Response of the macrophage pool in rat liver and kidney to the administration of new spirofused heterocyclic compounds

Full Text

Обоснование.

Терапия, направленная на достижение максимальной циторедукции, с высокой вероятностью сопровождается тяжелыми побочными эффектами. В настоящее время продолжается как поиск альтернативных методов лечения онкологических заболеваний, например, таргетная химиотерапия, так и разработка новых химиотерапевтических препаратов. Потребность в новых противоопухолевых препаратах с улучшенным фармакологическим профилем подпитывает массовые исследования в этом направлении. Особый интерес в области синтеза противоопухолевых препаратов вызывают гетероциклические системы, способные выступать в роли перспективных лекарственных препаратов. Это, например, фрагменты азабициклогексана, оксиндола и пирролизина – известные гетероциклические системы и фармакофоры, которые встречаются в природных алкалоидах и их производных с выраженной биологической активностью и интересными структурными свойствами. Повышенное внимание вызывает и моделирование соединений на основе спиросочленённых фармакофорных фрагментов.

В последнее время был разработан метод синтеза спиросочленённых фармакофорных фрагментов, с помощью которого получена принципиально новая группа спироциклических циклоаддуктов с ожидаемым противоопухолевым действием: спиросочленённые барбитураты и оксиндолы [1]. В ходе исследований антипролиферативной активности in vitro был показан их время- и дозо-зависимый эффект, влияние на клеточный цикл, апоптотическую активность, морфологические характеристики клеток и их подвижность [2]. Прежде нами оценивалась нейротоксичность новых спиросочленённых барбитурата и оксиндола по состоянию нейронов и астроцитарной глии гиппокампа крыс. Было отмечено их цитотоксическое влияние на пирамидные нейроны гиппокампа в полях CAIII и CAIV и астроцитарную глию с наиболее выраженным токсическим эффектом спиросочлененного оксиндола [3]. Полученные данные обусловливают необходимость изучения влияния этих соединений на другие органы и клетки, в частности, на печень и почки, так как серьезным побочным эффектом ряда цитостатиков является гепатотоксичность, поскольку именно в печени происходит их биотрансформация, и нефротоксичность, поскольку почки осуществляют выведение из организма ксенобиотиков и их метаболитов [4].

Иммунная система занимает центральное место в осуществлении специфической терапии при опухолевой циторедукции. Важная роль здесь отводится макрофагам (МФ), обусловливающим взаимоотношения клеток опухоли с микроокружением. МФ являются ключевым компонентом печёночной и почечной мононуклеарной фагоцитарной системы, участвующей в иммунном надзоре и регулировании гомеостаза и играющей важную роль в защите от инфекций, повреждений и восстановлении клеток печени и почек [5]. Это вызывает интерес к органным МФ, представляющим собой многофункциональный пластичный клеточный пул, реализующий помимо реакций врожденного иммунитета, процессы цитопротекции и биорезорбции последствий клеточного повреждения, развивающегося в результате токсического воздействия химиотерапевтических субстанций [6]. Согласно современным данным пул МФ представляет собой непрерывный фенотип между крайними значениями М1- и М2- макрофагов, экспрессирующих интегральный трансмембранный белок CD68, участвующий в фагоцитарной активности и работе лизосомального аппарата этих клеток [7]. Маркер CD68, относящейся к семейству скавенджер-рецепторов, широко используется при иммуногистохимическом анализе воспалительных процессов в тканях и опухолях, где показано повышение его экспрессии в МФ при воздействии различными стимулами [8].  

Цель работы – оценить реакцию макрофагального пула в печени и почках крыс на введение новых спиросочлененных гетероциклических соединений.

 

Материалы и методы.

Исследование проведено на 36 самцах крыс стока Wistar соматически здоровых, массой 220–250 г. (Питомник лабораторных животных «Рапполово» НИЦ «Курчатовский институт», Россия), содержавшихся в стандартных условиях вивария конвенциональной категории.

