ВЛИЯНИЕ ВАЗОПРЕССИНА НА БОЛЕВУЮ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ, СОДЕРЖАНИЕ МОНОАМИНОВ И BDNF В МОЗГЕ КРЫС В РАННЕМ ПЕРИОДЕ ПОСЛЕ ПЕРЕНЕСЕННОГО ВИТАЛЬНОГО СТРЕССА

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Рост числа природных и техногенных катастроф, числа вооруженных конфликтов, включая угрожающих жизни, повышают нагрузку на физиологические системы, обеспечивающие стресс-реактивность, что вызывает развитие связанных со стрессом расстройств, включая посттравматическое стрессовое расстройство (ПТСР). В настоящее время патогенез ПТСР остается мало изученным, терапия расстройства часто недостаточно эффективна [1].

Известно, что острый стресс вызывает кратковременное снижение чувствительности к боли ― стресс-вызванную аналгезию (СВА) [1–3]. Выраженный острый или хронический стресс способствуют развитию стресс-вызванной гипералгезии (СВГ), обусловленной сенситизацией системы восприятия боли [1–3].

Одной из эндокринных систем, вовлеченных в регуляцию реакций на стресс и боль, является вазопрессинергическая система [1, 4, 5]. Показано, что аргинин-вазопрессин (АВП) и его синтетический аналог 1-дезамино-8-D-аргинин-вазопрессин, ДДАВП, проявляли дозозависимые эффекты при расстройствах эмоций: в больших дозах ― анксиогенный, в малых дозах ― анксиолитический и антидепрессивный, в том числе в модели ПТСР [6–9]. Установлены аналгетические эффекты АВП и ДДАВП в разных условиях [5, 10–12]. Нейрохимические механизмы этих эффектов практически не изучены.

Известно участие BDNF и моноаминов в регуляции различных физиологических функций, включая стресс и боль [13, 14]. В модели ПТСР выявлен дисбаланс BDNF и моноаминов в мозге [15–18]. Установлено, что дисфункция моноаминергических систем и нарушение нейротрофического обеспечения мозга способствует развитию СВГ [19–22]. По данным литературы АВП и ДДАВП влияли на содержание моноаминов, BDNF в мозге и крови у крыс [23, 24]. У комбатантов с ПТСР при введении ДДАВП улучшалось социальное мышление [25]. Данных об участии BDNF и моноаминов в реализации аналгетических эффектов ДДАВП у крыс, перенесших витальный стресс, нет.

Целью исследования была оценка влияния ДДАВП на болевую чувствительность, содержание кортикостерона в плазме крови, нейротрофического фактора мозга, уровни норадреналина, серотонина, дофамина и их метаболитов в теменной коре и спинном мозге в раннем периоде после перенесенного витального стресса у крыс.

 

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

Исследование выполнено на 41 половозрелом самце крыс Вистар (ФГПУ Питомник лабораторных животных «Рапполово», Ленинградская область) одинакового возраста (4 месяца) c исходной массой тела 220 ± 25 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Методом блочной рандомизации всех животных разделили на 4 группы: 1 группа включала 5 интактных крыс (контрольная группа, КГ); 2 группа ― 12 крыс, получивших ДДАВП в течение 5 дней (группа АВП); 3 группа ― 12 крыс, у которых оценивали различные показатели до стрессового воздействия и через 5 дней после него (группа ВС); 4 группа ― 12 крыс, у которых оценивали различные показатели до стресса и начала введения ДДАВП, и после стресса и окончания курсового введения пептида (группа ВС+АВП). В этой группе крыс ДДАВП начинали вводить сразу же после стрессирования и затем ежедневно в течение 5 дней. Водный раствор ДДАВП (десмопрессин, произведенный «Ferring S.p.a.», Италия), вводили интраназально в однократной дозе 2 мкг и в кумулятивной дозе 10 мкг.

