Влияние локального и системного введения L-тироксина на скорость регенерации и секрецию цитокинов на модели экспериментальной ожоговой раны

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Тиреоидные гормоны (ТГ) — одни из ключевых регуляторов клеточных процессов, в том числе клеточной пролиферации и дифференцировки, клеточного метаболизма, при этом реализация данных механизмов осуществляется через геномные и негеномные механизмы [1]. Стимуляция ядерных рецепторов приводит к изменению профилей экспрессии более 100 генов, из которых более половины является тканеспецифичными [2]. Негеномные механизмы реализуются через стимуляцию L-тироксином (Т4), в меньшей степени, через прямой (Т3) и реверсивный (rТ3) трийодтиронин, специфические сайты связывания, расположенные на интегрине αvβ3 (CD51/CD61), что приводит в дозозависимой манере к активации сигнальных путей митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) с включением сигнального пути RAS/RAF/MEK/ERK, а также фосфатидилинозитол-3-киназами (PI3K) и серин/треониновой протеинкиназы (STK) [3]. Если для злокачественных новообразований избыточные концентрации ТГ приводят к опухолевой прогрессии за счет негеномно реализуемых эффектов, активизирующих клеточную пролиферацию, ангиогенез и инициацию иммуномодулирующих эффектов, связанных с изменением секреции про- и противовоспалительных цитокинов [4, 5], то роль ТГ в регенерации и пролиферации как неизмененных, так и поврежденных тканей не достаточно изучена [6]. Совокупность накопленных теоретических данных о внутриклеточных и тканевых эффектах йодотиронинов делает возможным их потенциальное применение в качестве универсальных регуляторов клеточной пролиферации и ангиогенеза для лечения ран кожи различной этиологии [7]. Однако данные о применении гормонов щитовидной железы находятся на этапе накопления научных знаний, в частности, данный тезис касается топического применения йодотиронинов.

Цель работы — исследовать системное и топическое влияние L-тироксина на течение раневого процесса на экспериментальной модели глубоких ожоговых ран.

МЕТОДЫ

Общий дизайн экспериментального исследования

Выполнены экспериментальные наблюдения, оценивающие влияние лекарственно измененного тиреоидного статуса и топического влияния L-тироксина на течение раневого процесса в эксперименте. Эксперимент проводили на белых нелинейных крысах-самцах массой 184–246 г (n=65), полученных из ФГУП «Питомник лабораторных животных “Рапполово”» (Ленинградская область, Россия). После получения из питомника крыс содержали в условиях карантина, длительность которого составила не менее 14 сут. В течение карантина проводили осмотр каждого животного (поведение и общее состояние) дважды в день (в утренние и вечерние часы). Лабораторные животные с подозрением на любое заболевание и/или имеющие изменения в поведении исключались из исследования в течение карантина.

Содержание животных, формирование опытных групп и рандоминизация

Лабораторных животных (n=74) содержали в стандартных условиях вивария в 4-местных клетках, где каждое животное было отделено от других особей перфорированной перегородкой, что обеспечивало коммуникации между экспериментальными животными и уменьшало стресс изоляции. Каждое лабораторное животное имело доступ к воде и пище ad libidum. После нанесения экспериментального ожога крысы были разделены с помощью генератора случайных чисел на 5 экспериментальных групп в соотношении 1,8:1,0 по основным и группам сравнения соответственно. Животным Ia группы индуцирован cистемный гипертиреоз, Ib группа (локальный гипертиреоз) получала аппликации тироксин-содержащим гелем, на II группе лабораторных животных воспроизведена модель cистемного пропилтиоурацилового гипотиреоза путем замены воды в поилке на раствор 0,1% пропилтиоурацила (ПТУ), животные IIIa группы служили положительным контролем и получали аппликации мазью диоксометилтетрагидропиримидин + хлорамфеникол, IIIb группа служила интактным контролем (табл. 1).

