COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF PROLIFERATION OF FIBROBLASTSAND FUNCTIONAL ACTIVITY OF MAST CELLS IN REGENERATION HISTOGENESISAFTER A GUNSHOT WOUND

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В последние десятилетия отмечается рост техногенных катастроф и числа локальных военных конфликтов, подтвержденных официальной статистикой ООН [1]. Используемые в современном стрелковом оружии пули калибра 5,45 (5,6) мм из-за присущей им неустойчивости полета характеризуются усложненной раневой баллистикой, определяющей особенности траектории движения ранящего снаряда в тканях. Прямое действие ранящего снаряда приводит к образованию зоны мгновенной гибели клеток и тканей (раневого канала), в результате бокового удара формируется зона молекулярного сотрясения, называемая перинекротической областью [2]. Кожа - орган, занимающий пограничное положение, всегда первым подвергается воздействию ранящего снаряда (пули, осколки) при повреждении. Интактная кожа спины крыс имеет толщину 1,2-1,4 мм, и покрыта тонким эпидермисом, состоящим из базального, промежуточного и поверхностного слоев. Под эпидермисом располагается рыхлая соединительная ткань толщиной 25 мкм. Основная часть дермы представлена сетчатым слоем, образованным плотной неоформленной соединительной тканью, имеющей протяженность до 500-550 мкм от базальной пластинки эпидермиса. Затем располагается слой рыхлой соединительной ткани толщиной около 200 мкм, под которым в соединительнотканном футляре находится кожная мышца, образованная поперечно-полосатой мышечной тканью, вокруг которой располагаются мелкие и крупные кровеносные сосуды. Толщина данного слоя составляет 190-220 мкм, толщина гиподермы - 110-150 мкм. В сетчатом слое дермы находятся волосяные луковицы и сальные железы. К основанию луковицы прикрепляется мышца, поднимающая волос, образованная гладкой мышечной тканью. Ведущим клеточным диффероном дермы является дифферон фибробластов, клетки которого в основном локализуются в субэпидермальной части, около волосяных луковиц, в наружной оболочке сосудов и в рыхлой соединительной ткани, образующей футляр вокруг кожной мышцы. Здесь встречаются малодифференцированные и юные фибробласты с крупными светлыми ядрами и большими ядрышками, много адипоцитов. Среди клеток фибробластического ряда большую часть составляют зрелые фибробласты веретеновидной формы с интенсивно окрашивающимися ядрами, что указывает на преобладание в них гетерохроматина. Образование регенерата обусловлено комплексным взаимодействием клеток - участников посттравматической регенерации. Результатом репаративного гистогенеза является формирование грануляционной ткани, трансформирующейся в адаптационном периоде в рубец. В соответствии с концепцией клеточно-дифферонной организации тканей и определением понятия «ткань» [2] решающим фактором в закрытии дефекта кожи является синтетическая активность фибробластов, образующих волокнистый компонент межклеточного вещества. Соединительные ткани кожи являются полидифферонными тканями. Ведущий клеточный дифферон - фибробластический. Рекрутирование молодых фибробластов и их предшественников к области раневого канала происходит в результате слаженной интегративной деятельности всех клеток - участниц заживления, в том числе и тучных клеток (ТК). Исследования последних десятилетий показали, что функциональный спектр участия ТК в обеспечении постоянства гомеостаза в соединительных тканях гораздо шире, чем это представлялось ранее. ТК известны как клетки, напрямую связанные с реакциями аллергического типа. В современной литературе имеются сведения об участии ТК в регенерационном гистогенезе рыхлой соединительной ткани, ангиогенезе, а также описывается их способность формировать внеклеточные ловушки, подобные нейтрофильным внеклеточным ловушкам, обеспечивая таким образом, особый способ иммунной защиты организма [3, 4]. Однако в доступных литературных источниках мало данных об участии ТК в регенерационном гистогенезе после огнестрельного повреждения. ЦЕЛЬ Дать сравнительную характеристику функциональной активности ТК и пролиферации фибробластов в различные сроки заживления огнестрельной раны кожи. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В качестве экспериментальных животных были выбраны беспородные крысы-самцы (массой 150- 200 г; 21 животное), которым под эфирным ингаляционным наркозом в складку предварительно выбритой кожи спины каудальнее межлопаточной области из пистолета Марголина пулей калибра 5,6 мм в упор через 15-20 слоев марли наносили огнестрельное повреждение. Взятие гистологического материала осуществляли через 6, 24 ч; 3, 6, 15 и 25 сут от начала опыта (по 3 животных на каждый срок). Контрольная группа (интактная кожа) - 3 животных. При работе с животными руководствовались требованиями «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985), Хельсинской декларации «О гуманном отношении к животным» (2000). Методы исследования - световая микроскопия, метод гистоавторадиографии, количественный анализ и статистическая обработка данных. Для выявления ДНК-синтезирующих клеток (за 2 ч до забоя) животным внутрибрюшинно вводили Н3-тимидин в дозе 2 мкКu/г массы. Для световой микроскопии кусочки кожи размером 0,5-1 см фиксировали в смеси Бродского: формалин (100%) - спирт (96%) - ледяная уксусная кислота в соотношении 3 : 1 : 0,3 в течение 12-18 ч при 4 °С. Заливку материала осуществляли в парафин по стандартной методике. Срезы изготавливали на ротарном микротоме толщиной 6-7 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, а также толуидиновым синим. Количественную оценку внутридифферонной гетероморфии популяции ТК производили на срезах, окрашенных толуидиновым синим. Выделяли недегранулированные и дегранулированные ТК. Среди последних выделяли клетки с разной степенью дегрануляции. Клетки, в которых цитоплазма плотно заполнена метахроматичными гранулами, считали недегранулированными. Дегранулированными клетками считали клетки, цитоплазма которых наполовину заполнена гранулами, и в которых дегрануляция идет путем экзоцитоза (т. е. в непосредственной близости от клетки находятся метахроматичные гранулы). Дифференцирующимися клетками считали клетки в состоянии накопления гранул. Морфологически в такой клетке цитоплазма наполовину заполнена гранулами, а в экстрацеллюлярном матриксе метахроматичных гранул нет. Для гистоавторадиографии препараты освобождали от парафина, высушивали и покрывали фотоэмульстей типа ПР-2 путем погружения. Препараты высушивали в течение 30-40 мин с помощью вентилятора, укладывали в светонепроницаемый ящик с силикагелем, который помещали в холодильник (4 °С). Проявление автографов производили через 4 нед, затем срезы промывали в дистиллированной воде и фиксировали в 30%-ном растворе гипосульфита (не более 6 мин). Индекс меченых ядер (ИМЯ) определяли на 1000 клеток исследуемой зоны кожи крыс. Подсчет ИМЯ проводили с учетом гистотопографии кожи (от базальной пластинки эпидермиса до глубоких слоев). Подсчет клеток производился с использованием микроскопа фирмы Carl ZEISS Primo Star (объектив 40, окуляр 10). Все измерения проводили в перинекротической области огнестрельной раны, которая представляет собой участок кожи от первого сохранившегося волосяного фолликула и распространяется центробежно на 5-6 мм от раневого канала. ТК считали в 10 полях зрения микроскопа с учетом гистотопографии кожи на разных сроках после нанесения огнестрельного повреждения. Цифровой материал обрабатывали статистическими методами с вычислением среднего значения, стандартного отклонения, ошибки средней арифметической. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента при Р < 0,05. Графики и гистограммы на основе количественной оценки популяции ТК строили с использованием Microsoft Offi ce Excel 2007. РЕЗУЛЬТАТЫ В интактной коже из числа подсчитанных преобладали дифференцирующиеся ТК, локализующиеся преимущественно рядом с кровеносными сосудами. После травмы в коже происходит гибель тканевых элементов. Массовая дегрануляция ТК приводит к увеличению проницаемости сосудов микроциркулятороного русла и миграции гранулоцитов в окружающую соединительную ткань. Количественный анализ ТК показал, что максимальное их число среди всех подсчитанных клеток регистрируется на 6 ч после ранения в глубоких слоях кожи, затем происходит их снижение в 3 раза (рис. 1). Через 24, 72 ч и 6 сут после повреждения ТК относительно равномерно распределяются во всех слоях кожи с незначительным увеличением их количества в гиподерме. К 25-м сут наблюдается увеличение количества ТК, сосредоточенных в субэпителиальном слое (рис. 2). Срочная реакция ТК на травму состоит в их массовой дегрануляции, в которую первоначально вовлекаются клетки соединительнотканного футляра кожной мышцы и гиподермы (рис. 3). Через 6 ч после повреждения количество дегранулированных ТК составляет 35,4% от общего числа их на данный срок. Через 24 ч формируется демаркационная линия - лейкоцитарный вал, отделяющий зону некроза от перинекротической области. Большинство ТК наблюдается в глубоких слоях кожи, преимущественно около кровеносных сосудов. Среди популяции ТК преобладают дегранулированные формы и свободно лежащие метахроматичные гранулы в экстрацеллюлярном матриксе. Через 72 ч после повреждения наибольшее количество ТК также наблюдается в глубоких слоях кожи. Количество дегранулированных ТК уменьшается, и вместе с тем уменьшается и количество свободнолежащих метахроматичных гранул в экстрацеллюлярном матриксе. К 6-м сут наблюдается формирование грануляционной ткани со дна раны (из глубоких слоев кожи перинекротической области), отмечается количество дегранулированных клеток как субэпителиально, так и в глубоких слоях кожи. Количество