Действие аналогов кисспептина на поведение Danio rerio

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Кисспептин — гипоталамический нейропептид, пептидный продукт гена KISS-1 и эндогенный агонист рецептора Kiss1(Kiss-R). Кисспептин, действуя центрально, стимулирует секрецию гонадолиберина (GnRH). Он взаимодействует с другими нейропептидами для генерации GnRH, а также играет определенную роль в регуляции полового поведения [1]. Источником кисспептина служит пептид, состоящий из 145 аминокислот (препрокисспептин), который затем трансформируется в его непосредственный предшественник кисспептина, состоящий из 54 аминокислот. Из кисспептина-54 в дальнейшем синтезируются пептиды кисспептин-14, кисспептин-13 и кисспептин-10 [2]. Нейроны кисспептина присутствуют в гипоталамической области, но их нейронные мишени не ограничиваются только гипоталамусом [3]. Более того, недавние исследования на млекопитающих показали экспрессию Kiss1 в нескольких областях мозга, включая медиальную миндалину [4]. В то же время информация о потенциальной роли экстрагипоталамических Kiss-R остаются ограниченными. У костистых рыб идентифицированы два гомологичных гена (kiss1 и kiss2), кодирующие кисспептин [5]. Ген kiss1 — консервативный ортолог гена Kiss1 млекопитающих, тогда как ген kiss2 был обнаружен в ядрах гипоталамуса только у позвоночных, не являющихся млекопитающими, включая земноводных и костистых рыб [6]. У рыбок Danio rerio мРНК kiss1 и kissr1 преимущественно экспрессируются в вентральной уздечке (vHb) [7]. У позвоночных, не являющихся млекопитающими, дорсальная уздечка (dHb) и vHb гомологичны медиальной (mHb) и латеральной (LHb) уздечке у млекопитающих [8]. LHb у приматов регулирует поведение избегания наказания [9], а у грызунов она контролирует тревогу и страх [10]. Это позволяет предположить, что vHb не млекопитающих, гомологичная LHb млекопитающих, может модулировать реакцию страха. Кроме того, vHb проецирует нейронные волокна Kiss1 на медиальные ядра шва (MR) [7], где располагаются серотонинергические нейроны у Danio rerio [11]. Эти данные указывают на потенциальную роль Kiss1-Kiss-R1 уздечки в модуляции серотонин-зависимых функций, таких как тревога и страх. Роль Kiss1 в управлении тревогой и страхом впервые была показана в исследованиях O. Satoshi и соавт. [12].

Цель. Поскольку ген kiss1 у костистых рыб — консервативный ортолог гена Kiss1 млекопитающих, участвующий в регуляции тревоги и страха, мы сделали предположение о возможном анксиолитическом действии аналогов кисспептина Kiss1 млекопитающих у Danio rerio и сравнили их с веществами серотонинового действия, в частности, антидепрессантами. В настоящем исследовании для изучения тревоги и страха мы использовали тест новизны, описанный в наших предыдущих публикациях [13, 14].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выбор животных. В работе использованы 138 половозрелых рыб Danio rerio (zebrafish) в возрасте 6–8 мес. (молодые половозрелые животные, жизненный цикл до 5 лет) фирмы «Аква Питер», выращенные в ФГБНУ «ИЭМ» — Danio rerio, дикий тип (wild type). Для тестирования использовали интактных животных после двухнедельного периода адаптации к помещению и аквариумам водоизмещением 40 л по 20–30 животных в каждом. Температуру воды 25–27 °C поддерживали постоянно. Животных содержали в стандартных условиях светового режима (8:00–20:00) при температуре помещения 22 ± 2 °C, кормили дважды в день стандартным кормом «Tetramin tropical flakes».

