметим, что он уже использовался для терапии коронавирусной инфекции (в сочетании с лопинавиром), а также атазанавир, эфавиренц и ганцикловир (противовирусный препарат).

Б. Использование экспериментальных методов для тестирования перепрофилированных препаратов.

1. Исследование перепрофилированных препаратов на культуре клеток. В настоящее время экспериментаторы из разных стран для тестирования вирулентности COVID-19 используют культуру клеток Vero-E6 (ATCC в CRL-1586) [144], а также Calu-3 (ATCC в HTB-55), Caco-2 (ATCC в HTB-37), Huh7, A549 (ATCC в CCL-185), 293T [99]. Показано, например, что препарат фавипиравир in vitro эффективно ингибирует вирус SARS-CoV-2, причем ЕС₅₀ в клетках Vero-Е 6 составляет 61,88 мкмоль, или 9,72 мкг/мл. Выявленная ранее неэффективность препарата лопинавир [25] была вновь перепроверена по его активности ингибировать репликацию SARS-CoV и SARS-CoV-2 in vitro [35]. Современные экспериментаторы [35] учли три фактора:

• во-первых, ЕC₅₀ не является идеальным фармакодинамическим параметром, поскольку при концентрации 50 % вирус все еще размножается, поэтому предпочтительно рассматривать ЕC₉₀. Соответственно, эффективность лопинавира оценивали по ЕC₅₀ с перерасчетом на ЕC₉₀ с учетом коэффициента наклона;
• во-вторых, лопинавир циркулирует в организме в значительной степени связанным с белками плазмы (>95 %), и его ингибирующая активность на репликацию вируса по сути представляет 5 % и менее свободной лекарственной фракции. Поэтому значения ЕC должны быть скорректированы с учетом содержания сывороточного белка в крови;
• в-третьих, следует должным образом учитывать концентрацию препарата в очаге инфекции. Чтобы решить эти две последние проблемы, авторы оценили скорректированный белком EC₉₀ лопинавира в легких и центральной нервной системе, учитывая соотношение содержания лопинавира в эпителиальных клетках сосудов к плазме или в спинномозговой жидкости к плазме [35]. Авторы предположили, что свободные фракции лопинавира в плазме и спинномозговой жидкости составляют 35 и 100 % соответственно, они исходили из того, что концентрации альбумина в эпителиальных клетках и спинномозговой жидкости примерно в 7 и 200 раз ниже, чем в плазме.

Результаты экспериментов показали, что скорректированные на белок EC₉₀ значения in vitro для ВИЧ, SARS-CoV и SARS-CoV-2 соответственно составили 1,00, 9000 и 4680 мкМ в плазме, а концентрация лопинавира в плазме крови, измеренная in vivo у ВИЧ-инфицированных, колебалась от 1 до 20 мкМ, а у пациентов с COVID-19 10–40 мкМ (табл. 2).

 

§     Таблица 2. Фармакокинетика лопинавира при исследовании in vitro и in vivo против ВИЧ, SARS-CoV, SARS-CoV-2
Фармакокинетика	ВИЧ	SARS-CoV	SARS-CoV-2
In vitro, лопинавир, EC50, µM	0,006	50	26
In vitro, лопинавир, EC50, µM	0,05	450	234
In vitro, лопинавир, СК-EC50 (в плазме), µM	1,00	9000	4680
In vitro, лопинавир, СК-EC50 (в клетках), µM	0,14	756	393
In vitro, лопинавир, СК-EC50 (CМ), µM	12,5	112,500	58,500
In vivo, непосредственно лопинавир, µM	1–20	Не определяли	10–50
Примечание. СК — скорректировано по белку; СМ — в спинномозговой жидкости.

 

Рассматриваемые вместе эти данные ясно указывают, что текущая доза лопинавира обеспечивает эффективные концентрации, превышающие скорректированный EC₉₀ для ВИЧ. Таким образом, белок-скорректированные ЕC₉₀ значения лопинавира, необходимые для ингибирования репликации SARS-CoV-2 в плазме крови, эпителиальных клетках и спинномозговой жидкости, соответственно в 200, 20 и 2000 раз превышают концентрации, измеренные in vivo у пациентов с COVID-19.