 

Таблица 1. Характеристика исследуемых групп лабораторных животных
Группа №	Название группы	Количество лабораторных животных	Описание группы	Описание метода	Кратность введение
Ia	Системный гипертиреоз	18	Индукция медикаментозного гипертиреоза средней степени тяжести	Внутрибрюшинное введение препарата в дозе 100 мкг / 100 г массы животного	1 раз в сутки
Ib	Локальный гипертиреоз	18	Создание повышенных концентраций левотироксина в области раны	Аппликация 1 мл геля с левотироксином в концентрации 10 мкг/мл	1 раз в сутки на раневую поверхность
II	Системный гипотиреоз	18	Индукция лекарственного гипертиреоза средней степени	Замена воды в поилке на раствор 0,1 % пропилтиоурацила	ad libidum
IIIa	Положительный контроль	10	Местное лечение раны стандартным препаратом	Аппликация раны 1,0 г мазью диоксометилтетрагидропиримидин + + хлорамфеникол	1 раз в стуки
IIIb	Интактный контроль	10	Ведение раны открытым способом без применения лекарственных средств	–	–

 

Фармакологические субстанции

В исследовании использовали субстанции левотироксина и ПТУ (табл. 2), при этом раствор тироксина вводили внутрибрюшинно после ежедневного взвешивания лабораторного животного. Гидрогель с тироксином изготавливали путем перемешивания раствора тироксина с натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) до концентрации 10 мкг/мл. Группа положительного контроля получала аппликации мазью диоксометилтетрагидропиримидин + хлорамфеникол. Для чистоты эксперимента и создания одинакового стрессового воздействия все группы лабораторных животных кроме системного гипертиреоза получали ежедневные инъекции с 0,2 мл 0,9 % раствора натрия хлорида.

 

Таблица 2. Фармакологические субстанции, используемые в исследовании
Наименование субстанции	Химическое название	Фирма-производитель	Страна-производитель
L-тироксин (левотироксин натрия)	2-Амино-3-[4-(4-гидрокси- 3,5-дийодфенокси)-3,5-дийодфенил] пропионовая кислота	РУП «Белмедпрепараты»	Республика Беларусь
Пропилтиоурацил	2,3-Дигидро-6-пропил-2-тиоксо-4(1Н)-пиримидинон	Wuhan Hezhong Bio-Chemical Manufacture Co., Ltd	КНР

 

Моделирование термического ожога

Термический ожог наносили по ранее описанной методике [8] в области проксимальной части спины, чтобы лабораторные животные не имели возможности контакта мордой и лапами с раневой поверхностью. За 4 дня до нанесения раны в этой области выстригали шерсть и проводили депиляцию предназначенным для этого кремом в течение 15 мин. По истечении указанного времени крем с шерстью удаляли с поверхности кожи, кожу промывали теплой водой, промокали бумажным полотенцем и давали обсохнуть. Подготовку области ожоговой травмы завершали нанесением на кожу метки для обозначения центра будущего места приложения термоаппликатора. Процедуру ожога кожи крысам выполняли под общей анестезией препаратами тилетамин+золазепам в сочетании с 0,01 % раствором клонидина в соотношении 2:1 после наступления фазы глубокого сна у животных. В качестве инструмента для нанесения термического ожога крысам использовали цилиндрический стальной аппликатор массой 835 г с плоской рабочей частью в форме круга диаметром 20 мм, что обеспечивало площадь раневой поверхности 100π, то есть 314±5 мм². Нагрев аппликатора до постоянной температуры перед воздействием на животное проводили путем полного погружения в кипящую воду (температура 98–100°C) на 2 мин. Продолжительность времени аппликации с кожей лабораторного животного составляла 30 с. По истечении указанного времени аппликатор удаляли. Через 72 ч после нанесения ожога рану освобождали от струпа полным его иссечением по границе с неповрежденной кожей. После иссечения струпа кожу вокруг раны прошивали хирургической нитью с оставлением концов нити свободными. Внутрь (по периметру) раневого дефекта устанавливали шину в форме кольца высотой 4 мм, внутренним диаметром 25 мм, наружным диаметром 26,5 мм, которую фиксировали путем пришивания шовным материалом. Шинирующее кольцо сверху закрывали пластырной наклейкой, которую фиксировали по краям кольца, что позволяло минимизировать контаминацию и снизить потерю препарата при местном нанесении. Наложение шины предупреждало эффект контракции раны и сохранение ее постоянного размера для лучшей объективной оценки исследуемого и сравниваемого препарата.