В работе использовались (±)-(1R,4R,5S,6R)-4-(2-(метилтио)этил)-1,5,6-трифенил-1′H-3-азаспиро[бицикло[3.1.0]гексан-2,5′-пиримидин]-2′,4′,6′(3′H)-трион (ЭГ1) и (±)-(1R,2R,4R,5S,6R)-1′-метил-1,4,5,6-тетрафенил-3-азаспиро[бицикло[3.1.0]гексан-2,3′-индолин]-2′-он (ЭГ 2).  

 

Рис. 1. Химическая формула спиросочлененного барбитурата – 1 (ЭГ1) и спиросочлененного оксиндола – 2 (ЭГ2), используемых в настоящем эксперименте.

 

Животные были разделены на 3 группы, по 12 животных в каждой: 1) контрольная  – с введением 1 мл физиологического раствора (К); экспериментальная группа 1– с введением спиросочлененного барбитурата (ЭГI); 3) экспериментальная группа 2 с введением спиросочлененного оксиндола (ЭГII) (рис. 1). Изучаемые препараты из группы 3-азаспиробицикло[3.1.0]гексанов получали в университете им. Ж.И. Алферова РАН. Во всех экспериментальных случаях препараты вводили внутрибрюшинно однократно в дозе 12 мг/кг массы тела животного в объеме 1 мл. Через 2, 4 и 8 нед. после введения препарата проводили эвтаназию животных (по 4 животных в группе) в условиях глубокой общей анестезии с помощью раствора Zoletil 100. При экспериментальных исследованиях руководствовались Приказом Минздрава России от 01.04.2016 г. №199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики» и в соответствии с рекомендациями Этического комитета ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. И.П. Павлова Минздрава России (протокол № ПЖ_21-02#Журавский С.Г.  V3. 18 Сентября, 2023).

        Проводили подсчёт CD68⁺  клеток: клеток Купфера (КК), и макрофагов почек (МФП). Для каждого животного на срезе печени подсчитывали число CD68+ клеток в 10 полях зрения площадью 0,23 мм² каждое поле при окуляре х10, объективе х10 и на срезе почек в 20 полях зрения площадью 0,014 мм² каждое поле при окуляре х10, объективе х40. Визуально оценивали представительство соединительной ткани в паренхиме печени и почек.

Статистическую обработку данных производили с использование ПО IBM SPSS Statistics версия 27.0.1.0. Использовали непараметрический метод: ранговый дисперсионный анализ с учётом факторов введённого раствора, времени от начала эксперимента и их взаимодействия. Влияние фактора считали значимыми при р<0,05. При наличии значимого различия дальнейшее попарное сравнение производили с поправкой на множественную проверку гипотез по методу Шидака. Различия между группами считали значимыми при р<0,05. Данные представлены в виде Me (IQR) – медианы и межквартильного размаха.

Результаты.

Морфологический анализ печени показал, что во всех группах гистоархитектоника сохранена. В группе К гепатоциты с 1 или 2 ядрами с отчётливыми ядрышками, цитоплазма гепатоцитов с базофильной зернистостью. Синусоиды не расширены, малокровные; в их просвете одиночные рассеянные лимфоциты, КК. Портальные тракты типичного строения; вены полнокровные; центральные вены (ЦВ) запустевшие.

В обеих экспериментальных группах вблизи ЦВ отмечается слабо выраженная дискомплексация печеночных балок, состоящих из гепатоцитов с отчетливым ядром, цитоплазма с базофильной зернистостью, в дольке выявляются тонкие прослойки коллагеновых волокон с небольшими скоплениями мононуклеарных клеток,  наблюдается эндотелиит, проявляющийся в виде множественных диффузно распределенных мелких групп мононуклеаров. В перипортальной зоне микронекрозы не отмечаются Иммуноцитохимический анализ показал, что в обеих экспериментальных группах визуально КК более крупные и объемные по сравнению с группой контроля (рис. 2). Морфометрическое исследование пула КК в ЭГI выявило, что на 2 неделе эксперимента их число значимо возрастает до 151% от контрольных значений, продолжает увеличиваться до 200% на 4 неделе эксперимента и к концу эксперимента снижается лишь до 137 %. В ЭГII на 2 неделе эксперимента число КК значимо увеличивается до 145% от числа КК в группе К, продолжает расти до 195% на 4 неделе эксперимента и остается на повышенном уровне к концу эксперимента, составляя 135% (табл. 1).

 

 

Рис.2. Фрагменты печени крыс из группы К (а), ЭГI (б) и ЭГII (в) на 8 неделе эксперимента. Иммуноцитохимическая реакция на белок CD68 с подкрашиванием гематоксилином. Коричневое окрашивание – CD68-иммунопозитивные клетки Купфера. Ув. 100х.

Морфологический анализ почек показал, что во всех группах гистоархитектоника компонентов нефрона сохранена. В группе К эпителий извитых канальцев и собирательных трубочек типичного строения, эпителий извитых канальцев без признаков дистрофии, интерстиций с одиночными рассеянными лимфоцитами. Переходный эпителий лоханки типичного строения, содержит интраэпителиальные одиночные лимфоциты.

В обеих экспериментальных группах клеточность клубочков визуально повышена, объем подоцитов несколько увеличен, их ядро крупное светлое, капилляры клубочков полнокровные, наблюдается эритроцитарный сладж. Эпителий извитых канальцев со слабо выраженными признаками дистрофии, собирательные трубочки типичного строения, переходный эпителий лоханки без особенностей. В интерстиции почек отмечается полнокровие сосудов и незначительная диффузно-очаговая лимфомоноцитарная инфильтрация, более выраженная в ЭГII. Иммуноцитохимическое исследование показало, что в обеих экспериментальных группах МФП визуально более крупные, чем в группе К и число их увеличено в основном в почечных тельцах (рис. 3). Морфометрическое исследование пула МФП показало, что в ЭГI на 2 неделе эксперимента их число значимо возрастает до 200% по сравнению с контролем, данные показатели сохраняются на 4 неделе эксперимента, но на 8 неделе возвращаются к контрольным значениям. В ЭГII на 2 неделе эксперимента число МФП значимо увеличивается до 267% от числа МФП в группе К, на 4 неделе эксперимента сохраняется на уровне 250 % от контрольных значений и остается на повышенном уровне к концу эксперимента, составляя 175%. Отметим, что число МФП на 8 неделе эксперимента в ЭГ II на 175% больше, чем в ЭГI (табл. 1).Эпителий извитых канальцев и собирательных трубочек со слабо выраженной зернистой дистрофией, переходный эпителий лоханки типичного строения. Интерстиций с одиночными рассеянными лимфоцитами.

 

 

Рис.3. Фрагменты почек крыс из группы К (а), ЭГI (б) и ЭГII (в) на 8 неделе эксперимента. Иммуноцитохимическая реакция на белок CD68 с подкрашиванием гематоксилином. Черные стрелки – CD68-иммунопозитивные макрофаги. Ув. 200х.

 

Таблица 1. Динамика числа макрофагов в печени и почках через 2, 4 и 8 недель после однократного введения спиросочлененного барбитурата – ЭГ1 и спиросочлененного оксиндола – ЭГ2.

 

Макрофаги / группа	2 недели			4 недели			8 недель
	К	ЭГI	ЭГII	К	ЭГI	ЭГII	К	ЭГI	ЭГII
Клетки Купфера	53 (8)	80* (12) p*= 0,00001	77* (8) p*= 0,00001	44 (4)	88* (10) p*= 0,00001	86* (7) p*= 0,00001	43 (8)	59* (7) p*= 0,00001	58* (6) p*= 0,00001
Макрофаги в почках	3 (3)	6* (5) p*= 0,00004	8* (4) p*= 0,00001	4 (3)	8* (7) p*= 0,00005	10* (11) p*= 0,00002	4 (2)	4 (2)	7*,** (5) p*= 0,00003 p**= 0,00008

 

* – показатели статистически значимо отличаются от таковых в контрольной группе с вероятностью ошибки р<0,05.

** – показатели статистически значимо отличаются при сравнении двух экспериментальных групп с вероятностью ошибки р<0,05.

 

Обсуждение результатов.

Патоморфологический анализ материала обеих групп не выявил признаков микронекрозов и значимых морфологических признаков нарушения гистоархитектоники структурно-функциональных единиц печени и почек на всех сроках эксперимента. Отмечается незначительная дискомплексация печеночных балок вблизи ЦВ и слабо выраженные признаки дистрофии эпителия извитых канальцев почек. При этом в печени наблюдается клеточная реакция в виде множественных диффузно распределённых скоплений мононуклеаров (эндотелиита) и увеличение числа КК в обеих группах на всех сроках эксперимента. В почках отмечается диффузно-очаговая лимфомоноцитарная инфильтрации интерстиция, повышенная клеточность клубочков нефрона с увеличенным объёмом подоцитов и увеличение числа МФП, преимущественно в клубочках.

В ходе настоящего исследования наблюдалась реакция пула МФ на вводимые препараты в обеих экспериментальных группах на всех сроках эксперимента в виде увеличения числа МФ и изменения их морфологии, как в печени, так и в почках. Это свидетельствует об активации макрофагального пула, которая является ключевым процессом функционального созревания МФ, определяемого сигналами микроокружения.

В нашем эксперименте обнаружено значимое увеличение числа КК в обеих экспериментальных группах на 2 неделе и последующее увеличение их числа на 4 неделе эксперимента, не возвращающееся к контрольным значениям в конце эксперимента на 8 неделе. Этот факт соотносится с имеющимися в литературе сведениями, что при воздействии на печень различных патологических агентов, КК активируются и их количество значительно возрастает [9]. Это, вероятно, указывает на нарушение гомеостаза в печени после введения исследуемых препаратов, что и привело к увеличению числа КК. Отсутствие в изученных микропрепаратах печени некрозов гепатоцитов или их дистрофических изменений свидетельствует об отсутствии прямого токсического поражения этого органа, и возникновению, тем не менее, нарушения гомеостаза и активации КК.

КК способны запускать иммунный ответ, продуцируя провоспалительные цитокины, в частности, фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α) и интерлейкин 1(ИЛ-1). ИЛ-1 и ФНО-α активируют лейкоциты и синусоидальные эндотелиальные клетки, начинающие экспрессировать молекулу межклеточной адгезии 1 (ICAM-1). Это приводит к разрушению эндотелия сосудов печени под действием протеаз, кислородных радикалов и других веществ, синтезируемых лейкоцитами [10]. Обнаруженные при изучении препаратов множественные субэндотелиальные скопления мононуклеаров свидетельствуют в пользу этих литературных данных. В то же время, продуцируя глутатион, КК посредством интерлейкина 6 (ИЛ-6) и макрофагального воспалительного белка 2 (MIP-2) могут защищать гепатоциты от повреждения [11]. Таким образом, вероятно, CD68+ клетки способны нести цитотрофическое воздействие на гепатоциты.

Установлено, что продукция трансформирующего фактора роста β1 (TGFβ1) КК стимулирует звездчатые клетки Ито к дифференцировке в миофибробласты, что в конечном итоге приводит к фиброзу [12]. В ЭГI субэндотелиально у ЦВ были обнаружены тонкие прослойки коллагеновых волокон, что, возможно, свидетельствует о манифестации фибротических изменений в печени животных этой группы.

В почках в условиях воздействия обеих изучаемых фармакологических субстанций нами показано увеличение числа МФП, преимущественно в клубочках, на всех сроках эксперимента кроме 8 недели. На этом сроке эксперимента в ЭГII число МФП значимо больше по сравнению с данным показателем в ЭГI, что свидетельствует о более выраженном токсическом воздействии спиросочлененного оксиндола. Полученные результаты согласуются с нашими данными при исследовании токсичности этих препаратов на гиппокампе крыс [3].

            Согласно литературным источникам МФ очень пластичны и могут изменять свой фенотип в ответ на сигналы от паренхиматозных клеток почек. Реакция МФП на повреждение почек сильно различается в зависимости от характера и продолжительности воздействия [13]. В нашем эксперименте повышенная клеточность почечных клубочков и увеличение числа МФП в них, предположительно свидетельствует о нарушении межклеточных взаимоотношений, приводящих к активации МФ. По литературным данным, дальнейшее пополнение воспалительных клеток и гибель клеток усугубляют повреждение почек, активируют почечные фибробласты и прогрессирование до фиброза почек [14]. Роль МФП неоднозначна и они могут способствовать как восстановлению органа при остром повреждении, так и переходу острого повреждения почек в хроническую болезнь, активизируя фиброобразование [15]. Имеются данные об участии МФП в восстановлении паренхимы почек напрямую или косвенно, способствуя регенерации канальцев, ограничивая апоптоз эпителиальных клеток канальцев, поддерживая пролиферацию эпителиальных клеток и снижая инфильтрацию нейтрофилов [16]. Показано, МФП могут привести к развитию гипертензии, вырабатывая цитокины TNF-α, IL-6 и IL-1β, а также активные формы кислорода (АФК), что приводит к усиленному удержанию натрия почками и повреждению органов [17].

Известно, что органы млекопитающих содержат смешанную популяцию МФ из разных источников происхождения: из эмбриональных предшественников, которые заселяют ткань до рождения и из клеток костного мозга. В тканях с высокой антигенностью, таких как кишечник и дерма, значительный процент резидентных МФ составляют МФ моноцитарного происхождения. В большинстве других тканей, включая печень и почки, резидентные МФ в основном происходят из эмбриональных предшественников, принадлежат преимущественно к М2 морфотипу и могут самообновляться локально [18, 19].

Таким образом, увеличение численности макрофагального пула в печени и почках, описанного нами в условиях воздействия изучаемых фармакологических субстанций, скорее всего, является результатом пролиферации резидентных МФ, хотя полностью нельзя исключить вероятность пополнения макрофагального пула за счёт клеток моноцитарного происхождения. В ответ на воспаление и под воздействием цитокиновой среды и/или взаимодействия с другими клетками моноциты быстро перемещаются в скомпрометированные ткани и затем дифференцируются в несколько специфических фенотипов МФ в зависимости от сигналов микроокружения [20].

Выраженный реактивный макрофагальный ответ может приводить как к полному восстановлению органа, при принятии МФ репаративного фенотипа, так и к дальнейшему повреждению паренхиматозных клеток, при активации провоспалительных цитокинов. Таким образом, изучение морфотипов клеток в увеличенном пуле МФ с целью прогнозирования исхода последствий и возможностью управления пластичностью МФ в условиях воздействия новых препаратов есть задача дальнейших наших исследований.

Заключение.

Морфологический анализ органов системы детоксикации и выведения ксенобиотиков показал, что ни в печени, ни в почках не развиваются значимых дегенеративных изменений при однократном внутрибрюшинном введении экспериментальных препаратов. Отсутствие летальности после однократного введения препаратов показывает на их умеренную органотоксичность, совместимую с выживанием животных. Особенностью ответа является отсутствие некротических реакций в изученных паренхиматозных органах, сопутствующего реактивного асептического воспаления и значимая пролиферация пула резидентных макрофагов.

Клеточная реакция на вводимые соединения идентична, с несколько большим токсическим эффектом спиросочлененного оксиндола. Однако наиболее чувствительным органом оказалась печень. Как в ЭГI, так и в ЭГII, на всех сроках эксперимента наблюдаются реактивные изменения макрофагального пула в ней. Почки также отреагировали на введение обоих препаратов, однако, более значительные изменения в численности МФ наблюдались в ЭГII.

About the authors

Galina Yukina

First Pavlov State Medical University of St.Petersburg, St.Petersburg, Russia

Author for correspondence.
Email: patlab1med@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-8888-4135

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor, Head of the Scientific Laboratory of Pathomorphology of the NCC of Pathomorphology

Russian Federation

Elena Gennadevna Sukhorukova

Email: patlab1med@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5521-7248
Russian Federation

Iliyа Polovnikov

Email: patlab1med@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-8633-8496
Russian Federation

Elena Kryzhanovskaya

Email: patlab1med@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-3791-8256
Russian Federation

Vitali Boitsov

Email: bovitali@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4857-2046

References