Поэтому неудивительно, что лопинавир оказался малоэффективным для лечения атипичной пневмонии CоV-2, как это было задокументировано в исследованиях B. Сao и соавт. [32]. Следовательно, выбор доз, необходимых для обеспечения оптимального ингибирования, неосуществим из-за неприемлемого риска токсичности. Эти результаты подтверждают практику применения для лечения COVID-19 комбинации препаратов лопинавир/ритонавир в качестве одного из ключевых методов лечения [35].

2. Исследование вирулентности COVID-19 на модели пневмонии у мышей. В работах современных исследователей для оценки препаратов против COVID-19 и эффективности противовирусных вакцин используются трансгенные мыши [95, 174]. H. Gu и соавт. [82] разработали модель инфекции трансгенной мыши SARS-CoV-2 АПФ2 (HFH4-hACE2 у мышей C3B6). При этом у зараженных мышей диагностировали типичную интерстициальную пневмонию, которая имела патологические признаки, сходные с таковыми у пациентов COVID-19. Количественная оценка вирусной зараженности показала, что легкие являются основным очагом инфекции, хотя вирусная РНК также может быть обнаружена у некоторых мышей в глазу, сердце и мозге. Вирус, идентичный SARS-CoV-2 в полногеномных последовательностях, был выделен из инфицированных тканей легких и головного мозга. Данные этой работы показывают, что мышь с человеческим геном hACE2 может быть ценным инструментом для тестирования терапевтических средств и потенциальных вакцин. H. Gu и соавт. [82] сообщают о генерации мышиного адаптированного штамма SARS-CoV-2, который может продуктивно размножаться в дыхательных путях и вызывать интерстициальную пневмонию у иммунокомпетентных мышей дикого типа. Кроме того, на этой модели была проанализирована защитная эффективность недавно разработанной рекомбинантной вакцины на основе субъединицы RBD S-белка SARS-CoV-2 [82].
3. Поиск лекарств для комбинированной терапии (лечение пациентов COVID-19). В настоящее время по-прежнему отсутствует глубокое исследование полного патофизиологического процесса Covid-19 во взаимосвязи с сопутствующими сердечно-сосудистыми заболеваниями. Тем не менее, основываясь на данных клинических исследований и теоретических предпосылках, можно заключить, что SARS CoV-2 оказывает влияние на сердечно-сосудистую систему через различные механизмы [207]. Показано, что сигнальная цепь S-белок/фурин/AПФ2, как вариант, еще одно потенциальное объяснение восприимчивости сердца к COVID-19 [143, 182]. Кроме того, чувствительность реципиента к инфекции SARS-CoV-2 может быть обусловлена одновременным повышением уровня AПФ2 и фурина в пораженном миокарде, а также ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РААС) в этой популяции [137]. Отсутствие специфического противоковидного препарата означает, что инфицированные люди не могут лечиться, и это создает трудности в контроле распространения вируса. В настоящее время лечащие врачи в основном полагаются на меры изоляции, чтобы предотвратить распространение COVID-19 [176]. Клиническое применение в Китае для лечения COVID-19 хлорохина и гидроксихлорохина как перепрофилированных препаратов приносило пользу, но увеличивало риск аритмии и вызывало другие побочные эффекты [23, 27, 50]. Поэтому необходимо продолжать тестировать и применять имеющиеся в настоящее время и будущие методы лечения COVID-19. Эксперименты с применением иммунологических и фармакологических методов показали, что у пациентов с инфекцией SARS-CoV-2 транзиторная регуляция вирусных сайтов связывания на AПФ2 или фурине может представлять собой новую терапевтическую стратегию для лечения COVID-19 [156].

Таким образом, в поиске универсальных препаратов для лечения пациентов с COVID-19 перспективный подходом является понижение воздействия SARS-CoV-2 на больной организм человека как на первом этапе, так и на втором, чтобы уменьшить эффекты «цитокинового шторма», вызываемые адаптивным иммунным ответом 2-го этапа течения болезни пациента после внедрения вируса [136].