Наблюдение за лабораторными животными

Для объективизации данных на всех основных этапах эксперимента проводили фотофиксацию состояния ран с использованием масштабной линейки для последующего расчета их площади. Для определения площади ран использовали программу Universal Desktop Ruler, позволяющую определять геометрические параметры раны по фотографии, с предварительной калибровкой точности измерения по отраженной на фотографии масштабной линейке. В качестве критериев полного заживления раны в данном эксперименте служила динамика эпителизации поверхности раны.

Иммуноферментный анализ

Для исследования резорбции и тиреоидного статуса при системном лекарственно индуцируемом измененном тиреоидном статусе и использовании гидрогелей с йодотиронинами исследовали уровни тиреотропного гормона (ТТГ) в сыворотке крови, для чего забор крови проводили во время декапитации. Использовали тест-систему «Вектор-Бест» (АО «Вектор-Бест», Россия). Определение уровней интерферона гамма (ИНФ-γ), дефензина альфа 1 (DEFa1), трансформирующего фактора роста β-1 (TGFβ1), фактора роста фибробластов 2 (FGF2) в раневом отделяемом выполняли с использованием метода ELISA (иммуноферментный анализ) с помощью реактивов фирмы Cloud-Clone Corporation (США) согласно инструкции. Забор материала производили на 10-е сутки после нанесения раны методом абсорбции раневого отделяемого с помощью стерильных бумажных штифтов, которые накладывали на рану на 60 с, после чего пробы помещали в стерильные пробирки с 0,9% раствором натрия хлорида на 45 мин. Определение выполняли на многофункциональном планшетном анализаторе Victor X5 (PerkinElmer Inc., США).

Этические правила и нормы

Работа проведена в соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006).

Статистическая обработка

Анализ данных проводили в программе Statistica for Windows (США), версия 10.0, используя общепринятые методы описательной статистики с учетом статистики малых групп. Данные представленны в виде среднего значения с оценкой стандартной ошибки среднего (SE) и стандартного отклонения (SD), медианы признака (Me) с определением верхнего и нижнего квартилей [Q₁; Q₃], при этом определяли вариант распределения признака в группе: нормальное и отличное от нормального. Распределение признака в группах определяли на основании критерия Андерсона–Дарлинга. С учетом особенностей распределения признака в каждом эксперименте группы сравнивали по U-критерию Манна–Уитни. Для сравнения динамики эпителизации ран лабораторных животных использовали метод Каплана– Мейера, при этом при построении кривой в каждой конкретной временной точке демонстрировался средний уровень оставшейся раневой поверхности в данный период времени — от 100% в день начала эксперимента до 0% при полной эпителизации, при этом рассчитывали медиану времени до 25, 50 и 75% эпителизации с определением стандартной ошибки по формуле Гринвуда, анализ динамики эпителизации в зависимости от распределения признака проводили по тесту Мантела–Кокса (Log-ranktest) или тесту Гехана–Бреслоу–Вилкоксона. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Установлено, что индукция гипертиреоидного состояния и/или аппликация водорастворимого геля с левотироксином (табл. 3) приводило к статистически значимому ускорению времени эпителизации. С другой стороны, медикаментозно индуцированный гипотиреоз приводил к значимому замедлению времени эпителизации.

