Benzodiazepine tranquilizers abolish the stress-induced increase of the brain ghrelin level in DANIO RERIO

Aleksandra A. Blazhenko; Блаженко Александра Александровна; Platon P. Khokhlov; Хохлов Платон Платонович; Ilia Yu. Tissen; Тиссен Илья Юрьевич; Aleksandr S. Devyashin; Девяшин Александр Сергеевич; Andrei A. Lebedev; Лебедев Андрей Андреевич; Sergey N. Proshin; Прошин Сергей Николаевич; Eugenii R. Bychkov; Бычков Евгений Рудольфович; Petr D. Shabanov; Шабанов Петр Дмитриевич

doi:10.17816/RCF184327-332

Benzodiazepine tranquilizers abolish the stress-induced increase of the brain ghrelin level in DANIO RERIO

Authors: Blazhenko A.A.¹, Khokhlov P.P.¹, Tissen I.Y.¹, Devyashin A.S.¹, Lebedev A.A.¹, Proshin S.N.², Bychkov E.R.¹, Shabanov P.D.¹^,2
Affiliations:
1. Institute of Experimental Medicine
2. Saint Petersburg State University
Issue: Vol 18, No 4 (2020)
Pages: 327-332
Section: Original articles
URL: https://journals.eco-vector.com/RCF/article/view/56959
DOI: https://doi.org/10.17816/RCF184327-332
ID: 56959

Cite item

Full Text

Open Access
Restricted Access

Access granted
Restricted Access

Subscription or Fee Access

Abstract
Full Text
About the authors
References
Statistics

Abstract

Danio rerio has firmly established itself as a successful model for research in many areas of biology and medicine, first of all for developing new medicines.

The aim of our study was to evaluate ghrelin level in zebrafish brain after stress and after phenazepam usage on stressed fish.

Methods. In our study 96 Danio rerio, predator Cichlasoma nicaraguensis have been used. The fish have been kept at a normal room temperature (22–23 °C) with standard feeding time (twice per day). The level of neuropeptides has been tested by ELISA test. During experiment a fish has been firstly placed in a beaker with a dissolved pharmacological substance, then has been transferred into a tank with predator. In the end of experiment, it has been put into a novel tank for 6 min. The decapitation has been made. The brain has been divided into three anatomical parts: telencephalon just behind the olfactory bulb, the middle part – corpora bigemia and cerebellum, which is situated behind the corpora bigemia. After that the material for ELISA test was made using GhrelinFISH, MyBioSource ELISA kit.

Results. In the control group ghrelin has been determined only in the cerebellum in 57.14% of all fish. In the experiment with predator ghrelin has been found in all tested brain parts of fish, but in the telencephalon there was the highest level. In the experiment with phenazepam usage only and phenazepam administration after predator stress, the ghrelin value has not been determined at all.

Conclusion. Thus we have found out that the ghrelin value increases after predator stress and the drug phenazepam eliminated it completely after its administration. We may suppose that the administration of anxiolytics such as phenazepam can reduce the anxiety in Danio rerio.

Keywords

Danio rerio, brain ghrelin, phenazepam, tranquilizers

Full Text

ВВЕДЕНИЕ

Разнообразные факторы могут привести к нарушению психической деятельности человека в виде тревожного и/или депрессивного расстройства. При этом прогноз неутешителен: частота этой формы нарушений высшей психической деятельности в дальнейшем будет только возрастать [4, 12]. У некоторых людей коморбидность депрессии с тревожным расстройством может возникать в отсутствие какого-либо заметного стресса в повседневной жизни, тогда как у других лиц, кто подвержен хроническим стрессам, может никогда не развиться клиническая форма депрессивного расстройства [14]. Пытаясь понять механизмы, лежащие в основе тревожно-депрессивных расстройств у человека, были предложены различные модели на животных, прежде всего грызунах[15]. Были использованы различные тесты, которые измеряют стремление животных избежать неприятной ситуации[15], потерю способности получать удовольствие от деятельности, которая обычно вызывает удовольствие[18]. Также были разработаны генетически модифицированные модели животных, на которых показано, что депрессивно-тревожное поведение не появлялось, когда физиологический ответ на стресс снижался[18]. Очевидно, что имеется необходимость сравнения различных моделей стресса, чтобы получить более точную и исчерпывающую информацию о влиянии различных типов стресса на психику, и какие временные периоды этого воздействия являются критическими для развития тревожно-депрессивного состояния[17]. При этом приходит понимание, что, скорее всего, более подходящей моделью для исследования тревожных расстройств являются животные с менее комплексным когнитивным поведением, чем млекопитающие, например Zebrafish (Danio rerio)[7]. Кроме того, было убедительно доказано, что у Danio rerio эволюционно консервативная нервная система, и этот объект идеально подходит для генетического и молекулярного анализа механизмов, лежащих в основе эмоционального и мотивационного поведения, включая ответ не только на психоактивные субстанции, но и на стресс[8, 11]. Нейропептид грелин может быть потенциальным биомаркером стрессогенного воздействия, поскольку его повышение отмечено при состояниях, связанных с недостатком пищи, анорексии и кахексии[8, 9].

