Влияние локального и системного введения L-тироксина на скорость регенерации и секрецию цитокинов на модели экспериментальной ожоговой раны



Цитировать

Полный текст

Аннотация

Цель — исследовать системное и топическое влияние L-тироксина на течение раневого процесса на экспериментальной модели глубоких ожоговых ран.

Материалы и методы. В опытах на 74 белых нелинейных крысах-самцах массой 220–257г исследовали влияние медикаментозно измененного тиреоидного статуса и гидрогеля с тироксином в концентрации 10мкг/мл на течение экспериментального термического ожога кожи IIIB степени. Животные были рандомизированы на 3 опытных и 2 группы сравнения: Ia - cистемный гипертиреоз Ib - локальный гипертиреоз, II - cистемный пропилтиоурациловый гипотиреоз, IIIa - положительный контроль (мазь «Левомеколь»), IIIb - интактный контроль. Термический ожог, соответствующий IIIВ степени, наносили в области проксимальной части спины под общим наркозом при помощи термоаппликатора с плоской рабочей частью в форме круга диаметром 20мм. Через 72ч после нанесения ожога рану освобождали от струпа полным его иссечением по границе с неповрежденной кожей с наложением шинирующего кольца, после чего в Ib и IIIa группах аппликацию исследуемых лекарственных средств. На 10-е сутки после нанесения ожога в ран. Площадь ожоговой раны оценивали в динамике с использованием программы Universal Desktop Ruler.

Результаты. Медианы времени 50% эпителизации в группах системного и локального гипертиреоза составили 20 и 21 дней и были достоверно меньше интактного контроля. Медианы времени 75% эпителизации ран во всех экспериментальных группах достоверно отличались от обеих контрольных групп: в группах системного и локального гипертиреоза составила 29,5, 30,2±0,9 и 33,3±0,45 дней соответственно, при этом медиана времени до 75% эпителизации в группе ПТУ-индуцированного гипотиреоза не достигнута. Уровни ИНФ-γ, DEFa1, TGFb1, FGF2 в раневом отделяемом в группе системного гипертиреоза и уровни FGF2 и ИНФ-γ в группе локального гипертиреоза были статистически значимо повышены в сравнении с обеими контрольными группами. В группе ПТУ-индуцированного гипотиреоза, напротив, уровни FGF2 и ИНФ-γ демонстрировали статистически значимое снижение в сравнении с контрольными группами.

Заключение. Системное гипертиреоз и аппликации тироксин-содержащего геля на раневую поверхность приводит к ускорению «естественного течения раневого процесса». Тиреоидные гормоны демонстрируют дозозависимые эффекты в отношении секреции FGF2 и ИНФ-γ.

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Тиреоидные гормоны (ТГ) являются одними из ключевых регуляторов клеточных процессов, включая клеточную пролиферацию и дифференцировку, клеточный метаболизм, при этом реализация данных механизмов осуществляется через геномные и негеномные механизмы [1]. Стимуляция ядерных рецепторов приводит к изменению профилей экспрессии более 100 генов, из которых более половины является тканеспецифичными [2]. Негеномные механизмы реализуются через стимуляцию L-тироксином (Т4), в меньшей степени, через прямым (Т3) и реверсивным (rТ3) трийодтиронином, специфических сайтов связывания, расположенных на интегрине αvβ3 (CD51/CD61), что приводит в дозозависимой манере к активации сигнальных путей митоген-активируемой протеин-киназы (MAPK) с включением сигнального пути RAS/RAF/MEK/ERK, а также фосфатидилинозитол-3-киназами (PI3K) и серин/треониновой протеинкиназы (STK ) [3]. Если для злокачественных новообразований избыточные концентрации ТГ приводят к опухолевой прогрессии за счет негеномно реализуемых эффектов, приводящим к активации клеточной пролиферации, ангиогенеза и инициации иммуномодулирующих эффектов, связанных с изменением секреции про- и противовоспалительных цитокинов [4, 5], то роль ТГ в регенерации и пролиферации как неизмененных, так и поврежденных тканей не достаточно изучена [6]. Совокупность накопленных теоретических данных о внутриклеточных и тканевых эффектах йодотиронинов делает возможным их потенциальное применение в качестве универсальных регуляторов клеточной пролиферации и ангиогенеза для лечения ран кожи различной этиологии [7]. Однако данные о применении гормонов ЩЖ находятся на этапе накопления научных знаний, в частности, данный тезис касается топического применения йодотиронинов.

