USING OF MUSEOGENOMICS METHODS TO STUDY THE HISTORICAL COLLECTION OF ARGAS TICKS

Full Text

Музеогеномика (музеомика) - новая активно развивающаяся научная отрасль, связанная с рас- шифровкой генетической информации биологических объектов, хранящихся в зоологических, биологи- ческих, палеонтологических музеях мира. Одним из перспективных направлений музеомики служит ис- следование исторических коллекций клещей с целью изучения генома как самих членистоногих, так и передаваемых ими инфекционных агентов [10, 12, 13, 14, 15]. Ретроспективный анализ нуклеотидных по- следовательностей обеспечивает возможность эволюционного подхода при изучении наиболее акту- альных клещевых инфекций. В настоящее время наиболее подробно изучена группа риккетсиозов, пе- редаваемых клещами семейства Ixodidae (иксодовые клещевые боррелиозы, болезнь Лайма), оби- тающих в лесных умеренно климатических зонах. Вместе с тем, клещевые риккетсиозы, передаваемые клещами семейства Argasidae (Аргасовые клещи), обитающими в горно-пустынной местности с жар- ким климатом, изучены недостаточно. Так, до настоящего времени нет четких сведений о видах риккет- сий, вызывающих клещевые возвратные лихорадки (КВЛ, TBRF, tick-born relapsing fever) (Paster et al., 1991). Остается до конца не изученным видовой состав возбудителей клещевого возвратного тифа и роль от- дельных видов клещей рода Ornithodorus в их передаче [1, 3, 6, 7, 11]. Отсутствуют сведения о геноме возбудителей этих заболеваний, что затрудняет разработку эффективных методов их диагностики и предупреждения. Решению этих вопросов может способствовать обследование уникальной коллекции Аргасовых клещей академика Е.Н. Павловского, хранящейся на кафедре биологии Военно- медицинской академии (г. Санкт-Петербург), бессменным руководителем которой на протяжении бо- лее 40 лет являлся Е.Н. Павловский. Коллекция формировалась в период 1934-1955 гг. во время научных экспедиций по изучению краевой инфекционной патологии регионов Закавказья, Средней и Централь- ной Азии [4, 5]. Изначально коллекция создавалась как собрание живых клещей. Членистоногие парази- ты длительное время хранились при комнатной температуре в условиях естественной влажности. Это могло привести к потере значительного количества генетического материала. В настоящее время име- ются многочисленные данные о том, что нуклеиновые кислоты обладают устойчивостью во внешней среде [2, 10, 12]. Однако, в литературе недостаточно сведений о сохранности наследственного мате- риала членистоногих и возможности выявления генетических маркеров инфекционных агентов в тканях клещей, длительно хранившихся в музейных коллекциях. Поэтому для оценки научно-практической зна- чимости клещевой коллекции возникла необходимость оценить ее состояние и определить пригодность биологического материала для проведения молекулярно-генетических исследований. Цель исследования: оценить состояния образцов исторической коллекции клещей и определить при- годность биологического материала для дальнейших исследований с помощью методов молекулярно- генетического анализа. Материалы и методы. В ходе ревизии коллекции клещей состояние членистоногих оценивали по ре- зультатам визуального осмотра, с помощью микроскопии в проходящем свете (Ломо МИКМЕД 6, ка- мера xc1313), а также посредством стереомикроскопии (Leica MZ6). Видовую идентификацию члени- стоногих проводили в соответствии с общепринятыми морфологическими признаками [13, 14, 15]. Дан- ные, полученные в результате проведенной нами выборочной проверки, полностью совпали со сведе- ниями о видовой принадлежности клещей, указанными в описаниях каждой партии членистоногих. По- этому, в дальнейшем о видовом составе коллекции клещей судили на основании результатов их об- следования, проведенное специалистами в прежние годы. Молекулярно-генетические исследования проводились на базе АО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск, Россия). Материал для исследования получали путем дезинтеграции клещей. Предварительно каждый исследуемый экземпляр подвергался индивидуальной промывке в 300 мкл 96% этилового спирта путем встряхивания пробирок с образцами на шейкере в течение 5 мин. и последующего центрифугирова- ния при 1000 об/мин. в течение 2 минут. Спирт удалялся с помощью вакуумного отсасывателя. Осаж- денные фрагменты клещей промывались от остатков спирта добавлением 500 мкл физиологического раствора с последующим центрифугированием и удалением надосадочной жидкости. Дезинтеграцию фрагментов клещей и гомогенизацию исследуемого материала проводили с по- мощью набора для измельчения образцов «Матрикс-К» (АО «Вектор-Бест», Россия) и гомогенизатора «MagNa Lyser» («Roche Diagnostics», Швейцария) [9, 10]. Выделение суммарной ДНК осуществляли с по- мощью набора реагентов «РеалБест экстракция 100» (АО «Вектор-Бест», Россия). Для этого использова- ли по 100 мкл суспензии каждого образца, обработку материала осуществляли в соответствии с инст- рукцией производителя. Выявление митохондриальной ДНК (мт-ДНК) в суспензиях из тканей клещей про- водили полуколичественным методом с использованием технологии полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Исследование проводили с помощью экспериментального ла- бораторного ПЦР-теста (АО «Вектор-Бест», Россия) [8, 9]. Для выявления ДНК-маркеров возбудителей клещевых инфекций использовали