Острую психическую травму моделировали обстоятельствами переживания ситуации гибели партнера и угрозой собственной жизни от действия хищника при помещении группы крыс в террариум к тигровому питону [26,  27]. Далее крысы находились в террариуме за прозрачной перегородкой в течение 30-40 минут. Во время нанесения психической травмы у крыс наблюдались выраженные реакции страха (фризинг, сбивание в кучи, вертикальные стойки, продолжительный и измененный груминг). Отдельные животные осуществляли ажитированное бесконтрольное перемещение по террариуму. Далее животных отсаживали в домашние клетки, где их содержали в стандартных условиях до проведения последующих исследований.

Для оценки болевой чувствительности использовали тест термической иммерсии хвоста [28]. Термическое раздражение кожи хвоста проводили путем его погружения в емкость с водой, нагретой до температуры 52,0 ± 0,1º С [29, 30]. Время (в секундах) до отдергивания хвоста из воды рассматривалось как порог ноцицептивной реакции (ПНР) [31]. У каждого животного с использованием трехкратных измерений определяли средние значения ПНР. Время экспозиции термического воздействия не превышало 15 секунд [32, 33]. ПНР оценивали не ранее, чем через 4 часа после окончания воздействий и/или введения пептида.

Вслед за последним измерением латентности всех животных подвергали эвтаназии путем декапитации, получали смешанную артериовенозную кровь, извлекали головной и спинной мозг с корешками L5-S2. После сбора крови пробирку помещали в термостат (37 0С) и выдерживали 30 минут до формирования сгустка, затем сгусток осторожно отделяли от стенок пробирки, пробу центрифугировали 10 минут при 200 g и собирали надосадочную жидкость (плазму). В плазме крови, собранной после эвтаназии, оценивали содержание кортикостерона крови с использованием коммерческого набора реактивов фирмы Enzo №ADI-900-097 ELISAkit. Все манипуляции проводили в точном соответствии с инструкцией.

С целью определения содержания нейромедиаторов и их метаболитов образцы ткани мозга гомогенизировали в 0,1 Н хлорной кислоте, центрифугировали 30 мин при 10000 g и 4°С, отбирали надосадок. Уровни NE, 5-HT, DA и их метаболитов (3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (DOPAC), гомованилиновой кислоты (HVA), 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA) определяли с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии согласно методике [34].

Для определения содержания BDNF образцы ткани мозга гомогенизировали ручным гомогенизатором в буфере (20 мМ трис, 150 мМ NaCl, 0,1 % тритон X-100, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ФМСФ, рН 7,6), центрифугировали 20 мин при 4 °С, 5000 g и отбирали надосадок. Образцы хранили при –70 °С. Концентрацию BDNF в гомогенатах ткани определяли методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора реактивов Rat BDNF ELISA Kit (ab213899); процедуру проводили в соответствии с инструкцией производителя.

Все экспериментальные процедуры проводили в соответствии с регламентом Декларации ЕС от 2010 г. и российскими биоэтическими стандартами по содержанию и обращению с лабораторными животными, с разрешения Комитета по биомедицинской этике ФГБНУ «ИЭМ» (протокол №6/20 от 21.10.2020 г).

Статистический анализ проводился с помощью программы Statistica 8.0 (StatSoft). Нормальность распределения проверялась тестом Шапиро-Уилка. Все данные выражали в виде средних значений ± стандартной ошибки средней. Статистические различия были проверены с использованием дисперсионного анализа с последующим применением post-hoc критерия Тьюки. Статистически значимым считалось р < 0,05.

 

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

 

Во всех группах исходные значения ПНР не отличались от таковых в КГ. После введения ДДАВП болевая чувствительность (группа АВП) снизилась по сравнению с её значениями до введения пептида и с КГ (p < 0,001; p = 0,04, соответственно)  (рисунок 1). На 5-й день после стресса (группа ВС) ПНР повысился (p < 0,001) и был выше по сравнению с КГ (p = 0,03). У стрессированных крыс введение ДДАВП вызывало снижение ПНР (p < 0,001) (группа ВС+АВП). Причем в этой группе крыс ПНР был ниже по сравнению с КГ, с введением пептида (группа АВП) и c воздействием стресса (группа ВС) (p = 0,04, p < 0,001, p < 0,001; соответственно).