Цель исследования – исследовать системное и топическое влияние L-тироксина на течение раневого процесса на экспериментальной модели глубоких ожоговых ран.

Материалы и методы

Общий дизайн экспериментального исследования.

Выполнены экспериментальные наблюдения, оценивающие влияния лекарственно измененного тиреоидного статуса и топического влияния L-тироксина на течение раневого процесса в эксперименте. Эксперимент проводили на белых нелинейных крысах-самцах массой 184-246 г. (n=65), полученных из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» (Рапполово, Ленинградская область, РФ).

После получения из питомника крыс содержали в условиях карантине, длительность которого составила не менее 14 суток. В течение карантина проводили осмотр каждого животного (поведение и общее состояние) дважды в день (в утренние и вечерние часы). Лабораторные животные с подозрением на любое заболевание и/или имеющие изменения в поведении исключались из исследования в течение карантина.

Таблица 1. Характеристика исследуемых групп лабораторных животных

Table 1. Characteristics of the studied groups of laboratory animals

Группа
№

Название группы

Кол-во лабораторных
животных

Описание группы

Описание метода

Кратность введение

Ia

Системный гипертиреоз

18

Индукция медикаментозного гипертиреоза средней степени тяжести

Внутрибрюшинное введение препарата в дозе 100 мкг/100 г массы животного

1 раз в сутки

Ib

Локальный гипертиреоз

18

Создание повышенных концентраций L-тироксина в области раны

Аппликация 1 мл геля с L-тироксином в концентрации 10 мкг/мл

1 раз в сутки на раневую поверхность

II

Системный гипотиреоз

18

Индукция лекарственного гипертиреоза средней степени

Замена воды в поилке на раствор 0,1% пропилтиоурацила

ad libidum

IIIa

Положительный контроль

10

Местное лечение раны стандартным препаратом

Аппликация раны 1,0 г мазью «Левомеколь»

1 раз в стуки

IIIb

Интактный контроль

10

Ведение раны открытым способом без применения лекарственных средств

-

-

Содержание животных, формирование опытных групп и рандоминизация.

Лабораторные животные (n=74) содержались в стандартных условиях вивария в 4-х местных клетках, где каждое животное было отделено от других особей перфорированной перегородкой, что обеспечивало коммуникации между экспериментальными животными и уменьшало стресс изоляции. Каждое лабораторное животное имело доступ к воде и пище ad libidum. Лабораторные животные после нанесения экспериментального ожога были разделены с помощью генератора случайных чисел на 5 экспериментальных групп в соотношении 1,8:1,0 по основным и группам сравнения соответственно (Таблица 1). Животным Ia группы индуцирован cистемный гипертиреоз, Ib группа (локальный гипертиреоз) получала аппликации тироксин-содержащем гелем, на II группе лабораторных животных воспроизведена модель cистемный пропилтиоурациловый гипотиреоз путем замены воды в поилке на раствор 0,1% пропилтиоурацила (ПТУ), животные IIIa группы служили положительным контролем и получали аппликации мазью «Левомеколь», IIIb служила интактным контролем (Табл. 1).

Фармакологические субстанции

            В исследовании использовались субстанции L-тироксина и ПТУ (Табл. 2), при этом раствор тироксина вводили внутрибрюшинно после ежедневного взвешивания лабораторного животного. Гидрогель с тироксином изготавливали путем перемешивания раствора тироксина с натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ) до концентрации 10 мкг/мл. Группа положительного контроля получала аппликации мазью «Левомеколь». Для чистоты эксперимента и создания одинакового стрессового воздействия все группы лабораторных животных кроме системного гипертиреоза получали ежедневные инъекцию с 0,2 мл физиологического раствора.