При измерении динамики эпителизации ожоговых ран было установлено, что медианы времени 50 % эпителизации раны в группах, которые получали системное или локальное введение йодотионинов, составили 20 [19; 21, 5] и 21 [18; 22] дней и статистически значимо отличались от интактного контроля. Время 75% эпителизации значимо отличалось во всех экспериментальных группах как от группы интактного контроля, так и от группы сравнения, при этом если в Ia и Ib группах время 75% эпителизации составила 29,5 [28; 32] и 30,2±0,9 дней, то в группе индуцированного гипотиреоза время 75% эпителизации не достигнуто (табл. 3).

 

Таблица 3. Динамика эпителизации ран в течение эксперимента (Me [Q1; Q3])
Интегральные показатели заживления ран	Группы лабораторных животных
	гипертиреоз		системный гипотиреоз (II группа)	группы сравнения
	Ia группа	Ib группа		IIIa группа	IIIb группа
Время 25% эпителизации ран, сут	10,0 [9, 5; 11, 0]	12,9±0,3	15,0 [13, 0; 16, 5]	13,2±0,4	14,6±0,3
Время 50% эпителизации ран, сут	20,0 [19, 0; 21, 5]*	21,0 [18, 0; 22, 0]*	29,5 [26, 0; 32, 5]	23,5±0,6*	28,1±0,7
Время 75% эпителизации ран, сут	29,5 [28, 0; 32, 0]**	30,2±0,9**	не достигнуто**	32,5 [29, 0; 35, 0]*	36,0 [34, 0; 37, 0]
Примечание. *Статистически значимое отличие от интактного контроля; ** от стандарта лечения (IIIa группы).

 

При исследовании тиреоидного статуса по уровню ТТГ и Т4 полученные данные точно отражали системный гипо- и гипертиреоз в соответствии с современными представлениями о гормональной регуляции, при этом уровни ТТГ и Т4 в крови лабораторных животных при топической аппликации тироксин-содержащих гелей соответствовала условному эутиреозу и значимо не отличалась от уровня тиреоидных гормонов в IIIa и IIIb группах (табл. 4).

 

Таблица 4. Уровни тиреоидных гормонов в последний день эксперимента
Исследуемые гормоны		Группы лабораторных животных
		гипертиреоз		системный гипотиреоз (II группа)	контроль
		Ia группа	Ib группа		IIIa группа	IIIb группа
ТТГ, мМЕ/л	среднее	0,33±0,07^	1,53±0,13^	6,09±0,6	1,67±0,29^	1,74±0,2
	Me [Q1; Q3]	0,27 [0, 14; 0, 34]	1,39 [1, 13; 1, 72]**,##	5,82 [4, 16; 6, 92]*,**,#,##	1,37 [1, 13; 1, 84]	1,58 [1, 32; 2, 12]
Т4, нмоль/л	среднее	97,98±2,86	75,19±2,51	56,19±2,99	77,64±0,2,81	74,88±2,77
	Me [Q1; Q3]	98,15 [87, 58; 108, 83]*,**,#,##	81,93 [87, 58; 108, 83]**,##	64,26 [49, 05; 64, 26]*,**,#,##	79,24 [69, 45; 86, 5]	75,92 [66, 84; 82, 8]
Примечание. ^Нормальное распределение признака; *статистически значимое отличие от группы Ib; **от группы IIIa; #от интактного контроля, ##от системного гипотиреоза (группа IIa).

 

Уровни всех исследуемых цитокинов и DEFa1 в раневом отделяемом на 10-е сутки эксперимента были статистически значимо повышены в группе системного гипертиреоза в сравнении с обеими контрольными группами. В то же время при локальном применении тироксин-содержащего геля в концентрации 10 мкг/мл статистически значимое повышение уровней было установлено только для FGF2 и ИНФ-γ. В группе ПТУ-индуцированного гипотиреоза, напротив, уровни FGF2 и ИНФ-γ демонстрировали статистически значимое снижение в сравнении с контрольными группами, что косвенно подчеркивает дозозависимые эффекты йодотиронинов в регуляции экспрессии FGF2 и ИНФ-γ (табл. 5).