 

Рисунок 1 Болевая чувствительность у крыс на 5 день после витального стресса (без введения и с введением ДДАВП) (абс. значения, М±SEM)

Примечание: ось абсцисс ‒ Контроль ‒ интактные нестрессированные животные, АВП – получившие ДДАВП крысы, ВС – стрессированные крысы без введений, ВС+АВП – перенесшие стресс и получившие ДДАВП животные; ось ординат ‒ болевая чувствительность; * – отличие от контроля при р < 0,05; # – отличие между 1-м и 5-м днями в группах при р < 0,05; & – отличие на 5 день между группами АВП и ВС+АВП; ^ – отличие на 5 день между группами ВС и ВС+АВП при р < 0,05

/ Figure 1 Pain sensitivity in rats on day 5 after vital stress (without and with administration of DDAVP) (abs. values, M±SEM). Note: abscissa axis ‒ Control ‒ intact non–stressed animals, AVP – rats that received DDAVP, VS – stressed rats without injections, VS+AVP ‒ animals that suffered stress and received DDAVP; ordinate axis – pain sensitivity; * ‒ difference from control at p < 0.05; # – difference between 1st and 5th- m days in groups at p < 0.05; & – the difference on day 5 between the AVP and VS+AVP groups; ^ – the difference on day 5 between the VS and VS+AVP groups at p < 0.05

 

ДДАВП не влиял на содержание кортикостерона в плазме крови у крыс (группа АВП). У крыс, перенесших стресс (группа ВС), а также у стрессированных и получивших пептид животных (группа ВС+АВП) содержание кортикостерона было выше по сравнению с КГ (p < 0,001, p < 0,001, соответственно) (таблица 1). При введении пептида (группа АВП) в теменной коре по сравнению с КГ повысились уровни BDNF и NE, снизилось содержание HVA (р = 0,01; р = 0,04; р = 0,04, соответственно); в спинном мозге ― снизились уровни NE, DOPAC и 5-НТ (р < 0,001; р < 0,001; р = 0,04, соответственно); повысилось содержание BDNF (р = 0,01), причем оно было также выше по сравнению с воздействием стресса (группа ВС) и введением пептида стрессированным крысам (группа ВС+АВП) (р < 0,001 и p < 0,001 соответственно) (таблицы 2, 3, 4).

 

Таблица 1

Содержание кортикостерона в плазме крови у крыс на 5-й день после витального стресса (без введения и с введением ДДАВП) (М±SEM, нг/мл) / Table 1 Plasma corticosterone content in rats on day 5 after vital stress (without and with DDAVP administration) (M±SEM, ng/ml)

 

Группы животных	Содержание кортикостерона, нг/мл
КГ (n = 5)	374 ± 42
АВП (n = 5)	492 ± 30
ВС (n = 7)	695 ±58*
ВС+АВП (n = 8)	737 ±39*

 

Примечание: КГ ‒ контрольная группа; * – отличия по сравнению с КГ при p < 0,001 / Note: CG – control group; * ‒ differences compared to CG at p < 0.001

 

Таблица 2

Содержание BDNF в теменной коре и спинном мозге у крыс на 5 день после витального стресса (без введения и с введением ДДАВП) (M±SEM, пг/мл)

/ Table 2 BDNF content in parietal cortex and spinal cord in rats on day 5 after vital stress (without and with DDAVP administration) (M±SEM, pg/ml)

 

Группы животных	Содержание BDNF, пг/мл
	в теменной коре	в спинном мозге
КГ (n = 4)	32 ± 3	43 ± 7
АВП (n = 5)	82 ± 9*	65 ± 12*#&
ВС (n = 7)	62 ± 8	33 ± 3
ВС+АВП (n = 8)	86 ± 11*	33 ± 12

 