Таблица 2. Фармакологические субстанции, используемые в исследовании

Table 2. Pharmacological substances used in the study

Наименование субстанции

Международное непатентованное название

Фирма-производитель

Страна-производитель

L-тироксин

2-амино-3-[4-(4-гидрокси-3,5-дийодфенокси)-3,5-дийодфенил] пропионовая кислота

РУП «Белмедпрепараты»

Республика Беларусь

Пропилтиоурацил

2,3-дигидро-6-пропил-2-тиоксо-4(1Н)-пиримидинон

Wuhan Hezhong Bio-Chemical Manufacture Co., Ltd

КНР

 

Моделирование термического ожога

Термический ожог наносили по ранее описанной методике [8] в области проксимальной части спины, чтобы лабораторные животные не имели возможности контакта мордой и лапами с раневой поверхностью. За 4 дня до нанесения раны в области нанесения термического ожога выстригали шерсть и проводили депиляцию предназначенным для этого кремом в течение 15 минут По истечении указанного времени крем с шерстью удаляли с поверхности кожи, кожу в данной области промывали теплой водой, промокали бумажным полотенцем и давали обсохнуть. Подготовку области ожоговой травмы завершали нанесением на кожу метки для обозначения центра будущего места приложения термоаппликатора. Процедуру ожога кожи крысам выполняли под общей анестезией препаратами Золетил®100 в сочетании с 0,01% раствором клонидина в соотношении 2:1. После наступления фазы глубокого сна у животных. В качестве инструмента для нанесения термического ожога крысам использовали цилиндрический стальной аппликатор массой 835 г с плоской рабочей частью в форме круга диаметром 20 мм, что обеспечивало площадь раневой поверхность 100π, т.е. 314±5 мм2. Нагрев аппликатора до постоянной температуры перед воздействием на животное проводили путем полного погружения кипящую воду (температура 98-100°С) на 2 минуты. Продолжительность времени аппликации с кожей лабораторного животного составляла 30 секунд. По истечении указанного времени аппликатор удаляли. Через 72 часа после нанесения ожога рану освобождали от струпа полным его иссечением по границе с неповрежденной кожей.  После иссечения струпа кожу вокруг раны прошивали хирургической нитью с оставлением концов нити свободными. Внутрь (по периметру) раневого дефекта устанавливали шину в форме кольца высотой 4 мм, внутренним диаметром 25 мм, наружным диаметром 26,5 мм, которую фиксировали путем пришивания шовным материалом.

Шинирующее кольцо сверху закрывали пластырной наклейкой, которую фиксировали по краям кольца, что позволяло минимизировать контаминацию и снизить потерю препарата при местном нанесении. Наложение шины предупреждало эффект контракции раны и сохранение ее постоянного размера для лучшей объективной оценки исследуемого и сравниваемого препарата.

Наблюдение за лабораторными животными

Для объективизации данных на всех основных этапах эксперимента проводили фотофиксацию состояния ран с использованием масштабной линейки для последующего расчета их площади. Для определения площади ран использовали программу Universal Desktop Ruler, позволяющую определять геометрические параметры раны по фотографии, с предварительной калибровкой точности измерения по отраженной на фотографии масштабной линейке. В качестве критериев полного заживления раны в данном эксперименте служила динамика эпителизации поверхности раны.

Иммуноферментный анализ

Для исследования резорбции и тиреоидного статуса при системном лекарственно индуцируемом измененном тиреоидном статусе и использовании гидрогелей с йодотиронинами исследовали уровни ТТГ в сыворотке крови, для чего забор крови проводили во время декапитации. Использовали тест-систему Вектор-Бест.