Тест стресса новизны. Для экспериментов оценки новизны применяли стандартный просмотровый аквариум, используемый для изучения тревожно-фобических реакций у Danio rerio [15, 16]. Он имел водоизмещение 1,5 л, трапециевидную форму, высоту 15 см и ширину 7 см. Длина аквариума в основании составляла 22 см, в верхней части — 28 см. Такая конструкция позволяет минимизировать латеральные движения рыбки и свободно наблюдать за вертикальными и горизонтальными движениями. Поскольку данный поведенческий тест основывается главным образом на инстинкте поиска защиты от незнакомой обстановки погружением на дно [17, 18], аквариум был разделен чертой на две равные части — верхнюю и нижнюю. Рыбка помещалась сначала в мерный стакан водоизмещением 200 мл с растворенным фармакологическим веществом (или водой) на 5 мин, затем в предстартовый аквариум с водой (10 × 10 × 10 см) на 5 мин и далее в просмотровый аквариум на 6 мин, где регистрировали двигательную активность за опыт (длина трека рыбки), число переходов в верхнюю и нижнюю половины аквариума и время нахождения в них. Автоматически регистрировали число и время паттернов «фризинг» (обездвиживание или «примерзание») за опыт, которые обычно наблюдаются при стрессе новизны и отражают уровень тревожности животного [19]. Поведение регистрировали автоматически с помощью системы NoldusEthoVision XT7, которая позволяет просмотреть видеотреки рыбки. Система дает возможность как снимать показания в цифровом выражении, так и визуально контролировать видеотрек. Весь период наблюдения непрерывно регистрировался, при помощи программы шла запись траектории движения (см. рисунок).

 

Рисунок. Примеры поведенческих ответов Danio rerio на введение антидепрессантов и аналогов кисспептина: a — контроль (интактные); b — кломипрамин в дозе 0,5 мг на 1 л воды; с — KS1 0,1 мг на 1 л воды

 

Фармакологические вещества. Для фармакологического анализа использовали аналоги кисспептина Kiss1 млекопитающих Сloud Clone (США): KS1, KS2 и KS3 — короткопептидные аналоги нативного кисспептина-54, структурный профиль которых состоял из 9–14 аминокислотных остатков, начиная от С-концевой амидной группы пептида. Пептиды были модифицированы в N-концевой части молекулы в позиции 9 (KS1), 11 (KS2) и 13 (KS3) с заменой на другие аминокислоты (Glu, Asp), для улучшения их физико-химических свойств при хранении в виде раствора и повышения биологической активности и биодоступности в организме. Аналоги кисспептина растворяли в воде для аквариумов и применяли в трех дозах: 1) 0,01 мг на 1 л воды; 2) 0,1 мг на 1 л воды; 3) 1 мг на 1 л воды. Кломипрамин в двух дозах: 1) 0,5 мг на 1 л воды; 2) 1 мг на 1 л воды. Пароксетин в двух дозах: 1) 0,5 мг на 1 л воды; 2) 1 мг на 1 л воды. Тразодон 150 мг в двух дозах: 1) 0,5 мг на 1 л воды; 2) 1 мг на 1 л воды.

Статистические методы анализа. Статистическую достоверность различий оценивали при помощи пакета программ GraphPad Prism 8.4. с использованием однофакторного дисперсионного анализа. Для сравнения контрольной и экспериментальных групп использовали однофакторный дисперсионный анализ ANOVA. Полученные результаты по анализу биологического материала определяли по t-критерию Стьюдента. Из непараметрических критериев использовали критерий Дагостино – Пирсон для сравнения групп. Различия считали статистически значимыми при значении р < 0,05. Для представления полученных данных использовали такие показатели описательной статистики, как среднеарифметическое значение и ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

На фоне введения антидепрессантов разных групп были выявлены аналогичные анксиолитикам поведенческие реакции на новизну, то есть на помещение животного в просмотровый аквариум. Практически во всех группах рыбы находились бóльшую часть времени в верхней части аквариума (р < 0,01). На фоне действия антидепрессантов средняя длина пути рыбы существенно не менялась в диапазоне использованных доз по сравнению с контрольной группой животных, за исключением группы тразодона и пароксетина (табл. 1). При этом в той же степени, как и в контроле, наблюдался фризинг. Число перемещений рыбы в верхнюю часть тестового аквариума за опыт достоверно увеличивалось по сравнению с контрольной группой животных (р < 0,05).