Целью работы было определение в головном мозге Danio rerio пептида грелина как возможного биомаркера стресса. Мы использовали модель «тест с хищником» с последующим воздействием анксиолитика бензодиазепинового ряда феназепама.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выбор животных. В работе использованы рыбы Danio rerio (Cyprinidae, Teleostei) в возрасте 6–8 мес. (молодые половозрелые животные) фирмы «Аква Питер» и выращенные в ФГБНУ «ИЭМ», все Danio rerio дикого типа (wildtype). Для тестирования использовали интактных животных (n = 96, обоих полов). Объем аквариумов по 40 л (всего 3 аквариума), по 20–30 животных в каждом. Животных содержали в стандартных условиях светового режима (8.00–20.00) при температуре воды 22 ± 2 °C, кормили дважды в день стандартным кормом «Tetramin tropical flakes».

Модель стресса с хищником. Исследуемое животное помещали в мерный стакан объемом 200 мл с растворенным фармакологическим веществом или водой (контроль) на 5 мин, а затем в аквариум с водой (10 × 10 × 10 см) на 5 мин и далее в просмотровый аквариум на 6 мин с хищником Hypsophrys nicaraguensis.

Фармакологические вещества. Для фармакологического воздействия применяли препарат из группы анксиолитиков бензодиазепинового ряда феназепам в дозировке 1 мг/л [1, 2].

Для определения уровня пептидов в головном мозге рыб использовали высокочувствительный твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА). Предварительно животные были введены в глубокий наркоз, после чего была произведена декапитация. Головной мозг Danio rerio разделяли хирургически под бинокулярной лупой МБС-1 на 3 анатомические части: в качестве переднего мозга выделяли анатомический telencephalon, образец среднего мозга включал corpora bigemia, отдельно выделяли мозжечок (лат. cerebellum) [5]. Затем готовили материал для ИФА, используя Ghrelin FISH, MyBioSource ELISA kit.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью пакетов Stаtistica v. 6 и Origin v. 7.5. Нормальность распределений оценивали при помощи критерия Колмогорова – Смирнова, значимость различий между группами — при помощи t-критерия Стьюдента, либо U-критерия Мана – Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ

В эксперименте была использована модель стресса с хищником, которая чаще используется в опытах на млекопитающих. Такой эксперимент представляет собой модель острого стресса для животного. Мы использовали введение Danio rerio в глубокий наркоз сразу же после эксперимента и получение материала (ткани мозга) в первые минуты, что позволило более объективно оценивать полученные результаты.

У интактных особей Danio rerio грелин определяется только в мозжечке, наиболее древней и развитой структуре мозга рыб (см. рисунок, а). При экспозиции Danio rerio с хищником уровень грелина возрастает в переднем (telencephalon) и среднем (сorpora bigemia) мозге и уменьшается в мозжечке (б). Феназепам 1 мг/л полностью устраняет повышенный уровень грелина во всех исследованных областях, как у интактных особей (в), так и животных, подвергнутых экспозиции с хищником (г).