 

Таблица 5. Уровни исследуемых цитокинов и дефензина альфа 1 у лабораторных животных
Исследуемые цитокины, пг/мл		Группы лабораторных животных
		гипертиреоз		системный гипотиреоз (II группа)	контроль
		Ia группа	Ib группа		IIIa группа	IIIb группа
FGF2	среднее	29,24±3,12	29,9±1,88	15,51±1,16	21,57±2,36	23,13±2,07
	Me [Q1; Q3]	27,25 [17, 43; 40, 45]**,#,##	28,5 [23, 2; 36, 2]**,#,##	16,04 [10, 86; 18, 54]#	20,86 [16, 49; 24, 37]	21,93 [18, 99; 28, 49]
TGFβ1	среднее	5,76±0,62	5,31±0,66	4,64±0,64	4,89±0,73	4,33±0,72
	Me [Q1; Q3]	5,56 [3, 59; 7, 65]#	4,51 [3, 03; 8, 15]	4,97 [2, 46; 6, 48]	4,24 [2, 87; 7, 73]	4,41 [2, 46; 6, 13]
DEFa1	среднее	0,61±0,08	0,53±0,08	0,41±0,06	0,42±0,09^	0,35±0,03
	Me [Q1; Q3]	0,67 [0, 26; 0, 85]#,##	0,48 [0, 23; 0, 83]	0,42 [0, 19; 0, 63]	0,35 [0, 23; 0, 69]	0,37 [0, 26; 0, 4]
ИНФ-γ	среднее	60,58±3,74	61,38±3,75	37,87±3,99	49,22±5,76	49,25±4,54
	Me [Q1; Q3]	61,16 [55, 49; 71, 67]**,#,##	64,08 [49, 77; 71, 23] **,#,##	37,69 [30, 67; 49, 58] **	50,89 [33, 25; 66, 86]	48,08 [42, 85; 56, 98]
Примечание. ^Нормальное распределение признака; **статистически значимое отличие от группы IIIa; #от интактного контроля; ##от системного гипотиреоза (группа IIa).

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Роль ТГ в регенерации тканей и раневом процессе находится на этапе накопления научных знаний, однако полученные данные позволяют постулировать, что йодотиронины демонстрируют провоспалительные и иммуномодулирующие эффекты [9], которые заключаются, с одной стороны, в снижении цитотоксичности иммунокомпетентных клеток, с другой — в повышении экспрессии провоспалительных цитокинов [10, 11]. Прежде всего это касается ИНФ-γ, TNF-α и интелейкина (IL) 6, в меньшей степени — CXCL9, -10, -11, IL-21, IL-23, IL-37 [12]. Выбор цитокинов и DEFa1 был определен ролью данных биологически активных субстанций в регенерации ран, при этом в нашем исследовании ИНФ-γ был выбран в качестве референсного показателя, так как значительное количество данных подтверждает повышение экспрессии данного цитокина при системном гипертиреозе [9]. Однако по данным нашего исследования, если лекарственно-индуцированный гипертиреоз приводил к повышению секреции всех исследуемых цитокинов и DEFa1, то локальное введение йодотиронина — только к повышению ИНФ-γ и FGF2.

В нашем исследовании получено сокращение времени «естественного течения раневого процесса» (natural history of wound healing) при лекарственном модулировании системного гипертиреоза и при топической аппликации тироксин-содержащего геля, в то же время лекарственная индукция ПТУ-индуцированного гипотиреоза приводила к увеличению времени эпителизации раны, что является одним из экспериментальных доказательств возможности локального применения йодотиронин-содержащих наружных лекарственных средств [7].