дегранулированных клеток и свободнолежащих метахроматичных гранул в экстрацеллюлярном матриксе возрастает. К 25-м сут в популяции ТК преобладают дегранулированные формы, однако они локализуются субэпителиально (рис. 4). Дифференцирующиеся ТК, находящиеся в состоянии накопления гранул, составляют 6% от общего их числа. Результаты гистоавторадиографии показали, что через 6 ч после повреждения единичные пролиферирующие клетки наблюдаются только в области соединительнотканного футляра кожной мышцы. Через 24 ч ИМЯ выше всего в глубоких слоях соединительной ткани, над кожной мышцей и в гиподерме. На 3-и сут ИМЯ максимален в соединительнотканном футляре кожной мышцы. К 6-м сут пролиферация протекает относительно равномерно во всех слоях кожи, но ее максимум регистрируется в глубоких слоях, и к 25-м сут наибольший ИМЯ клеток фибробластического дифферона регистрируется субэпителиально. Меченый тимидин включают как малодифференцированные камбиальные клетки в составе сосудов микроциркуляторного русла (периваскулярные), так и молодые свободнолежащие фибробласты. Сравнительный анализ динамики изменения популяции ТК и пролиферации камбиальных элементов фибробластического дифферона (как по срокам заживления, так и по их гистотопографии) показал, что впервые пролиферирующие клетки регистрируются через 24 ч в глубоких слоях кожи, что совпадает с максимальной концентрацией ТК в состоянии дегрануляции. В динамике заживления раны с 24 ч до 25 сут топография клеток фибробластического дифферона, находящихся в S-периоде клеточного цикла, меняется. Из глубоких слоев кожи вновь образующаяся молодая соединительная ткань заполняет раневой канал, и к 6-м сут максимум пролиферирующих клеток регистрируется в глубоких слоях кожи. К 25-м сут пролиферирующие фибробласты сохраняются в поверхностных слоях кожи так же, как и популяция ТК. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Гистологический анализ внутридифферонной гетероморфии ТК и пролиферации клеток фибробластического дифферона с позиций основных закономерностей гистогенеза является достаточно информативным для оценки процесса заживления огнестрельной раны. Данное исследование является продолжением развития учения о тканях в той его части, которая касается детального изучения внутри- и междифферонного взаимодействия тканей перинекротической области кожи и грануляционной ткани, в норме отсутствующей у человека. Грануляционная ткань является временной тканью, формирующейся во время заживления и быстро заполняющей собой раневой дефект. Количественная, топографическая, временная характеристики изменения популяции и локализации ТК в сравнительном аспекте с такими же критериями по отношению к пролиферирующим клеткам фибробластического дифферона показывают участие биологически активных веществ ТК в привлечении предшественников фибробластов к раневому ложу и регуляции их пролиферации в течение раневого гистогенеза. Необходимо использовать целый спектр новых современных методов экспериментальной гистологии, учитывать теоретические положения о камбиальных свойствах тканей, детерминации, дифференцировки, интеграции и адаптации тканевых элементов в поиске механизмов оптимизации и управления регенерационным гистогенезом. Изучение регенерационных свойств тканей следует проводить с учетом их клеточно-дифферонного состава, меж- и внутридифферонной гетероморфии и междифферонного взаимодействия. Учение о клеточно-дифферонной организации тканей с различными камбиальными свойствами может служить поиску и выбору оптимальных методов фармакологической коррекции и аппаратного воздействия на восстановительные процессы. Концепция клеточно-дифферонной организации тканей позволяет объективно оценивать пролиферацию, дифференцировку, внутри- и междифферонную гетероморфию клеток в условиях регенерационного гистогенеза. На ранних сроках заживления массовая дегрануляция ТК приводит к увеличению проницаемости сосудов микроциркулятороного русла, происходит миграция в перинекротическую область раны клеток крови и соединительной ткани, формирующих гистион воспаления, что является триггером для активации камбиальных клеток фибробластического дифферона. Внутридифферонная гетероморфия ТК и пролиферативная активность камбиальных элементов фибробластического дифферона характеризуются гетерохронией, гетероморфией и гетерокинезом. Изменения внутридифферонной гетероморфии и гистотопографии ТК могут служить одним из критериев течения регенерационного гистогенеза [5].

About the authors

V V Birina

S. M. Kirov Military Medical Academy of the Russian Defense Ministry

Saint Petersburg, Russia

I A Odintsova

S. M. Kirov Military Medical Academy of the Russian Defense Ministry

Saint Petersburg, Russia

S E Rusakova

S. M. Kirov Military Medical Academy of the Russian Defense Ministry

Saint Petersburg, Russia

References

Supplementary files