коммерческие набо- ры реагентов «РеалБест ДНК Rickettsia species», «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.», «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi» (АО «Вектор-Бест», Россия), а также экспериментальные разработки того же произ- водителя для детекции генетических маркеров Coxiella burnetii и Francisella tularensis [2, 8, 9]. Амплифи- кацию генетического материала и учет результатов реакции осуществляли с помощью амплификатора с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени «CFX 96» («Bio-Rad», США). Результаты и обсуждение. Ревизия клещевой коллекции показала, что сбор материала проводился на территории регионов Средней и Центральной Азии. Основная часть материала была собрана в пе- риод с 1934 по 1945 годы. При этом большая часть материала поступила в коллекцию с территории Уз- бекистана, Туркмении и Ирана. В качестве мест обитания клещей обследовались норы полевок, сусликов, лисиц, места обитания черепах, дикобразов, летучих мышей, а также кошары и другие помещения для содержания домашних животных, хозяйственные постройки, стойбища чабанов, жилые сооружения. Партии клещей, собранных в каждом из обследованных мест, помещались в отдельные пробирки. Каждая партия членистоногих снабжалась описанием, в котором указывалось дата и место сбора, количество и вид клещей. В настоящее время коллекция включает 580 лотов (партии клещей, собранных в одном месте), на- считывающих более 15000 экземпляров членистоногих, среди которых преобладают клещи Ornithodorus papillipes. Помимо этого, в материалах коллекции присутствуют такие виды членистоногих, как Ornithodorus tartakovsyi, Ornithodorus lahorensis, Ornithodoros verrucosusа, Argas persicus, Hyalomma anatolicum. Таким образом, в ходе проведенных исследований установлено, что коллекция имеет удовлетвори- тельное состоянии. Образцы сохранили основные морфологические признаки, необходимые для уточ- нения видовой принадлежности клещей, и пригодны для дальнейшего обследования. В ходе ревизии материалы коллекции были учтены и систематизированы, информация о каждой партии членистоногих внесена в электронную базу данных. В результате проведенного нами обследования среди музейных образцов жизнеспособных клещей не выявлено. Большинство клещей сохранили характерный внешний вид. Лишь в некоторых партиях об- наружены частично фрагментированные экземпляры членистоногих (отрыв конечностей, частичная фрагментация тела и др.). С целью определения сохранности нуклеиновых кислот проведено обследование 48 экземпляров коллекционных клещей O. papillipes, собранных в период с 1936 по 1945 гг. на территории Армении, Да- гестана, Грузии, Ирана, Киргизии, Туркмении, Узбекистана, Таджикистана. В ходе оценки содержания в пробах нуклеиновых кислот установлено, что во всех случаях кривые накопления флуоресценции при амплификации внутреннего контрольного образца ВКО имели S-образный (сигмовидный) профиль, а показатель Ct не превышал пороговых значений. Это свидетельствовало о пригодности выбранной ме- тодики обработки клещей с целью пробоподготовки материалов исторической коллекции для молеку- лярно-генетических исследований. Анализ кривых накопления флуоресценции при амплификации консервативного участка митохонд- риальной ДНК клещей показал, что при обследовании музейных образцов, хранившихся в течение 70-80 лет, Ct превышал пороговое значение и составлял от 30 до 40 циклов амплификации. Вместе с тем при обследовании клещей, собранных в последние годы, этот показатель составлял 14-20 циклов. Это позво- ляет сделать предположение о частичной деградации мтДНК, которая могла произойти в процессе дли- тельного хранении биологического материала. Полученные результаты также свидетельствуют о том, что несмотря на некоторое снижение содержания общей ДНК музейные образцы пригодны для дальней- ших исследований и изучения генома клещей. Анализ кривых накопления флуоресценции при амплификации маркерных участков бактериальной ДНК показал, что во всех случаях Ct превышал пороговое значение и составлял от 32 до 44 циклов ам- плификации. Это может свидетельствовать о частичной деградации бактериальной ДНК в музейных об- разцах. Полученные результаты также свидетельствуют о том, что несмотря на некоторое снижение со- держания неизмененной общей ДНК музейные образцы пригодны для использования в дальнейших ис- следованиях генома возбудителей клещевых инфекций. Выводы. Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют об эффективности молекулярно-генетических методов при исследовании исторической коллекции клещей. Полученные данные подтверждают высокую научную значимость и актуальность коллекции Аргасовых клещей, соб- ранных в период 1934-1954 гг. в ходе экспедиций сотрудников Военно-медицинской академии под руко- водством академика Е.Н. Павловского. Биологический материал сохранился в хорошем состоянии и пригоден для проведения молекулярно-генетических исследований. Образцы содержат фрагменты нуклеиновых кислот возбудителей клещевых инфекций, которые могут идентифицироваться посредст- вом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

About the authors

D. D Glushenko

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

P. A Soloveva

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

A. I Rakin

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files