Примечание: * – отличия по сравнению с КГ при p < 0,05; # – отличия по сравнению с перенесшими стресс крысами при p < 0,05; & – отличия по сравнению со стрессированными крысами, получившими ДДАВП p < 0,05 / Note: * - differences compared to CG at p < 0.05; # - differences compared to stressed rats at p < 0.05; & - differences compared to stressed rats that received DDAVP at p < 0.05

 

 

 

 

Таблица 3

Содержание нейромедиаторов и их метаболитов в сенсомоторной коре на 5-й день после витального стресса у крыс (без введения и с введением ДДАВП) (M ± SEM) / Table 3. Content of neurotransmitters and their metabolites in sensorimotor cortex on day 5 after vital stress in rats (without and with DDAVP administration) (M ± SEM)

 

Показатель,  нг/мг белка	КГ (n = 5)	АВП (n = 12)	ВС (n = 12)	ВС+АВП (n = 12)
NE	0,64 ± 0,08	7,94 ± 1,01*	12,47 ± 2,15*	9,05 ± 1,87*
DA	0,76 ± 0,28	0,59 ± 0,27	0,75 ± 0,29	2,70 ± 0,71*#&
DOPAC	0,39 ± 0,11	2,71 ± 1,23	1,01 ± 0,40	0,88 ± 0,15
HVA	0,34 ± 0,10	0,11 ± 0,04*	0,04 ± 0,02*	0,22 ± 0,07
5-НТ	3,28 ± 0,56	6,54 ± 1,11	4,52 ± 1,26	4,84 ± 0,91
5-HIAA	2,25 ± 0,83	1,01 ± 0,34	1,40 ± 0,68	2,20 ± 0,76

 

Примечание: * – отличия по сравнению с КГ при p < 0,05; # – отличия по сравнению с введением ДДАВП при p < 0,05; & – отличия по сравнению со стрессированными крысами при p < 0,05 / Note: * ‒ differences compared to CG at p < 0.05; # ‒ differences compared to DDAVP administration at p < 0.05; & ‒ differences compared to stressed rats at p < 0.05

 

Таблица 4

Содержание нейромедиаторов и их метаболитов в спинном мозге на 5-й день после витального стресса у крыс (без введения и с введением ДДАВП) (M ± SEM) / Table 4 Contents of neurotransmitters and their metabolites in the spinal cord on day 5 after vital stress in rats (without and with DDAVP administration) (M ± SEM)

 

Показатель, нг/мг белка	КГ (n = 5)	АВП         (n = 12)	ВС (n = 12)	ВС+АВП (n = 12)
NE	1,75 ± 0,45	0,49 ± 0,09*	0,77 ± 0,13*	0,82 ± 0,11*
DA	1,72 ± 0,32	0,95 ± 0,23	1,07 ± 0,22	0,61 ± 0,17*
DOPAC	1,45 ± 0,15	0,58 ± 0,10*	0,55 ± 0,17*	0,44 ± 0,08*
HVA	0,07 ± 0,02	0,04 ± 0,01	0,05 ± 0,02	0,12 ± 0,02#&
5-НТ	8,78 ± 2,25	4,86 ± 0,69*	5,70 ± 0,93	7,14 ± 1,29
5-HIAA	1,90 ± 0,45	1,62 ± 0,23	2,18 ± 0,37	2,38 ± 0,43

Примечание: * – отличия по сравнению с КГ при p < 0,05; # – отличия по сравнению с введением ДДАВП при p < 0,05; & – отличия по сравнению со стрессированными крысами при p < 0,05 / Note: * ‒ differences compared to CG at p < 0.05; # ‒ differences compared to DDAVP administration at p < 0.05; & ‒ differences compared to stressed rats at p < 0.05

 

У стрессированных крыс (группа ВС) в коре повысилось содержание NE, снизились уровни HVA (р < 0,001 и р = 0,01 соответственно); в спинном мозге ― снизилось содержания NE и DOPAC (р = 0,001 и р < 0,001 соответственно) (таблицы 3, 4).