К настоящему времени имеются единичные данные об экспериментальном использовании йодотиронин-импрегнированных раневых покрытий и шовного материала, при этом продемонстрирована прежде всего прорегенераторная и проангиогенная активность натуральных йодотиронинов. Пропитанные раствором T4 (1 мкг/мл) хлопковые раневые повязки продемонстрировали высокую эффективность при заживлении кожных ран у лабораторных животных. Полная эпителизация неглубоких механических ран диаметром 20 мм была достигнута в течение 23 дней [13]. В экспериментальном исследовании применение гидрогелей на комбинированной основе, состоящей из хитозана, карбоксиметилцеллюлозы и гидроксиапатита при разных концентрациями T4 0,1, 0,5 и 1 мкг/мл, на модели мембраны хориоаллантойса куриного эмбриона было продемонстрировано, что гидрогели отличались проангиогенной активностью в дозозависимой манере с повышением концентрации Т4 [14]. На аналогичной модели было установлено, что поликапролактоновые волокна, импрегнированные Т3, имели высокий проангиогенный потенциал в месте аппликации. Погружение данного материала в кольца аорты крыс проявлялось в усилении инвазивного потенциала эндотелиальных клеток и увеличении общей площади поперечных сечений капилляров [15].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наше исследование дополняет имеющиеся представления о роли ТГ в раневом процессе и их возможное применение для стимуляции регенерации. Индуцированный системный гипертиреоз и использование тироксин-содержащего гидрогеля в концентрации 10 мкг/мл усиливает заживление ожоговых ран в эксперименте. При системном гипертиреозе усиливается секреция всех исследуемых цитокинов, при аппликации тироксин-содержащего геля — только секреция FGF2 и ИНФ-γ.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. А.А. Минченко, А.Р. Хасанов, А.А. Кокорина — проведение эксперимента; А.И. Полосков — подготовка и дозирование фармакологических субстанций, написание статьи; А.Е. Трандина, А.С. Бунтовская — выполнение лабораторных исследований; К.Б. Ованесов — анализ данных; Э.М. Мавренков, Р.И. Глушаков — редактирование статьи, разработка общей концепции. Авторы одобрили версию для публикации, а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой ее части.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено независимым этическим комитетом ООО «Медицинские технологии» (протокол № 34 от 19.12.2023). Протокол исследований не регистрировали.

Финансирование. Работа выполнена в рамках проекта «Приоритет-2030».

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента и член редакционной коллегии.

Об авторах

Александр Александрович Минченко

Военно-медицинская академия им. С.В. Кирова

Email: minchenkoaleksandr@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4180-4430
SPIN-код: 6261-4387
Россия, Санкт-Петербург

Артур Ришатович Хасанов

Военно-медицинская академия им. С.В. Кирова

Email: khasartrish@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0003-0763-7194
SPIN-код: 6054-7803
Россия, Санкт-Петербург

Александра Сергеевна Бунтовская

Военно-медицинская академия им. С.В. Кирова

Email: sandrarebel@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-5816-9736
SPIN-код: 5092-1833

MD

Россия, Санкт-Петербург

Антон Иванович Полосков

Военно-медицинская академия им. С.В. Кирова

Email: a.i.poloskov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-1877-7948
SPIN-код: 3465-2522
Россия, Санкт-Петербург

Александра Евгеньевна Трандина

Военно-медицинская академия им. С.В. Кирова

Email: sasha-trandina@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0003-1875-1059
SPIN-код: 6089-3495

MD

Россия, Санкт-Петербург

Арина Александровна Кокорина

Военно-медицинская академия им. С.В. Кирова

Email: el-kaa@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6783-3088
SPIN-код: 9371-3658
Россия, Санкт-Петербург

Карэн Борисович Ованесов

Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова

Email: ovanesov2007@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7325-8027
SPIN-код: 1598-9971

д-р мед. наук

Россия, Санкт-Петербург

Эдуард Михайлович Мавренков

Главное военно-медицинское управление

Email: Ehd-Mavrenkov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-8040-3720
SPIN-код: 8574-8891

д-р мед. наук

Россия, Москва

Руслан Иванович Глушаков

Военно-медицинская академия им. С.В. Кирова; Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: glushakoffruslan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-0161-5977
SPIN-код: 6860-8990

д-р мед. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Список литературы