FIRST RESULTS OF EXPERIMENTAL TRANSPLANTATION OF LIMBAL EPITHELIAL STEM CELLS ON FIBRIN SCAFFOLD

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Роговица является источником 3 типов стволовых клеток: лимбальных эпителиальных, стромальных и эндотелиальных. Лимбальные эпителиальные стволовые клетки (ЛЭСК) способны дифференцироваться в транзиторные амплифицирующиеся клетки, которые отвечают за регенерацию роговичной поверхности [1]. Дефицит ЛЭСК приводит к дефектам эпителия, изъязвлению, васкуляризации роговицы, хроническому воспалению и образованию конъюнктивального паннуса [2]. Лимбальная недостаточность (ЛН) представляет собой серьезное препятствие на пути приживления трансплантата, значительно увеличивая риск реакции отторжения. Вариантами хирургического лечения ЛН являются аутотрансплантация лимба со здорового глаза, аллогенная трансплантация от доноров-трупов, трансплантация аутологичных культивированных лимбальных клеток. Каждый из этих методов применяется в зависимости от вида ЛН [3-7]. ЦЕЛЬ Разработать метод трансплантации культивированных ЛЭСК на фибриновом скаффолде с использованием мягкой контактной линзы (МКЛ) при ЛН. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Все манипуляции с животными проводились в соответствии с нормативами, указанными в руководстве «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals» (Institute for Laboratory Animal Research publication (Academy Press; 1996)), с национальным стандартом РФ ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», с этическими принципами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). У взрослого кролика в условиях операционной под общей анестезией осуществляли забор лимбальной ткани. Выкраивали участок лимба протяженностью 10-12 мм, толщиной 200 мкм и шириной 2-3 мм. На парном глазу у кролика до трансплантации культивированных ЛЭСК был произведен щелочной ожог роговицы по методу Обенбергера аппликацией диска фильтровальной бумаги (в виде круга диаметром 8 мм), смачиваемой 2,5% раствором гидроксида натрия в течение 5 с. После ожога и забора лимбальной ткани проводились инстилляции антисептических препаратов (пилоксидин 0,05% 4 раза в день), антибактериальных средств (левофлоксацин 0,5% 4 раза в день), корнеопротекторов (дексапантенол 5% 4 раза в день). При посадке культуры использовали метод без предварительной ферментативной диссоциации. После образования клетками монослоя ЛЭСК снимали с поверхности пластика методом трипсинизации и пересаживали на биорезорбируемый носитель - скаффолд (рис. 1). Скаффолд формировали в виде полупрозрачной пленки из фибринового клея «Ивисел» (ООО «Джонсон и Джонсон», Россия). Клеточная культура после посадки на скаффолд прикреплялась к фибриновому клею и пролиферировала на нем, образуя монослой [8]. Далее под анестезией была выполнена трансплантация культивированных ЛЭСК на фибриновом скаффолде с применением силикон-гидрогелевой МКЛ с последующей блефарорафией. В послеоперационном периоде производились инстилляции антисептических (пилоксидин 0,05% 4 раза в день) и антибактериальных средств (левофлоксацин 0,5% 4 раза в день). Через 1 нед сняты швы, удалена МКЛ. Проводили оценку изменения роговичной поверхности методом фоторегистрации, в том числе с применением флюоресцеина. РЕЗУЛЬТАТЫ Сразу после аппликации диска фильтровальной бумаги, смоченной 2,5% раствором гидроксида натрия, наблюдались помутнение роговицы по типу «матового стекла», отек роговицы, хемоз и смешанная инъекция конъюнктивы (рис. 2а). При окрашивании флюоресцеином определялся дефект роговичной поверхности (рис. 2б). Через 1 нед после ожога интенсивность помутнения роговицы уменьшилась, началось формирование новообразованных сосудов роговицы, отмечалась тенденция к эрозированию поверхности. Скаффолд на основе фибринового клея позволил сформировать требуемую форму для лучшей адгезии трансплантируемой культуры к глазной поверхности, не отмечалось реакции иммунологического отторжения. Использование МКЛ способствовало правильному положению материала и предотвратило его смещение. После снятия швов и удаления МКЛ наблюдалась полная резорбция фибринового клея; на роговице определялась эрозия размерами 2 × 2,5 мм, заэпителизировавшаяся на следующие сутки, а также центральное помутнение и новообразованные сосуды. В течение 4 нед после трансплантации ЛЭСК поверхность роговицы была полностью заэпителизирована (рис. 3а), при окрашивании флюоресцеином тоже не было выявлено никаких дефектов (рис. 3б). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Фибриновый клей позволяет сформировать оптимальную форму скаффолда для лучшей адгезии трансплантируемой культуры к глазной поверхности, обладает свойствами биосовместимости и биодеградации, отсутствует иммунологическое отторжение. Применение трансплантата культивированных ЛЭСК позволило восстановить роговичную поверхностьна 8-йденьпослетрансплантации. Описанная технология трансплантации ЛЭСК на фибриновом клее является перспективным методом восполнения пула ЛЭСК перед кератопластикой у пациентов с ЛН.

About the authors

V I Mikhailova

Cheboksary branch of the Academician S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution

Cheboksary, Russia

A P Ponyatovskaya

Privolzhsky research medical university of the Ministry of health of the Russian Federation

Nizhny Novgorod, Russia

K A Alexandrova

Institute of advanced medical training Ministry of health of Chuvashia

Cheboksary, Russia

E N Bat’kov

Cheboksary branch of the Academician S. Fyodorov Eye Microsurgery Federal State Institution

Cheboksary, Russia

N A Pozdeyeva

Institute of advanced medical training Ministry of health of Chuvashia

Cheboksary, Russia

I V Mukhina

Lobachevsky University

Nizhny Novgorod, Russia

References

Supplementary files