ДДАВП у стрессированных крыс (группа ВС+АВП) в теменной коре повышал содержание BDNF и NE (р = 0,006 и р = 0,04 соответственно); увеличивал уровни DA по сравнению с КГ, с введением ДДАВП (группа АВП) и воздействием стресса (группа ВС) (p = 0,04; р = 0,009; р = 0,01; соответственно). В группе ВС+АВП в спинном мозге снизились с уровни NE, DA и DOPAC (р < 0,001; р = 0,03; р < 0,001, соответственно); повысилось содержание HVA по сравнению введением пептида (группа АВП) (р = 0,01) и воздействием стресса (р = 0,02) (таблицы 2, 3, 4).

 

 

ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

 

 

Показано, что ДДАВП при интраназальном введении по 2 мкг в день, 10 мкг на курс снижал болевую чувствительность у крыс. Аналгетический эффект пептида ассоциировался с повышением содержания BDNF в сенсомоторной коре и спинном мозге, в коре ― с повышением уровней NE, снижением содержания HVA; в спинном мозге – со снижением содержания NE, 5-HT и DOPAC. ДДАВП не влиял на уровни кортикостерона в крови у крыс.

Известно, что тест тепловой иммерсии хвоста основан на спинальном флексорном рефлексе в ответ на погружение хвоста в горячую воду [29]. Учитывая антиноцицептивные эффекты BDNF и моноаминов [13, 14], нельзя исключить, что вызванное пептидом обезболивание могло быть связано с его модуляторным влиянием на высвобождение BDNF в коре и спинном мозге, на активность моноаминергических систем в мозге. Вызванное ДДАВП увеличение содержания NE в сенсомоторной коре могло способствовать повышению активности антиноцицептивной системы [14, 19].

Впервые на данной модели ПТСР показано, что на 5-е сутки после перенесенного витального стресса у крыс развивалась аналгезия, которая ассоциировалась с повышением содержания кортикостерона в плазме крови, в сенсомоторной коре ― с увеличением содержания NE, снижением содержания HVA; в спинном мозге ― со снижением содержания NE и DOPAC.

Повышение уровней кортикостерона отражало развитие стандартной гормональной реакции на стресс.  Известно, что все гормоны гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС), включая кортикотропин-рилизинг гормон, адренокортикотропный гормон (АКТГ), глюкокортикоиды, способствуют развитию СВА [2, 3]. Следовательно, одной из причин вызванной витальным стрессом аналгезии было повышение активности ГГНС.

Увеличение содержания NE в коре отражало наличие стресса. Учитывая участие моноаминов в модуляции реакций на стресс и боль [14, 35], и выявленное повышение содержания NE в теменной коре, снижение обмена DA в коре и спинном мозге отражало вовлечение норадренергической и дофаминергической систем в реализацию вызванного витальным стрессом аналгетического эффекта.

Впервые показано, что курсовое введение ДДАВП сразу после перенесенной психической травмы, то есть в остром периоде, вызывало гипералгезию у крыс, что ассоциировалось с повышением содержания кортикостерона в крови; в теменной коре ― с повышением уровней BDNF, NE и DA; в спинном мозге ― со снижением содержания NE, DA и DOPAC.

У перенесших стресс и получивших ДДАВП крыс повышенная активность ГГНС могла быть связана как с воздействием стресса, так и введением ДДАВП. Известно, что ДДАВП, кроме рецепторов АВП 2-го типа (V2R), проявляет частичное сродство с рецепторами 1-го типа (V1aR, V1bR), активация которых приводит к высвобождению АКТГ и глюкокортикоидов [4, 36]. Показано вовлечение V1bR в вызванную стрессом висцеральную гиперчувствительность у крыс [37]. Таким образом, в условиях повышенной активности ГГНС, вызванной витальным стрессом, введение ДДАВП, возможно, посредством V1aR и V1bR, вызывало гиперактивацию ГГНС, что способствовало сенситизации к боли и формированию СВГ.