 

Таблица 1. Действие антидепрессантов в тесте новизны
Группа	Число фризингов	Время фризинга, с	Длина траектории, см	Время в нижней части аквариума, с	Число перемещений в верхнюю часть аквариума
Контроль	58,6 ± 7,2	29,3 ± 3,5	743 ± 57,2	309,4 ± 22,3	21,8 ± 3
Кломипрамин
0,5 мг	40,4 ± 4,3	20,2 ± 2,2	928,4 ± 47,2	24,7 ± 3,2	7,4 ± 0,6*
1 мг	52,4 ± 5,7	26,2 ± 2,8	729,6 ± 41,8	64,5 ± 7,9	19,8 ± 1,2
Тразодон
0,5 мг	37,8 ± 3,5*	18,8 ± 1,7*	1229,6 ± 58,3*	94,2 ± 23,3	45,4 ± 2,6*
1 мг	69,2 ± 4,7	34,6 ± 2,4	730 ± 38	73,5 ± 25	18,4 ± 1,5
Пароксетин
0,5 мг	27,4 ± 2,6*	13,7 ± 1,3*	1162,2 ± 50,3*	229,5 ± 17,3*	56 ± 2,7*
1 мг	14,6 ± 1,1*	7,3 ± 0,5*	1506 ± 81,9*	176,6 ± 24,2*	60 ± 5,4*
*p < 0,05 относительно контрольной группы.

 

На фоне действия аналогов кисспетина Kiss1 средняя длина пути рыбы, в отличие от эффектов антидепрессантов, не увеличивалась по сравнению с контрольной группой животных (табл. 2). При этом так же, как и в контроле и при действии антидепрессантов, наблюдали неизменное число и длительность фризинга. Число перемещений рыбы в верхнюю часть тестового аквариума за опыт на фоне кисспептинов достоверно увеличивалось по сравнению с контрольной группой животных, что сходно с эффектами действия антидепрессантов (р < 0,05). Время нахождения рыбы в нижней части тестового аквариума за опыт достоверно увеличивалось у KS1 0,1 мг и KS2 0,1 мг по сравнению с контрольной группой животных (р < 0,05). В то же время эффект был ниже, чем после действия антидепрессантов.

 

Таблица 2. Действие аналогов кисспептина в тесте новизны
Группа	Число фризингов	Время фризинга, с	Длина траектории, см	Время в нижней части аквариума, с	Число перемещений в верхнюю часть аквариума
Контроль	78,4 ± 7,8	34,6 ± 5,1	1307 ± 87,9	319 ± 21,3	18 ± 4,4
KS1
0,01 мг	90,5 ± 9,3	45,25 ± 3,6	1056,55 ± 62,5	277,96 ± 35,3	31,25 ± 4,6
0,1 мг	90,5 ± 10,6	45,25 ± 4,7	1107,45 ± 73,3	226,96 ± 44,3*	36,25 ± 5,3*
1 мг	90,5 ± 9,6	45,25 ± 3,2	1118,33 ± 56,4	242,96 ± 21,3	42,25 ± 4,9*
KS2
0,01 мг	85,37 ± 8,1	42,68 ± 1,3	1279,71 ± 44,1	276,2 ± 17,3	39,5 ± 6,1*
0,1 мг	91,87 ±7,9	45,93 ± 3,5	1080,58 ± 87,9	220,41 ± 37,3*	38 ± 7,3*
1 мг	95 ± 8,3	47,57 ± 3,8	1214,48 ± 35,0	275,98 ± 16,3	25,87 ± 5,1
KS3
0,01 мг	89,37 ± 9,4	44,68 ± 5,1	1097,06 ± 72,3	313,48 ± 35,3	19,62 ± 4,8
0,01 мг	78,12 ± 10,2	41, 33 ± 4,5	1114,25 ± 85,6	281,01 ± 11,3	29,75 ± 3,7
1 мг	83,5 ± 9,7	41,75 ± 2,9	1179,25 ± 63,2	282,16± 24,3	30 ± 3,3
*p < 0,05 относительно контрольной группы. Примечание. KS1, KS2 и KS3 — короткопептидные аналоги нативного кисспептина-54.

