DETERMINATION OF THE MINIMUM INHIBITORY CONCENTRATION OF COLISTIN FOR TOPICAL BACTERIA IN MICROWELLS

Full Text

Введение. Проблема антибиотикорезистентности стала особо актуальной и тревожной в XXI веке. Устойчивость к антибиотикам прогнозируется как одна из самых больших угроз здоровью человека в бу- дущем. Ежегодно в мире регистрируется около 700 тысяч смертей, обусловленных антибиотикорези- стентными штаммами микроорганизмов. По расчетам британского исследования Review on Antimicrobial Resistance, если ситуация не изменится коренным образом, то смертность по этой причи- не может возрасти к 2050 г. до 10 млн человек в год. При этом бактерии все быстрее приспосабливают- ся к антибиотикам. Между тем, создание новых антибиотиков в последние годы оказалось у критической черты [12]. Особенное беспокойство вызывают случаи нозокомиальных инфекций, обусловленных гра- мотрицательными бактериями [10, 15]. В течение последних 20 лет бактерии семейства Enterobacteriaceae являются наиболее частыми воз- будителями нозокомиальных инфекций в стационарах России [1]. Причем, более 50% штаммов пред- ставлены Klebsiella pneumoniae, которые в последние годы отличаются множественной устойчивостью к антибиотикам, в особенности к β-лактамам [18]. Поэтому проблемой явлеятся тот факт, что в большин- стве протоколов лечения инфекций, обусловленных ESBL-продуцирующими штаммами, препаратами выбора остаются карбапенемы. Также к разряду наиболее значимых возбудителей нозокомиальных инфекций относятся грамотри- цательные неферментирующие бактерии: Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa [14]. По причине низкой природной чувствительности к большинству β-лактамных антибиотиков, включая пени- циллины и цефалоспорины, для борьбы с этими бактериями используют карбапенемы. Однако в на- стоящее время одной из наиболее значимых проблем при лечении инфекций, вызванных P.aeruginosa, является глобальный рост устойчивости к данной группе препаратов, обусловленный распространени- ем штаммов, продуцирующих металло-β-лактамазы [13]. Устойчивость перечисленных бактерий ко всем широко используемым классам антибиотиков (це- фалоспорины, карбапенемы, аминогликозиды, фторхинолоны) на фоне отсутствия перспективы появ- ления в ближайшие годы новых антибактериальных средств привели к возврату в начале 2000-х гг. в кли- ническую практику парентеральных полимиксинов, в том числе колистина [16]. Важной особенностью колистина является его способность изменять структуру клеточной мембраны бактерий, что приводит к ее гибели. Это отличие механизма действия колистина от других антибиотиков позволяет бороться с по- лирезистентными возбудителями в различных отделениях многопрофильных клиник [3, 4]. Причем, рези- стентность к колистину среди нозокомиальных штаммов развивается гораздо медленнее, чем к другим классам антибиотиков. Так, 77,7% штаммов Enterobacteriaceae, 97,6% P. aeruginosa и 98% A. baumannii, выделенных в стационарах России, сохранили чувствительность к колистину [6, 9]. Вместе с тем, в по- следние годы все чаще появляются сообщения о случаях устойчивости к колистину штаммов K.pneumoniae, P. aeruginosa, Acinetobacter spp при длительном и массивном назначении этого анти- биотика в повседневной клинической практике [5, 11, 17]. Поэтому крайне важно определять чувствительность к колистину у выделенных штаммов, принадле- жащих к группе с потенциальной резистентностью. Основным параметром, характеризующим отно- шение микроба к антибиотику, является величина минимальной подавляющей концентрации (МПК) препарата. Референтным считается метод последовательных микроразведений, регламентированный международным стандартом ISO 20776-1:2006 ("Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test sys- tems - Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices - Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases"). В Российской Федерации утвержден и введен в действие Национальный Стандарт ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010, который идентичен международному стан- дарту. При этом, согласно указанным документам, определение чувствительности бактерий к колисти- ну возможно только путем определения МПК. Наряду с фактом токсичности колистина имеет место не- достаток информации о фармакокинетике и фармакодинамике этого препарата в организме чело- века, особенно при различных видах системной и органной патологии [2]. Однако метод определения МПК довольно трудоемок при каждодневной постановке. Поэтому в некоторых лабораториях использу- ют различные удобные методы для определения МПК колистина. Вместе с тем, не все используемые методы дают достоверные результаты. Так, использование Етестов показало большую долю ошибок при сравнении со стандартной методикой определения МПК [8]. Результаты определения чувствительности к колистину модифицированным методом элюции диска с колистином в бульон оказались более сопос- тавимы с результатами коммерческих тест-систем [7]. Однако этот метод рассчитан на определение чувствительности к колистину только у штаммов клебсиелл, в то время как потребность в изучении этого показателя существует для целого ряда грамотрицательных бактерий, в том числе неферментирующих бактерий, таких как Acinetobacter spp и P. aeruginosa. Цель исследования: испытание набора «МПК-МИКРО. Колистин», разработанного ФБУН «НИИ эпи- демиологии и микробиологии им. Пастера», на клинических изолятах K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii. Материалы и методы. В работе использованы 8 штаммов K. pneumoniae, 7 штаммов P. aeruginosa и 7штаммов A. baumannii, выделенных при нозокомиальных инфекциях в стационарах Санкт-Петербурга. Для контроля качества определения чувствительности к колистину использованы два контрольных штам- ма: чувствительный - К+ (E. coli ATCC 25922) и резистентный - К- (E. coli NCTC 13846) к колистину. Проведение исследований с использованием указанного набора основано на методе последова- тельных двукратных разведений исследуемой культуры бактерий в микролунках, содержащих различ- ные концентрации колистина. Набор предусматривает два варианта визуальной оценки результатов: по изменению цвета среды при использовании окислительно-восстановительного или рН-индикаторов и по мутности среды. При работе со штаммами K. pneumoniae и E. coli использовали индикатор рН, а при работе с P. aeruginosa и A. baumannii использовали индикатор редокс-потенциала, входящие в состав набора. Метод предполагает оценку чувствительности штамма к широкому диапазону концентраций колистина: от 0,008 до 64 мкг/мл. Исследование проводили согласно инструкции, входящей в состав набора. Рост исследуемого микроорганизма в лунках стрипа оценивали визуально через 16 часов по изменению цвета среды по сравнению с контрольными лунками. Отсутствие видимых изменений свиде- тельствовало о подавлении роста микроорганизма. Значение МПК соответствовало наименьшей кон- центрации антимикробного препарата в лунке, где визуально не определялся рост бактерий. В качестве контрольного метода определения чувствительности указанных штаммов к колистину был выбран метод последовательных микроразведений (МПМ) в планшете. Результаты. Исследование чувствительности штаммов к колистину проводилось с соблюдением ус- ловия: изучаемые штаммы были исследованы параллельно двумя методами в один день. Результаты проведенной работы представлены в таблицах 1, 2, 3. Как видно из таблицы, отличие в результатах наблюдалось лишь в одном случае при исследовании штамма с высокой чувствительностью к колистину, где используются очень маленькие концентрации антибиотика. При исследовании чувствительности штаммов A. baumannii все результаты двух методов совпали. Проведенные исследования показали хорошую сопоставимость результатов, полученных при изуче- нии чувствительности штаммов бактерий к колистину с помощью диагностического набора «МПК- МИКРО. Колистин» и референтного метода МПМ в планшете. Преимуществами набора «МПК-МИКРО. Колистин» являются: достоверность получаемых результатов, особенно в пределах точек отсечения, удобство в использовании и простота учета результатов. Благодарности: авторы статьи выражают благодарность научному сотруднику ФБУН «НИИ эпиде- миологии и микробиологии им. Пастера» Лихачеву И.В., разработавшему диагностический набор и предоставившему его для научного исследования. Выводы: необходимы дальнейшие исследования с целью валидации данного метода в качестве дос- тупного для практических лабораторий метода определения чувствительности к колистину штаммов грамотрицательных бактерий.

About the authors

O. A Gadzhikurbanov

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

N. R Abdurakhmanov

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

N. S Loskutov

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files