Определение уровней гамма-интерферона (ИНФ-γ), дефенсин альфа 1 (DEFa1), трансформирующий фактор роста β-1 (TGFb1), фактора роста фибробластов 2 (FGF2) в раневом отделяемом выполняли с использованием метода ELISA (Иммуноферментного анализа) с помощью реактивов фирмы Cloud-Clone Corporation (США) согласно инструкции. Забор материала производили на 10-е сутки после нанесения раны методом абсорбция раневого отделяемого с помощью стерильных бумажных штифтов, которые помещались на рану в течение 60 сек., после чего пробы помещались в стерильные пробирки с физиологически раствором на 45 мин. Определение выполнялось на многофункциональном планшетном анализаторе Victor X5 (PerkinElmer Inc., США).

Этические правила и нормы.

Работа проведена в соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.) и одобрена Локальным этическим комитетом.

Статистическая обработка.

Методы описательной статистики включали общепринятые методы описательной статистики с учетом статистики малых групп включали в себя как среднее значение с оценкой стандартной ошибки среднего (SE) и стандартного отклонения (SD), так и медиана признака с определением верхнего и нижнего квартилей (25%- и 75% перцентиля), при этом определялся вариант распределения признака в группе: нормальное и отличное от нормального. Распределение признака в группах определяли на основании метода Т.У. Андерсона и Д.А. Дарлинга. С учетом особенностей распределения признака группы в каждом эксперименте сравнивали по U-критерий Манна – Уитни. Для сравнения динамики эпителизации ран лабораторных животных использовали метод Е.Л. Каплана и П. Мейера, при этом при построении кривой в каждой конкретной временной точке демонстрировал средний уровень оставшейся раневой поверхности в данный период времени от 100% в день начала эксперимента до 0% при полной эпителизации, при этом рассчитывали медиану времени до 25%, 50% и 75% эпителизации с определением стандартной ошибки– по формуле Гринвуда, анализ динамики эпителизации в зависимости от распределения признака проводился– по тесту Мантела – Кокса (Log-ranktest) или тесту Гехана – Бреслоу– Вилкоксона. Критический уровень значимости нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых различий или факторных влияний) принимали равным 0,05.

Результаты

Установлено, что индукция гипертиреоидного состояния и/или аппликация водорастворимого геля с L-тироксином (см. таблицу 3) приводило к достоверному ускорению времени эпителизации. С другой стороны, медикаментозно индуцированный гипотиреоз приводил к значимому замедлению времени эпителизации.

При измерении динамики эпителизации ожоговых ран было установлено, что медианы времени 50%-эпителизации раны в группах, которые получали системное или локальное введение йодотионинов, составили 20 (19;21,5) и 21 (18; 22) дней и достоверно отличались от интактного контроля. Время 75% эпителизации достоверное отличалась во всех экспериментальных группах как от группы интактного контроля, так и от группы сравнения, при этом если в Ia и Ib группах время 75% эпителизации составила 29,5 (28;32) и 30,2±0,9 дней, то в группе индуцированного гипотиреоза время 75% эпителизации не достигнуто (Табл. 3).

Таблица 3. Динамика эпителизации ран в течение эксперимента

Table 3. Dynamics of wound healing during the experiment

Интегральные показатели заживления ран

Группы лабораторных животных

гипертиреоз

системный гипотиреоз

группы сравнения

Ia группа

(системный гипертиреоз)

Ib группа

(локальный гипертиреоз)

II группа

IIIa группа

(Левомеколь)

IIIb группа

интактный контроль

Время 25% эпителизации ран, сут.

10 (9,5; 11,0)

12,9±0,3

15 (13;16,5)

13,2±0,4

14,6±0,3

Время 50% эпителизации ран, сут.

20 (19;21,5) *

21 (18; 22)*

29,5 (26; 32,5)

23,5±0,6*

28,1±0,7

Время 75% эпителизации ран

29,5 (28;32) †

30,2±0,9 †

не достигнуто†

32,5 (29;35)*

36 (34; 37)

Примечание: * - достоверное отличие от интактного контроля, † - достоверное отличие от стандарта лечения (IIIa группы)

При исследовании тиреоидного статуса по уровню ТТГ и Т4 полученные данные точно отражали системный гипо- и гипертиреоз в соответствии с современными представлениями о гормональной регуляции, при этом уровни ТТГ и Т4 в крови лабораторных животных при топической аппликации тироксин-содержащих гелей соответствовала условному эутиреозу и значимо не отличалась от уровня тиреоидных гормонов в IIIa и IIIb группах (Табл. 4).

 

Таблица 4. Уровни тиреоидных гормонов в последний день эксперимента

Table 4. Thyroid hormone levels on the last day of the experiment

Исследуемые гормоны

Группы лабораторных животных

гипертиреоз

системный гипотиреоз

контроль

Ia группа

(системный гипертиреоз)

Ib группа

(локальный гипертиреоз)

II группа

IIIa группа

(Левомеколь)

IIIb группа

интактный контроль

ТТГ, мМЕ/л

среднее

0,33±0,07♭

1,53±0,13♭

6,09±0,6

1,67±0,29♭

1,74±0,2

медиана

0,27 (0,14;0,34)

1,39 (1,13;1,72) ♮‡

5,82 (4,16;6,92)*♮†‡

1,37 (1,13; 1,84)

1,58 (1,32; 2,12)

Т4, нмоль/л

среднее

97,98±2,86

75,19±2,51

56,19±2,99

77,64±0,2,81

74,88±2,77

медиана

98,15 (87,58;108,83) *♮†‡

81,93 (87,58;108,83) ♮‡

64,26 (49,05;64,26) *♮†‡

79,24 (69,45;86,5)

75,92 (66,84;82,8)

Примечание: ♭ - нормальное распределение признака; * - достоверное отличие от Ib группы; ♮ - достоверное отличие IIIa группы; † - достоверное отличие от интактного контроля, ‡ - достоверное отличие от системного гипотиреоза (IIa группы).

Уровни всех исследуемых цитокинов и DEFa1 в раневом отделяемом на 10-е сутки эксперимента были статистически значимо повышены в группе системного гипертиреоза в сравнении с обеими контрольными группами. В то же время при локальном применении тироксин-содержащего геля в концентрации 10 мкг/мл статистически значимое повышение уровней было установлено только для FGF2 и ИНФ-γ. В группе ПТУ-индуцированного гипотиреоза, напротив, уровни FGF2 и ИНФ-γ демонстрировали статистически значимое снижение в сравнении с контрольными группами, что косвенно подчеркивает дозозависимые эффекты йодотиронинов в регуляции экспрессии FGF2 и ИНФ-γ (Табл. 5).

Таблица 5. Уровни исследуемых цитокинов и дефензина альфа-1 у лабораторных животных

Table 5. Levels of cytokines and defensin alpha-1 in wound fluid in laboratory animals

Исследуемые цитокины, пг/мл

Группы лабораторных животных

гипертиреоз

системный гипотиреоз

контроль

Ia группа

(системный гипертиреоз)

Ib группа

(локальный гипертиреоз)

II группа

IIIa группа

(Левомеколь)

IIIb группа

интактный контроль

FGF2

среднее

29,24±3,12

29,9±1,88

15,51±1,16

21,57±2,36

23,13±2,07

медиана

27,25‡♮†

(17,43; 40,45)

28,5‡♮†

(23,2; 36,2)

16,04†

(10,86; 18,54)

20,86

(16,49; 24,37)

21,93

(18,99; 28,49)

TGFb1

среднее

5,76±0,62

5,31±0,66

4,64±0,64

4,89±0,73

4,33±0,72

медиана

5,56†

(3,59; 7,65)

4,51

(3,03; 8,15)

4,97

(2,46; 6,48)

4,24

(2,87; 7,73)

4,41

(2,46; 6,13)

DEFa1

среднее

0,61±0,08

0,53±0,08

0,41±0,06

0,42±0,09♭

0,35±0,03

медиана

0,67†‡

(0,26; 0,85)

0,48

(0,23; 0,83)

0,42

(0,19; 0,63)

0,35

(0,23; 0,69)

0,37

(0,26; 0,4)

ИНФ-γ

среднее

60,58±3,74

61,38±3,75

37,87±3,99

49,22±5,76

49,25±4,54

медиана

61,16‡♮†

(55,49; 71,67)

64,08‡♮†

(49,77; 71,23)

37,69♮

(30,67; 49,58)

50,89

(33,25; 66,86)

48,08

(42,85; 56,98)

Примечание: ♭ - нормальное распределение признака; ♮ - достоверное отличие IIIa группы; † - достоверное отличие от интактного контроля, ‡ - достоверное отличие от системного гипотиреоза (IIa группы).

Обсуждение результатов

      Роль ТГ в регенерации тканей и раневом процессе находится на этапе накопления научных знаний, однако полученные данные позволяют постулировать, что йодотиронины демонстрируют провоспалительные и иммуномодулирующие эффекты [9], которые заключаются с одной стороны в снижении цитотоксичности иммунокомпетентных клеток, с другой стороны в повышении экспрессии провоспалительных цитокинов [10, 11]. Прежде всего это касается IFN-γ, TNF-α и IL-6, в меньшей степени ‒ CXCL9, -10, -11, интелейкинов-21, -23, 37 [12]. Выбор цитокинов и дефензина альфа-1 был определен ролью данных биологически активных субстанций в регенерации ран, при этом в нашем исследовании ИНФ-γ был выбран в качестве референсного показателя, так как значительное количество данных подтверждают повышение экспрессии данного цитокина при системном гипертиреозе [9]. Однако по данным нашего исследования если лекарственно-индуцированный гипертиреоз приводил к повышению секреции всех исследуемых цитокинов и DEFa1, то локальное введение йодотиронина – только к повышению ИНФ-γ и FGF2.

В нашем исследовании получено сокращение времени «естественного течения раневого процесса» (natural history of wound healing) при лекарственном модулировании системного гипертиреоза и при топической аппликации тироксин-содержащего геля, в то же время лекарственная индукция ПТУ-индуцированного гипотиреоза приводила к увеличению времени эпителизации раны, что является одни из экспериментальных доказательств возможности локального применения йодотиронин-содержащих наружных лекарственных средств [7].

К настоящему времени имеются единичные данные об экспериментальном использовании йодотиронин-импрегнированных раневых покрытий и шовного материала, при этом продемонстрирована прежде всего прорегенераторная и проангиогенная активность натуральных йодотиронинов. Пропитанные раствором T4 (1 мкг/мл) хлопковые раневые повязки, продемонстрировали высокую эффективность при заживлении кожных ран у лабораторных животных. Полная эпителизация неглубоких механических ран диаметром 20 мм была достигнута в течение 23 дней [13]. В экспериментальном исследовании применение гидрогелей на комбинированной основе, состоящей из хитозана, карбоксиметилцеллюлозы и гидроксиапатита при разных концентрациями T4: 0,1 мкг/мл, 0,5 мкг/мл и 1 мкг/мл, - на модели мембраны хориоаллантойса куриного эмбриона было продемонстрировано, что гидрогели отличались проангиогеннуой активностью в дозозависимой манере с повышением концентрации Т4 [14]. На аналогичной модели было установлено, что поликапролактоновые волокна, импрегнированные Т3 имели высокий проангиогенный потенциал в месте аппликации. Также погружение данного материала в кольца аорты крыс проявлялось в усилении инвазивного потенциала эндотелиальных клеток и увеличении общей площади поперечных сечений капилляров [15].

Заключение

Наше исследование дополняет имеющиеся представления о роли ТГ в раневом процессе и их возможное применение для стимуляции регенерации. Индуцированный системный гипертиреоз и использование тироксин-содержащего гидрогеля в концентрации 10 мкг/мл усиливает заживление ожоговых ран в эксперименте. При системном гипертиреозе усиливается секреция всех исследуемых цитокинов, при аппликации тироксин-содержащего геля ‒ только секреция FGF2 и ИНФ-γ.

×

Список литературы


© Эко-Вектор,


СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 65565 от 04.05.2016 г.