 

Таким образом, можно заключить, что аналоги кисспептина проявляют сходные по направленности реакции по сравнению с антидепрессантами серотонинового типа действия. В то же время анксиолитические эффекты аналогов кисспептина оказались ниже, чем у антидепрессантов. При изучении поведения рыб на фоне действия KS3 достоверных различий с группой контроля отмечено не было. Явного дозозависимого эффекта при действии аналогов кисспептина также отмечено не было. В то же время необходимо отметить, что наиболее эффективная доза для действия изученных аналогов кисспептина соответствовала 0,1 мг на 1 л воды. Типичная картина действия аналога кисспептина и антидепрессанта серотонинового типа представлена на рис. 1, b, с.

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

Таким образом, наши исследования показали, что реакция на новизну помещения в новый аквариум у Danio rerio на фоне введения антидепрессантов серотонинового типа действия вызывает типичную картину поведенческих актов. При этом время нахождения рыбки в верхней части аквариума достоверно увеличивалось. Длина траектории рыбы после введения антидепрессантов серотонинового типа действия увеличивалась на фоне тразодона и пароксетина. Число и время паттерна «фризинг» после применения антидепрессантов достоверно уменьшались по сравнению с контролем, при этом наблюдали дозозависимый эффект. Время в нижней части аквариума на фоне антидепрессантов существенно снижалось. Число перемещений рыбы в верхнюю часть просмотрового аквариума после введения антидепрессантов достоверно увеличивалось по сравнению с контрольной группой животных. Необходимо отметить, что анксиолитические эффекты аналогов кисспептина млекопитающих, определяемые по снижению времени в нижней половине аквариума и увеличению числа переходов в верхнюю часть аквариума, оказались не такими высокими по сравнению с поведенческими эффектами, которые наблюдали после введения антидепрессантов. Наиболее эффективная доза для действия изученных аналогов кисспептина соответствовала 0,1 мг на 1 л воды.

Полученные данные во многом согласуются с данными литературы. Необходимо отметить, что тестирование антидепрессантов традиционно применяется в ряде лабораторий для исследования противотревожного эффекта у Danio rerio с регистрацией типичной картины поведенческих реакций [20]. Показано, что через 4 ч после внутричерепного введения Kiss1 (10^–11 моль на рыбу) наблюдалось увеличение числа перемещений из нижней половины аквариума в верхнюю его часть и повышение уровня мРНК гена slc6a4a, связанного с обменом серотонина. В противоположность этому, введение Kiss2 (10^–11 моль на рыбу) не оказывало влияния на показатели тревожности в тесте новизны. Увеличение числа перемещений указывает на то, что введение Kiss1 стимулировало исследовательское поведение [21]. На фоне действия аналогов кисспептина млекопитающих в настоящем исследовании так же наблюдали подобный эффект.

Через 1 ч после внутримозгового введения Kiss1 значительно повышалась экспрессия мРНК c-fos, в основном в vHb [12]. Через 6 ч после внутримозгового введения Kiss1 исследовали реакцию страха, вызванную раствором, выдержанным с трупом рыбки. У рыб, которым при этом вводили Kiss1, поведенческие параметры реакции страха, такие как число беспорядочных движений и число паттернов «фризинг» (замирание, рыбка без движения), были значительно снижены в дозах от 10^–15 до 10^–9 моль на рыбу по сравнению с контрольной группой рыб, которым вводили дистиллированную воду [12]. Известно, что беспорядочные движения и фризинг — это типичная характеристика реакции страха у рыбок Danio rerio [22].