Рис. 1

Влияние острого стресса и феназепама на содержание грелина (пг/мг общего белка) в разных отделах мозга Danio rerio: а — распределение уровней грелина в разных отделах мозга Danio rerio; б — влияние экспозиции с хищником на уровень грелина; в — влияние феназепама на уровень грелина у контрольных особей; г — влияние феназепама на уровень грелина у особей после экспозиции с хищником; д — содержание грелина в переднем мозге; е — содержание грелина в среднем мозге; ж — содержание грелина в мозжечке

Если рассматривать эффекты влияния экспозиции с хищником на уровень грелина в исследованных структурах, то обращает на себя внимание максимальная реакция переднего мозга, когда уровень грелина повышается до нанограммовых концентраций (см. рисунок, д), и в меньшей степени, но значимо возрастает уровень грелина в среднем мозге (е). В мозжечке уровень грелина, напротив, снижается относительно базального, повышенного до 500 пг/мг общего белка у контрольных животных (ж). Феназемам нивелирует все повышенные экспозицией с хищником уровни грелина в исследованных областях мозга. То есть в исследовании было выявлено, что на воздействие хищника реагирует эволюционно более молодые структуры, и в первую очередь, передний мозг. Мозжечок, как самая эволюционно древняя и наиболее развитая у рыб структура, более инертна к воздействию стрессогенного фактора. И, наконец, транквилизатор феназепам устраняет все изменения, возникающие под воздействием хищника.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты иммуноферментного анализа показали, что в контрольной группе рыб грелин определялся только в мозжечке, наиболее филогенетически древней структуре мозга, при этом частота выявляемости составила лишь 57,1 ± 2,8 %. Стрессогенное воздействие в виде экспозиции с хищником повышает уровень грелина в эволюционно более молодых структурах — переднем и среднем мозге, но снижает его в мозжечке.

Из представленных данных возникает как минимум несколько вопросов. Во-первых, насколько адекватна модель острого стресса на рыбах Danio rerio для изучения молекулярных механизмов стресса? Во-вторых, можно ли рассматривать повышение уровня грелина на стрессогенное воздействие как некий маркер стресса? И, в-третьих, каковы механизмы воздействия феназепама на грелиновую пептидную систему? Ответ на первые два вопроса, без сомнения, положителен. Danio rerio можно использовать как объект для изучения стресса, поскольку рыба полностью повторяет закономерности реагирования на стрессогенные факторы, как и млекопитающие, в частности грызуны, наиболее часто привлекаемые в изучение стрессогенных реакций [1]. Более того, у рыб основным гормоном стресса, как и у человека, является кортизол, а у крыс — кортикостерон, у человека присутствующий лишь в следовых количествах [2]. Это сближает оба объекта исследования. Система грелина, состоящая, по меньшей мере, из трех структурных компонентов (ацилированный грелин, дезацилированный грелин и обестатин) и соответствующих рецепторов GHSR-1A и GHSR-1B в разных структурах организма, включая центральную нервную систему, является довольно чувствительной в плане реактивности на стрессогенные воздействия [3, 11]. Так, ранее на крысах нами было показано изменение уровня грелина у стрессированных животных, которое уменьшалось под влиянием антагониста грелина [D-Lys3]-GHRP-6 [3]. В то же время вопрос о синтезе грелина в головном мозге de novo под влиянием стрессогенных факторов в этих опытах не решается, хотя скорость ответа в виде изменения концентрации грелина в отдельных структурах головного мозга говорит в пользу этого допущения.

Наконец, касательно механизмов возможного влияния феназепама на грелиновую пептидную систему. Бензодиазепины, включая феназепам, который является одним из самых сильных анксиолитиков, проявляют свойства непрямых агонистов тормозной системы γ-аминомасляной кислоты (ГАМК), взаимодействуя с двумя из пяти чувствительных к ним субъединиц ГАМК_А-рецепторов. ГАМК участвует в регуляции пищевого поведения, стрессовых реакций, опосредует поведение зависимости у млекопитающих[16], а с молекулярной точки зрения взаимодействует со многими пептидными системами мозга, например с системой кортиколиберина, орексинов, грелина [3]. Как правило, ГАМК и грелиновая система находятся в антагонистических функциональных отношениях, отсюда понятны полученные результаты по уменьшению уровня грелина под влиянием феназепама, проявляющего свойства непрямого агониста ГАМК. В основе этого феномена, по-видимому, лежит подавление феназепамом экспрессии гена грелина в ответ на стресс, что проявляется снижением уровня пептида в изученных областях мозга рыб Danio rerio.

ВЫВОДЫ

Применение высокочувствительного иммуноферментного анализа позволяет идентифицировать пептид грелин в различных отделах головного мозга Danio rerio.
Состояние психоэмоционального воздействия (экспозиция рыб с хищником) значимо повышает содержание грелина главным образом в переднем и среднем мозге, но не в мозжечке.
Анксиолитик феназепам устраняет последствия стрессорного воздействия хищника на грелиновую систему у Danio rerio.

About the authors