Отметим, что полученные в 2020 г. данные из разных стран по диагностике и лечению пневмонии у больных COVID-19 позволяют значительно расширить поиск противоковидных препаратов [96]. При этом использование компьютерных технологий показало, что в компьютерных скринингах при поиске блокаторов одной из основных вирусных мышеней протеазы M^pro «выигрывают» препараты для лечения ВИЧ-инфекции и гепатита C. Причем именно те препараты, которые блокируют протеазы этих вирусов. Такой факт кажется очевидным — ведь протеазы могут быть похожи у разных вирусов.

Установлено, что положительный лечебный эффект наблюдается при введении рибавирина, интерферона-β1 и лопинавира/ритонавира [138, 159, 198]. Комбинированное применение препаратов позволяет: во-первых, повысить терапевтическую эффективность; во-вторых, снизить дозировку препарата; в-третьих, предотвратить появление опасных вирусных мутантов с повышенной вирулентностью. Ранее на практике было установлено, что риск развития вирусных мутантов у инфицированного человека минимизируется при применении комбинированной терапии [134].

Однако не все так очевидно. Протеазы могут различаться по структуре и механизму катализа. В частности, протеаза вируса ВИЧ аспартатная, а протеаза вируса гепатита C — сериновая [151], то есть они относятся к разным классам и имеют разный механизм действия. В настоящее время установлено, что каталитический домен протеазы оболочечного коронавируса по 3D-укладке похож на химотрипсин, который, как известно, является сериновой протеазой [192]. При таком разнообразии структуры можно предположить, что если ингибитор от одной протеазы подойдет к другой, то, возможно, будет эффективно ее блокировать. Таким образом, искусственный интеллект как предварительный этап может позволить прикинуть шансы на успех in vivo.

Кроме того, при недостатке экспериментальной информации самый очевидный путь может оказаться неверным. Сейчас уже известно, что лопинавир с ритонавиром эффективны против коронавирусов, но связан ли лечебный эффект именно с ингибированием протеазы [25]? Результаты рассмотренных выше предварительных математических исследований положительно отвечают на этот вопрос, потому что в этих исследованиях протеаза была единственной мишенью для молекулярного докинга [188].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Всесторонние уроки, извлеченные из вспышек инфекций SARS-СоV и MERS-CоV, несмотря на присущую им трагичность, дают поучительный опыт и понимание того, как и какими методами бороться с вирусной пандемией SARS-СоV-2. Препараты, которые ингибируют вирусную диссеминацию и нарушают вирусную репликацию, могут снижать вызванные коронавирусом прямые цитопатические эффекты, а лечение, которое сдерживает воспалительные реакции человека (например, антителами или соединениями, нейтрализующими цитокины или их родственные рецепторы, такие как анти-ИЛ-6, анти-ИЛ-6R или анти-ИЛ-1β), в идеале только в дыхательных путях может уменьшить вызванные вирусом вторичные иммунопатологии [14]. Мы предполагаем, что комбинация таких методов лечения была бы наиболее подходящей терапевтической стратегией для более тяжелых коронавирусных инфекций человека. В обзорной работе S. Drożdżal и соавт. [55] подытожены современные данные про применению антиковидных препаратов в клиниках различных стран. Необходимо отметить, что в настоящее время в России также имеется два официально утвержденных документа, в которых есть перечень препаратов для противовирусной терапии пациентов с тяжелой формой COVID-19 [13, 14].

About the authors

Vladimir I. Vashchenko

S.M. Kirov Military Medical Academy

Author for correspondence.
Email: vladimir-vaschenko@yandex.ru

Dr. Biol. Sci., Head, Department of Biochemistry, Centre of Blood and Tissues

Russian Federation, Saint Petersburg

Vladimir N. Vilyaninov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: vilyaninov@mail.ru

PhD, Chief, Centre of Blood and Tissues

Russian Federation, Saint Petersburg

Petr D. Shabanov

S.M. Kirov Military Medical Academy

Email: pdshabanov@mail.ru

Dr. Med. Sci., Professor and Head, Department of Pharmacology

Russian Federation, Saint Petersburg

References