Известны анти- и проноцицептивные свойства BDNF [13]. Установлено, что выраженность и длительность стрессового воздействия влияет на экспрессию BDNF в мозге [38]. Показано повышение содержания BDNF в лобной и затылочной коре, гипоталамусе у крыс после острого стресса [38]. Известно, что увеличение экспрессии BDNF в мозге способствует адаптивной пластичности спинальных нейронов и аналгезии [13]. Показано, что при выраженном стрессе наблюдается дисбаланс экспрессии BDNF в мозге [20–22,  38–40]. Установлено, что избыточная пролонгированная экспрессия BDNF в мозге может вызвать дезадаптивные и повреждающие эффекты, которые способствуют сенсибилизации систем реагирования на стресс и боль, формированию СВГ [20–22]. Учитывая полученные результаты и данные литературы, у стрессированных крыс вызванное ДДАВП повышение содержания BDNF в коре, с одной стороны, могло вносить вклад в развитие гипералгезии, с другой стороны, возможно, не влияло на чувствительность и свидетельствовало об активации компенсаторных процессов.    

Ведение ДДАВП крысам в остром периоде витального стресса вызывало значимые изменения содержания NE и DA в теменной коре в виде повышения содержания NE в 14 раз, уровней DA ― в 3,5 раза. Известно, что выраженное пролонгированное повышение содержания NE и DA в мозге способствует развитию дисфункции антиноцицептивной системы [19,  41]. Таким образом, дисбаланс этих моноаминов в мозге мог вносить вклад в формирование гипералгезии.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 

Введение ДДАВП вызывало аналгезию, связанную с повышением содержания BDNF в коре и спинном мозге, с изменениями активности норадренергической и дофаминергической систем на супраспинальном уровне; норадренергической, дофаминергической и серотонинергической систем ― на уровне спинного мозга. На 5-е сутки после витального стресса у крыс развивалось обезболивание, что ассоциировалось с развитием стандартной гормональной реакции на стресс, с вовлечением норадренергической и дофаминергической систем на супраспинальном и спинальном уровнях. При курсовом интраназальном введении ДДАВП в остром периоде витального стресса у крыс развивалась термическая гиперестезия, повышались уровни кортикостерона в крови, содержание BDNF в сенсомоторной коре, изменялась активность норадренергической и дофаминергической систем на уровне сенсомоторной коры и спинного мозга.

Об авторах

Александра Александровна Никитина

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург.

Автор, ответственный за переписку.
Email: doknikitina@ya.ru
ORCID iD: 0009-0009-7481-6620

аспирант

Россия

Светлана Георгиевна Белокоскова

Институт экспериментальной медицины

Email: belokoskova.sg@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0002-0552-4810
SPIN-код: 4317-6620
Scopus Author ID: 6507716078

д-р мед. наук, ст. научн. сотр. Физиологического отдела им. И.П. Павлова

Россия, Санкт-Петербург

Дмитрий Сергеевич Трактиров

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург

Email: ds.traktirov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-0424-6545

аспирант, научный сотрудник Лаборатории нейрохимии

Россия

Виктория Александровна Майстренко

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург

Email: sch_viktoriya@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-7004-7873

младший научный сотрудник Лаборатории нейрохимии 

Россия

Глеб Владимирович Безнин

ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины», Санкт-Петербург

Email: beznin.gv@iemspb.ru
ORCID iD: 0000-0001-5730-4265

кандидат медицинских наук, научный сотрудник Лаборатории психофизиологии эмоций 

Марина Николаевна Карпенко

Институт экспериментальной медицины

Email: mnkarpenko@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-1082-0059
SPIN-код: 6098-2715

д-р биол. наук, заведующая лабораторией нейрохимии физиологического отдела им. И.П. Павлова

Россия, Санкт-Петербург

Сергей Георгиевич Цикунов

Институт экспериментальной медицины

Email: secikunov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-7097-1940
SPIN-код: 7771-1940

доктор мед. наук, профессор, заведующий лабораторией

Россия, 197022, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

Список литературы