DIAGNOSTICS OF HERPESVIRUS INFECTIONS USING «LINE-BLOT HHV-PROFILE-IG G»

Full Text

Введение. Герпетические инфекции (ГИ) - это болезни, характеризующиеся одиночными или сгруп- пированными везикулярными высыпаниями величиной 1-4 мм на коже и/или слизистых оболочках на отечно-эритематозном основании, протекающие с поражением внутренних органов. В соответствие с современной классификацией семейство Herpesviride в настоящее время насчиты- вает около 120 видов ДНК-вирусов, подразделяемых на 3 подсемейства: α-, β- и γ- герпесвирусов [3]. Восемь представителей герпесвирусов являются патогенными для человека: из подсемейства α- вирусы простого герпеса 1 и 2 типа (НSV-1 и НSV-2 или human herpes virus - ННV-1 и ННV-2), вирус ветряной оспы и опоясывающего герпеса (VZV или ННV-З), из β-подсемейства - цитомегаловирус (СМV или ННV-5), вирус герпеса 6 типа (ННV-6), который является возбудителем внезапной экзантемы, ассоциирующийся с синдромом хронической усталости, и вирус герпеса 8 типа (ННV-8), причастный к возникновению саркомы Капоши. Данная тема является весьма актуальной, так как согласно данным Всемирной организации здраво- охранения (ВОЗ) отмечается высокая инфицированность населения герпесвирусной инфекцией, осо- бенно за последние десятилетия, что составляет от 60 до 95% всей популяции земного шара [4]. Кроме того, заболевания, вызываемые герпесвирусами, занимают 2 место после гриппа в качестве причины смерти от вирусных инфекций, данный показатель достигает 15,8%. Герпесвирусная инфекция харак- теризуется частыми рецидивами (20%) у определенной группы пациентов в периоды ослабления защит- ных сил организма (простуды, авитаминозы и др.), что приводит к клиническим поражениям систем ор- ганов, развитию нейроинфекции с высоким уровнем инвалидизации (50%) и летальных исходов (20%) [5, 6]. Для НSV, СМV, ЕВV, ННV-8, а также, возможно, ННV-6 типов герпесвирусных инфекций доказана высо- кая онкогенная активность [7]. Представителей герпесвирусов (НSV, СМV) относят к возбудителям инфекций ТОRСН - группы, спо- собные при поражении беременных приводить к развитию внутриутробных инфекций, поражениям эмбрионов, гибели плодов и новорожденных. Герпесвирусная инфекция характеризуется скудной клинической картиной, что обуславливает необ- ходимость проведения специфичных лабораторных методов, которые направлены на выявление в крови маркеров иммунного ответа и оценку их концентрации [1]. Данное исследование предназначено для скрининговой диагностики. Оно заменяет поведение не- скольких лабораторных исследований в формате иммуноферментного анализа (ИФА) одним - в формате линейного иммуноблоттинга, проводимых с целью определения в биологических образцах специфических антител к каждому виду герпесвируса (до 8-9 самостоятельных ИФА исследований) [2]. Цель исследования. Оценить возможность и эффективность применения нового отечественного на- бора реагентов «Лайн-Блот ВГЧ-профиль-Ig G» для одновременного мультиплексного обнаружения анти- тел класса G к антигенам основных возбудителей герпесвирусных инфекций человека. Материалы и методы. В качестве исследуемого материала использовались сыворотки крови 11 боль- ных в возрасте от 22 до 82 лет (64% женщин, 39% мужчин) с хроническими заболеваниями желудочно- кишечного тракта из Санкт-Петербургского Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, где было осуществлено обследование на иерсиниозы (отрицательный результат). Исследование пациентов на обнаружение антител класса G к антигенам основных возбуди- телей герпесвирусных инфекций проводились на кафедре микробиологии Военно-медицинской ака- демии имени С.М. Кирова. Для лабораторной диагностики герпесвирусных инфекций использовался «Набор реагентов для одно- временного мультиплексного выявления антител класса G к антигенам возбудителей герпесвирусных инфекций человека: вируса простого герпеса 1 и 2 типов, вируса Варицелла Зостер, вируса Эпштейна Барра, цитомегаловируса, вирусов герпеса человека 6-го и 8-го типов методом линейного иммуноблот- тинга (ЛИБ) “Лайн - Блот ВГЧ-профиль-IgG“». Состав и комплект набора включает: 1. Иммуносорбент - полоски (стрипы) из нитроцеллюлозной мембраны, на каждую из которых в виде поперечных линий нанесены нативные или рекомбинантные аналоги антигенов НSV-1, НSV-2, VZV, VZV gE, EBNA, ЕА, EA, СМV, ННV-6В и ННV-8, а также две контрольные линии: линия с минимальной интенсивно- стью окрашивания («Cut off») и контроль внесения образца (К). 2. Конъюгат - антитела козьи к IgG человека, конъюгированные со щелочной фосфатазой в стабили- зирующем растворе; прозрачная слегка пенящаяся жидкость фиолетового цвета. 3. Раствор для разведения образцов (РРО) - мутная, слегка пенящаяся жидкость зеленого цвета. 4. 10-кратный концентрат промывочного раствора [ПР (х10)] - прозрачная пенящаяся жидкость желтого цвета. 56. Субстратный раствор (СР) - прозрачная жидкость светло-зеленого цвета. . Пинцет пластиковый. Принцип действия (рис. 1) При наличии в исследуемом образце антител к возбудителям герпесвирусных-инфекций человека они связываются с антигенами иммуносорбента. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело связы- ваются с конъюгатом - козьим антителом IgG человека, меченным щелочной фосфатазой, и выявляются по цветной реакции с хромогеном (субстратный раствор), которая приводит к появлению в соответст- вующих зонах стрипа окрашенных линий. Интенсивность их окрашивания пропорциональна содержа- нию антител класса G в исследуемой пробе. Оборудование и материалы (для «ручной» постановки): Дозаторы пипеточные (пипетки полуавтоматические одно- и многоканальные переменного объема) -для внесения реагентов в канавки ванночки с погрешностью дозирования не более 5% с наконечниками полипропиленовыми одноразовыми. ----Ручные промыватели для промывания канавок ванночки. Центрифуга лабораторная на 2,5-3,0 тыс. об/мин. Холодильник. Автоматическое качающее устройство: шейкер-качалка с углом наклона платформы 6-8° и часто- той качания 20-60 об/мин. -----Фильтровальная бумага. Мерные стаканы вместимостью от 25 до 500 мл. Вода очищенная (дистиллированная). Система для автоматизации иммуноблоттинга. 70% раствор спирта этилового и 6% раствор перекиси водорода (дезинфицирующие растворы). Приготовление рабочего промывочного раствора (ПР): Содержимое флакона с 10-кратным концентратом промывочного раствора ПР (х10), 22мл необходи- мо перелить в мерную ёмкость вместимостью 500 мл. Водой очищенной, в количестве 220 мл, довести объём жидкости до метки; тщательно перемешать. Проведение анализа: 12. Подготовить необходимое количество ванночек. . Пинцетом извлечь из контейнера по одному стрипу и поместить в канавки ванночки маркированной стороной вверх. Внести в каждую канавку по 1 мл раствора для разведения образцов (РРО), выдержать -5 мин при встряхивании на шейкере с частотой качания 40-50 об./мин. при температуре от 18 до 25°С. 334. Отдельными наконечниками внести по 20 мкл исследуемых образцов сывороток крови. . Заклеить занятые канавки клейкой пленкой и поместить ванночку на шейкер. Инкубировать 2 ч при температуре от 18 до 25°С. 56. За 5-10 мин до окончания инкубации приготовить рабочий промывочный раствор. . После инкубации удалить жидкость из канавок ванночки, используя автоматическую пипетку или ас- пиратор, в емкость, содержащую дезинфицирующий раствор. . Промыть каждый стрип 4 раза рабочим промывочным раствором, внося в каждую канавку по 2 мл раствора. 78911. Во все использованные канавки ванночки внести по 1,0 мл конъюгата. . Инкубировать в течение 30 мин при температуре от 18 до 25°С на шейкере. 0. После инкубации удалить жидкость из канавок ванночки. Промыть стрипы. 1. Внести во все использованные канавки по 1,0 мл субстратного раствора. Инкубировать 15 мин. на шейкере в защищенном от света месте при температуре от 18 до 25°С до появления не стрипе окра- шенных линий. 12. Для остановки реакции удалить субстратный раствор. Промыть стрипы 4 раза, внося в канавки по 2 мл воды очищенной и выдерживая ванночку в течение 1 мин на шейкере. 3. Поместить стрипы между двумя листами фильтровальной бумаги маркированной стороной вверх 1и выдержать в защищенном от света месте до полного высыхания, после чего сразу же зарегистриро- вать результаты. Результаты. Уникальность метода линейного иммуноблоттинга заключается в высокой информатив- ности и достоверности получаемых результатов (рис. 2). У пациентов были обнаружены три типа герпесвирусов. Результат проведенного исследования пред- ставлен в таблице (табл.1). IgG к VCA (к капсидному антигену) - появляются в крови спустя 1-2 месяца от начала болезни, затем показатель постепенно снижается и сохраняется на пороговом (низком уровне) пожизненно, реконва- лесценция вируса Эпштейн-Барр. Обнаружение IgG к VCA в высоких титрах характерно для активации хронической инфекции данного вируса. IgG к NA-1 (к ядерному антигену) - являются поздними, поскольку появляются в крови через 1-3 месяца после начала заболевания. Продолжительное время (до 12 мес.) их титр достаточно высокий, а затем титр снижается и сохраняется на пороговом (низком) уровне пожизненно. Реактивация хронической инфекции или рецидив острой инфекции наблюдается при высоких титрах IgG к NA антигену. Антитела класса IgG к СМV (цитомегаловирусу) - специфические иммуноглобулины, вырабатываю- щиеся в организме человека в период выраженных клинических проявлений цитомегаловирусной ин- фекции и являющиеся серологическим маркером этого заболевания, а также перенесенной в про- шлом цитомегаловирусной инфекции. При сравнительной характеристике больных герпесвирусная инфекция была обнаружена у женщин после 50 лет. Для более объективной оценки результатов диагностических тестов «Лайн-Блот ВГЧ-профиль-Ig G» не- обходимо дополнительно провести тест на определение антител класса M к возбудителям герпесви- русных инфекций человека. С учетом результатов 2ух показателей (антитела класса M и G), а также клинических данных лечащего врача можно сделать окончательный вывод. Тест следует повторить через 4-12 недель либо проверить эти образцы другим методом анализа. Вывод. Благодаря развитию и постоянному совершенствованию методов диагностики инфекций поя- вилась возможность быстрого определения типа вируса герпеса, что позволяет уточнить особенности патогенеза заболевания, разработать методы профилактики, программы терапии и предупреждения рецидивов, а также провести дифференциальную диагностику.

About the authors

Yu. V Shvets

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

V. V Malyshev

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files