На основании результатов настоящих исследований и анализа литературных данных можно предположить потенциальную роль гена kiss1 в модуляции реакции страха у рыбок Danio rerio. Страх считается самой примитивной из эмоций и проявляется на ранних этапах жизни во всех классах позвоночных как адекватная реакция на угрожающие обстановочные сигналы среды [23]. Следовательно, нейронные механизмы, лежащие в основе страха, высоко консервативны у разных видов в ряду позвоночных. Поскольку ген kiss1 у костистых рыб является консервативным ортологом гена KISS1/Kiss1 млекопитающих и участвует в регуляции тревоги и страха, мы предположили возможное анксиолитическое действие кисспептинов млекопитающих у Danio rerio и сравнили их с веществами серотонинового типа действия, в частности, антидепрессантами. Показано, что введение Kiss1 увеличивает уровень мРНК генов pet1 и slc6a4a, связанных с обменом серотонина, у рыб, подвергшихся воздействию раствора, выдержанного с трупом рыбки. Это предполагает потенциальную роль Kiss1 в регуляции системы серотонина мозга [7]. Показано, что серотонин участвует в развитии страха и депрессивного поведения [24]. LHb млекопитающих играет ключевую роль в поведении избегания, влияя на активность нейронов серотонина [25]. Эти результаты подтверждают потенциальную роль Kiss1 в регуляции серотонин-зависимого поведения. В связи с этим была высказана гипотеза, что серотонинергические нейроны модулируются Kiss1-нейронами уздечки через несеротонинергические интернейроны в ядрах шва [7]. Это согласуется с антидепрессантными эффектами кисспептина-13 у грызунов [26]. В то же время показано, что экспрессия генов, связанных с серотонином, после введения Kiss1 у Danio rerio, была намного выше уровня, наблюдаемого после действия раствора, выдержанного с трупом рыбки. Это может говорить о том, что действие кисспептина, в частности, его анксиолитический эффект, в данном случае может частично происходить за счет взаимодействия с другими нейрохимическими системами, например адренергическими и холинергическими нейронами [27]. На это указывают и наши данные при сравнении действия аналогов кисспептина Kiss1 млекопитающих и антидепрессантов серотонинового типа действия. Эффекты аналогов кисспептина Kiss1 млекопитающих, по нашим исследованиям, оказались менее значимыми, что может быть следствием опосредованного действия на систему серотонина.

У млекопитающих медиальные ядра шва проецируются в гиппокамп и миндалину и регулируют ответ на обстановочные сигналы страха [28]. Поскольку рыбы также обладают способностью реагировать на обстановочные сигналы страха [29], целесообразно предположить аналогичные механизмы поведения у рыб Danio rerio. В то же время такие структуры переднего мозга, как гиппокамп и миндалевидный комплекс, у рыб четко не выявляются. Наличие Kiss-R в уздечке рыб и млекопитающих [3] предполагает, что роль передачи сигналов кисспептина может быть эволюционно сохранена у позвоночных. У крыс медиальное ядро миндалины анализирует химические стимулы водной среды и проецируется на гипоталамус и центральное серое вещество, которое модулирует страх, вызванный запахом хищника [30], возможно, через уздечку [31]. По мере развития переднего мозга у млекопитающих, в частности, коры больших полушарий и гиппокампа, в ходе эволюции развивались также и более древние подкорковые связи и структуры, обеспечивающие реакцию страха врожденного узнавания, чтобы подготовить и отреагировать на стимулы, потенциально опасные для жизни. Поскольку гипоталамус и миндалина экспрессируют кисспептин Kiss1 и Kiss-R [3], возможно, что передача сигналов кисспептина на Kiss-R может участвовать в ответной реакции на обстановочные сигналы страха у млекопитающих [32].

Таким образом, кисспептин, эволюционно консервативный нейропептид, может участвовать в регуляции тревожно-фобических состояний для поддержания эмоциональных аспектов репродуктивного поведения, таких как половая мотивация и возбуждение. Известно, что страх — сильный стрессор, ухудшающий репродуктивную функцию [33]. Наши данные об анксиолитическом действии аналогов кисспептина млекопитающих у Danio rerio подтверждают потенциальную роль Kiss1 в модуляции серотонин-зависимого поведения.

