INFLUENCE OF PLATELET-RICH PLASMA ON REPAIR CORNERAL REGENERATION

Full Text

Помутнение роговицы вследствие травм или воспалительных заболеваний различной этиологии в 33-40% случаев приводит к инвалидизации по зрению. При этом монокулярная слепота после травм, эрозий и язв роговицы, ежегодно в мире является исходом у 1,5-2 млн. человек [1, 2]. В этой связи по- прежнему остается актуальной проблема зрительной реабилитации пациентов с травматическими, воспалительными и дегенеративными заболеваниями роговицы. Среди воспалительных заболеваний переднего отрезка глаза особого внимания заслуживают хронические эрозии роговицы. Эти эрозии разделяют на 2 группы: персистирующую эрозию роговицы (ПЭР), при которой хронический воспалительный процесс характеризуется длительным и спонтанным нарушением эпителизации и рецидивирующую эрозию роговицы (РЭР), при которой эрозия может эпителизироваться, но из-за отсутствия комплекса адгезии между клетками и боуменовой мембраной неоднократно рецидивирует [3]. Несмотря на успехи современной офтальмологии хронические эро- зии роговицы трудно поддаются лечению и почти всегда приводят к значительному понижению остроты зрения [2, 4]. Вместе с тем, современные представления о патогенезе ПЭР и РЭР свидетельствуют о том, что независимо от этиологии, главной причиной развития заболевания является неполноценность базальной мембраны и несостоятельность «комплекса адгезии» эпителия к боуменовой мембране, поэтому ос- новной целью лечения ПЭР является стимуляция репарации и регенерации, а так же восстановление полноценного «комплекса адгезии» базальной мембраны [1-6]. Применение фетальных клеток эпителия и кератобластов [7], амниотической мембраны [8], а так же обогащенной тромбоцитами плазмы (ОбТП) [9] на сегодняшний день представляются наиболее перспективными подходами к лечению пациентов с хроническими эрозиями роговицы. ОбТП представляет собой концентрат, содержащий до 1000 х 109 кл/л, т. е. в 3-4 раза больше, чем в неразбавленной крови. Тромбоциты человека, в свою очередь, обладают выраженным регенератор- ным эффектом за счет альфа-гранул, которые являются естественным депо факторов роста: тромбо- цитарного фактора роста (PDGF), трансформирующего фактора роста (TGF-в), инсулиноподобный фактор роста (IGF-I, IGF-II), фактора роста фибробластов (FGFb), эпидермального фактора роста (EGF) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [9], влияющих на восстановление поврежденного эпи- телия за счет усиления процессов пролиферации, миграции и дифференцировки эпителиальных кле- ток [9]. Вместе с тем, ОбТП содержит не только факторы роста, но и адгезивные молекулы (фибрин, фибронектин и витронектин) и цитокины, стимулирующие репарационные и анаболические процессы в поврежденных тканях, а также обладающие противовоспалительным эффектом [10]. Поскольку ОбТП является производным собственной крови пациента, ее использование не сопря- жено с риском парентеральной передачи инфекций, таких, как ВИЧ или гепатит. Применение ОбТП не вызывает гиперпластических процессов, канцерогенеза или роста опухолей, так как факторы роста влияют на рецепторы, расположенные в клеточной мембране, а не в ядре клетки [9, 10]. Таким образом, лечебный эффект от инстилляций ОбТП, за счет находящихся в ней факторов роста, адгезивных молекул и растворенного фибрина, может быть основан на более быстром фор- мировании нормального «комплекса адгезии» между эпителием и боуменовой мембраной. Однако для проверки этой гипотезы требуются дополнительные экспериментальные исследования. Цель исследования: оценить клинико-морфологические особенности регенерации роговицы в ответ на применение обогащенной тромбоцитами плазмы в условиях экспериментальной хронической эрозии роговицы. Достижение цели предполагало решение следующих задач: 1. Создать стандартизированную и воспроизводимую модель экспериментальной хронической эрозии роговицы. 2. Оценить клинико-морфологические особенности регенерации роговицы в ответ на примене- ние ОбТП в условиях ЭХЭР. Материалы и методы. Работа выполнена на 12 кроликах породы Шиншилла (24 глаза) возрастом 1-2 года, весом 2-3 кг, соматически здоровых, без глазных патологий, содержавшиеся в одинаковых ус- ловиях вивария. Исследования проводили в два этапа. На первом этапе всем животным воспроизводили модель экспериментальной хронической эрозии роговицы при помощи энергии ультрафиолетового (УФ) излу- чения [3, 4]. Для этого под биомикроскопическим контролем при помощи операционного микроскопа после предварительной местной (инстилляционной и ретробульбарной) анестезии сначала выполняли тотальную деэпителизацию роговицы, качество которой оценивали с помощью 2% раствора флуорес- цина натрия, а затем при помощи контактной диафрагмы необходимого диаметра и длинноволновой ультрафиолетовой установки (длина волны 365 нм, мощность 90Вт) выполняли локальное облучение ро- говицы в необходимой области в течение 45 минут на расстоянии 20 см. Предложенный нами способ позволяет воспроизвести это патологическое состояние в эксперименте и препятствовать эпителизации роговицы в зоне УФ-облучения вплоть до 30-х суток эксперимента. На втором этапе всех животных разделили на три группы (по 4 кролика в каждой). К животным первой группы (контрольной) терапевтическое воздействие не применялось. Животным основной группы (ОГ) назначалась терапия ОбТП: в I-й ОГ проводили инстилляцию по 1 капле через 1 мин. в течение 10 мин. (10 капель) однократно; во II-й ОГ лечение проводили по описанной выше методике 1 раз в сутки в течение 5 дней. ОбТП получали путем забора 20 мл крови из краевой вены уха кролика в стерильные пробирки с 3,8% раствором цитрата натрия. После этого кровь перемещали в стерильную пробирку для получения ОбТП, центрифугировали в течение 4 мин. при 3500 об/мин. Далее производили забор фракции плазмы и инстилляцию. Хранение ОбТП осуществляли в условиях гипотермии (при t+4, +6°C) не более 5 суток. Оценку результатов проводили на 1-е, 3-и, 5-е, 7-е, 9-е, 11-е, 14-е, 20-е, 30-е, 40-е, 86-е сутки под операционным микроскопом МХ-ОФ 3 ЛОМО с выборочной фоторегистрацией. С помощью биомикроскопии оценивали наличие и степень помутнения ,площадь деэпителиза- ции и степень васкуляризации роговицы. Для количественной оценки площади деэпитализации роговицы, хода ее регенерации использо- вали методику, предложенную М.В. Сухининым [4]. Создали проекционную циркулярную сетку, в кото- рой площадь каждой ячейки составляла 0,3%. Сетку помещали на цифровой фотоснимок фронталь- ной проекции роговицы и по сумме площади ячеек, прокрашиваемых флюоресцеином, судили о площади деэпителизации роговицы. Интенсивность помутнения роговицы оценивалась по 10-бальной шкале Войно-Ясенецкого В.В.: 1- 2- прозрачная, 3 - почти прозрачная, 4-5 - полупрозрачная, 6-10 - мутная [1]. Степень неоваскуляризации роговицы оценивалась по 4-бальной шкале Inatomi, в зависимости от длины новообразованных сосудов в баллах: 0 - отсутствие сосудов, 1 - до 2 мм, 2 - до 4 мм, 3 - до 6 мм 5]. [Для оценки морфологических особенностей регенерации роговицы на 30-е сутки проводили гис- тологическое ее исследование с окрашиванием гематоксилин-эозином. Результаты. По данным биомикроскопической картины глазной поверхности во всех группах по- сле 45-минутного УФ-воздействия отмечали равномерное глубокое помутнение стромы роговицы по типу «облачка» за счет ее отека. Эпителизация периферических участков роговицы в КГ, отмечалась с 3- х суток в виде концентрического нарастания эпителия, площадь деэпителизации охватывала 81,5%. На 7- е сутки отмечали обильную васкуляризацию стромы роговицы со стороны прилежащего лимба, пло- щадь деэпителизации составила 51,5%. Зафиксирован рост новообразованных сосудов до параопти- ческой зоны, который по шкале неоваскуляризации Inatomi составил 2 балла, а также сохранение рав- номерного помутнения стромы по типу «облачка» в области облучения, которое по шкале Войно- Ясенецкого оценили в 4 балла. На 14-е сутки в центре роговицы сформировалась стойкая эрозия, пло- щадь деэпителизации составила 28,8%. А так же отмечали незначительное уменьшение помутнения роговицы (3 балла), при этом неоваскуляризация роговицы определялась до места дефекта эпителия (3 балла). На 20-е сутки область деэпителизации сохранялась в виде эрозии в центре (7,5%), неоваску- ляризация сохранялась на всей поверхности роговицы (3 балла). Дальнейшее наблюдение показало замедление эпителизации с 30-х суток, отмечено активное врастание в прозрачную строму роговицы сосудов со стороны неповрежденного при УФ-воздействии лимба. Однако после эпителизации рогови- цы до 86 суток сохраняется помутнение в области облучения, а также воспалительный инфильтрат. В I-й ОГ после инстилляции ОбТП в течение 1 суток наблюдалось значительное ускорение процес- сов репарации. На 3-е сутки площадь деэпителизации составила 99,8% и достоверных отличий с КГ не имела. К 9-м суткам, аналогично КГ наблюдалось значительное сокращение площади деэпителизации (до 5,9%), однако на 11-е сутки отмечали рецидив в виде увеличения площади эрозии до 22,5%, неова- скуляризация достигала места эрозии (3 балла), незначительное уменьшение помутнения роговицы (3 балла). Отсутствие эпителиального дефекта отмечали с 20-х суток эксперимента наряду с сохранени- ем неоваскуляризации по всей поверхности роговицы (3 балла) и помутнением в области облучения до 30-х суток. Гистологическое исследование в I-й ОГ выявило нарушение гистоархитектоники роговицы, в поверхностных и глубоких слоях стромы наблюдались новообразованные сосуды, тканевой отек, воспа- лительная инфильтрация, а также области с нефиксированным к боуменовой мембране эпителием или наличием между ними соединительнотканных депозитов. Во II-й ОГ наблюдался полный регресс дефектов эпителия. Так на 3-е сутки эксперимента опре- делялось равномерное глубокое помутнение стромы роговицы по типу «облачка» (5 баллов) за счет ее отека, деэпителизация с прокрашиванием раствором флюоресцеина натрия охватывала 83,5%. На 5-е сутки площадь деэпителизации значительно сократилась и составила 63,9%. На 7-е сутки отмечали незначительную васкуляризацию роговицы (1 балл), отсутствие помутнения стромы, площадь деэпителизации составила 18,4%. На 9-е сутки регистрировали отсутствие эпители- ального дефекта, новообразованных сосудов, а также помутнения роговицы. Гистологически на 30-е сутки определялся нормальный, плотно адгезированный к боуменовой мембране, многослойный нео- роговевающий эпителий, строма имела упорядоченное строение без признаков воспаления. Таким образом, лечебный эффект после инстилляций ОбТП в течение 5 суток основан на более быстром формировании нормального «комплекса адгезии» между эпителием и боуменовой мем- браной. При этом ОбТП применяемая в условиях экспериментальной хронической эрозии роговицы оказывает многофакторное влияние на процессы заживления роговичных тканей, за счет находящихся в ней факторов роста, адгезивных молекул, цитокинов и растворенного фибрина. В результате чего вос- станавливается типичный для роговицы эпителий (по пути репаративной регенерации). Этот процесс носит гистотипический характер - восстанавливается исходный тип ткани. Выводы: 1. Разработанный способ формирования рецидивирующей эрозии роговицы позволяет воспро- извести это патологическое состояние в эксперименте и препятствовать эпителизации роговицы в зоне УФ-облучения вплоть до 30-х суток эксперимента. При этом купирование воспаления и завершение эпи- телизации облученного участка становится возможным только после подрастания к нему поверхностных сосудов. 2. Лечебный эффект после применения ОбТП в условиях экспериментальной хронической эро- зии роговицы, за счет находящихся в ней факторов роста, адгезивных молекул и растворенного фибри- на основан на реформировании нормального «комплекса адгезии» между эпителием и боуменовой мембраной и многофакторном стимулировании репаративной регенерации, в результате чего вос- станавливается типичный для роговицы эпителий.

About the authors

V. A Tarabrina

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files