ВЫВОДЫ

1. Аналоги кисспептина Kiss1 млекопитающих снижают тревожно-фобические реакции на новизну у Danio rerio. В то же время эффекты исследуемых аналогов кисспептина ниже, чем у антидепрессантов.
2. Данные об однонаправленных эффектах аналогов кисспептина Kiss1 млекопитающих и антидепрессантов серотонинового типа действия подтверждают потенциальную роль кисспептина в модуляции 5-HT-зависимого поведения у Danio rerio.
3. Результаты исследований подтверждают гипотезу, что кисспептин может участвовать в регуляции тревожно-фобических состояний, по-видимому, для поддержания эмоциональных аспектов репродуктивного поведения, таких как половая мотивация и возбуждение.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: А.А. Лебедев, А.А. Блаженко, В.А. Гольц, А.С. Девяшин, В.А. Лебедев, С.В. Казаков, П.П. Хохлов, Е.Р. Бычков — анализ данных и написание статьи; А.А. Байрамов, П.Д. Шабанов — разработка общей концепции и рецензирование статьи.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Источник финансирования. Авторы заявляют об отсутствии внешнего финансирования при проведении исследования.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contribution. Thereby, all authors made a substantial contribution to the conception of the work, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the work, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the work. Contribution of each author: A.A. Lebedev, A.A. Blazhenko, V.A. Golts, A.S. Devyashin, V.A. Lebedev, S.V. Kazakov, P.P. Khokhlov, E.R. Bychkov — manuscript drafting, pilot data analyses and writing; A.A. Bayramov, P.D. Shabanov — general concept discussion and paper reconceptualization.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Funding source. This study was not supported by any external sources of funding.

Об авторах

Андрей Андреевич Лебедев

Институт экспериментальной медицины

Автор, ответственный за переписку.
Email: aalebedev-iem@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-0297-0425
SPIN-код: 4998-5204

д-р биол. наук, профессор, заведующий лабораторией

Россия, Санкт-Петербург

Александра Александровна Блаженко

Институт экспериментальной медицины

Email: alexandrablazhenko@gmail.com
SPIN-код: 8762-3604

мл. научн. сотр.

Россия, Санкт-Петербург

Владанка Александровна Гольц

Институт экспериментальной медицины

Email: alexandrablazhenko@gmail.com

аспирант

Россия, Санкт-Петербург

Александр Сергеевич Девяшин

Институт экспериментальной медицины

Email: alexsanta93@mail.ru
SPIN-код: 5799-5470

аспирант

Россия, Санкт-Петербург

Виктор Андреевич Лебедев

Институт экспериментальной медицины

Email: vitya-lebedev-57@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1525-8106
SPIN-код: 1878-8392

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург

Сергей Владимирович Казаков

Институт экспериментальной медицины

Email: svkazakov@mail.ru

аспирант

Россия, Санкт-Петербург

Алекбер Азизович Байрамов

Институт экспериментальной медицины; Национальный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова

Email: alekber@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-0673-8722
SPIN-код: 9802-9988

д-р мед. наук, вед. научн. сотр.

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Платон Платонович Хохлов

Институт экспериментальной медицины

Email: platonkh@list.ru
ORCID iD: 0000-0001-6553-9267
SPIN-код: 8673-7417

канд, биол. наук, ст. научн. сотр.

Россия, Санкт-Петербург

Евгений Рудольфович Бычков

Институт экспериментальной медицины

Email: bychkov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8911-6805
SPIN-код: 9408-0799

канд. мед. наук, заведующий лабораторией

Россия, Санкт-Петербург

Петр Дмитриевич Шабанов

Институт экспериментальной медицины

Email: pdshabanov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-1464-1127
SPIN-код: 8974-7477

д-р мед. наук, профессор, заведующий отделом

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы