Morphological Remodeling of the Spinal Cord After Experimental Neurotmesis with Early Ipidacrine Administration: An Electron Microscopy Study

全文:

Актуальность

Значительная распространенность травм периферической нервной системы в мирное и особенно в военное время, частая инвалидизация пациентов, получивших такие травмы, и длительные сроки стационарного лечения определяют медико-социальную значимость этих повреждений. Трудности ведения пациентов с данной патологией связаны с тем, что, несмотря на достигнутые успехи в понимании механизмов регенерации периферических нервов, не до конца обоснованы с фундаментальной точки зрения терапевтические подходы к восстановлению структуры и функции поврежденной нервной ткани. В связи с этим терапевтическая эффективность проводимой терапии напрямую зависит от степени изученности особенностей изменений нервной системы на разных уровнях при травмах нервов, которые исследовались нами ранее [1].

Известно, что после перерезки нервного ствола помимо валлеровской дегенерации периферического отростка поврежденного нерва патологические изменения происходят и в вышележащих отделах нервной системы (спинномозговых ганглиях, спинном мозге и в надсегментарных образованиях) [2]. Повреждение нервных волокон вызывает реактивные изменения как в проксимальной части аксона (в «родительском» нейроне), так и в ближайших нейронах, имеющих связи с поврежденными, что связано с нарушением ретроградного транспорта трофических факторов [2–4].

Однако до сих пор неясно, по каким закономерностям протекают и распределяются ретроградные изменения после повреждения периферического нерва. Известно только, что эти процессы носят неравномерный и непостоянный характер, имеют индивидуальные особенности и зависят от объема и уровня аксональной травмы, кровоснабжения поврежденного сегмента конечности и возраста пострадавшего. Кроме того, не установлен преимущественный тип гибели нейронов в ранние сроки после аксонотомии (по типу некроза или апоптоза), а это имеет огромное значение для клинической практики, поскольку изучение ретроградных изменений нервной системы, вызванных аксонотомией, и применение обоснованных медицинских стратегий, способствующих сохранению функционального состояния сегментарного аппарата спинного мозга, могут улучшить регенераторный и коллатеральный спрутинг и результаты лечения [5, 6].

Ранее нами было установлено положительное влияние магнитной стимуляции и ипидакрина на процессы адаптивной нейропластичности и регенерации нерва через месяц лечения после травматической невропатии [7]. Однако на сегодняшний день недостаточно работ о морфологических изменениях поясничного сегмента спинного мозга после невротмезиса при раннем приеме ипидакрина. В связи с этим и было предпринято настоящее исследование.

Цель исследования: изучение закономерностей сегментарных спинальных реактивных изменений при невротмезисе для усовершенствования стратегии и тактики лечения больных с данной патологией путем сравнительного анализа ретроградных патоморфологических изменений поясничного отдела спинного мозга после экспериментального невротмезиса на ранних сроках терапии ипидакрином и без нее.

Материалы и методы

Избранная нами модель травматической невропатии с развитием невротмезиса похожа на повреждения, возникающие вследствие воздействия острых режущих предметов или огнестрельных ранений, с учетом проведения первичной хирургической обработки раны.

Процесс создания экспериментальной модели включал несколько этапов, которые осуществлялись хирургическим путем [7]. Для электронно-микроскопического исследования для каждой группы было отобрано по 3 самца крыс Wistar.

В одной группе животные получали ежедневно внутримышечно в дозе 0,07 мл антихолинэстеразный препарат — ипидакрин после 7 сут от момента операции в течение 7 дней, что эквивалентно его клиническому применению. В другой группе данный препарат не использовали.

Взятый из соответствующего сегмента поясничного отдела спинного мозга материал для электронной микроскопии подготавливали и обрабатывали по стандартным методикам [8]. Ультратонкие срезы контрастировали, и после изучения в трансмиссионном микроскопе JEM-100CX (Япония) полученные электронограммы сканировали и описывали.

Результаты

В контрольной группе в структуре спинного мозга на уровне поясничного сегмента было выявлено преобладание нейронов с плотной структурой ядра и цитоплазмы — гиперхромных нейронов. Количество митохондрий в них было увеличено, однако многие из этих нейронов имели нечеткую структуру, что свидетельствует об их низкой функциональной активности (рис. 1). Вокруг таких нейронов миелиновые и немиелинизированные волокна были сильно изменены.

 

Рис. 1. Гиперхромный нейрон спинного мозга крысы без лечения: 1 — ядро; 2 — митохондрии (стрелка), ×8 300.

Fig. 1. Hyperchromic neuron rat spinal cord without treatment: 1 — nucleus; 2 — mitochondria (arrow), ×8,300.

 

Также в небольших количествах были обнаружены нормохромные нейроны. Они имели светлые ядра с диффузным распределением хроматина и иногда с плотными неактивными ядрышками. Их цитоплазма была заполнена расширенными канальцами гранулярной эндоплазматической сети (ЭПС), а иногда и плотными липидными включениями. Вокруг ядра в этих нейронах находилось много рибосом, а большинство митохондрий имело типичную структуру матрикса и крист.

Все это свидетельствует о морфологической и функциональной реактивности нейронов. В нервных волокнах, расположенных рядом, были обнаружены умеренные изменения осевых цилиндров и миелиновых оболочек (рис. 2).

 

Рис. 2. Нормохромный нейрон спинного мозга крысы без лечения: 1 — ядро; 2 — миелиновое волокно, ×5 000.

Fig. 2. Normochromic neuron rat spinal cord without treatment: 1 — nucleus; 2 — myelin fiber, ×5,000.

 

В группе без лечения в ядрах некоторых олигодендроцитов (ОДЦ) была обнаружена характерная для апоптоза локализация хроматина. Вокруг них располагались миелиновые и немиелинизированные волокна, которые были изменены в различной степени (рис. 3). Эта структура ОДЦ указывает на то, что они потеряли свою функциональную активность в результате гибели по типу апоптоза.

 

Рис. 3. Олигодендроцит спинного мозга крысы без лечения с признаками апоптоза: Я — ядро с неравномерными и плотными скоплениями гетерохроматина в кариоплазме; МВ — миелиновые волокна (стрелки), ×10 000.

Fig. 3. Oligodendrocyte rat spinal cord without treatment with signs of apoptosis. Я — nucleus with uneven and dense accumulations of heterochromatin in the karyoplasm; МВ — myelin fibers, ×10,000.

 

Спустя неделю после начала терапии ипидакрином в основной группе были выявлены мелкие нейроны со светлыми ядрами, извилистыми границами и несколько измененной структурой хроматина. Их цитоплазма была наполнена различными органеллами, среди которых преобладали митохондрии. Также можно было заметить канальцы гранулярной ЭПС и комплекса Гольджи (рис. 4). Такая структура нейронов свидетельствует об их высокой функциональной активности. Наряду с нормохромными (активными) нейронами в поясничном отделе спинного мозга крыс основной группы, хотя и реже, чем в контрольной, встречались гиперхромные нейроны с диффузным распределением гетерохроматина в ядрах и крупными ядрышками. Эти нейроны находились в состоянии пониженной функциональной активности. Также в спинном мозге крыс основной группы были выявлены светлые нейроны, находящиеся в процессе внутриклеточной репарации. Об этом свидетельствовало наличие большого количества рибосом и единичных митохондрий в их цитоплазме при отсутствии других органелл (рис. 5).

 

Рис. 4. Нормохромный нейрон крысы после лечения: 1 — ядро, 2 — ядрышко, ×4 000.

Fig. 4. Normochromic neuron in a treated rat: 1 — nucleus; 2 — nucleolus, ×4,000.

 

Рис. 5. Нейрон спинного мозга крысы после лечения в состоянии внутриклеточной репарации: 1 — цитоплазма; 2 — митохондрии; 3 — осевой цилиндр миелинового волокна, ×10 000.

Fig. 5. Neuron rat spinal cord after treatment in the state of intracellular reparation: 1 — cytoplasm; 2 — mitochondria; 3 — axial cylinder of myelin fiber, ×10,000.

 

Примечательно, что на этом этапе эксперимента в спинном мозге крыс основной группы были обнаружены аксональные «колбы роста». В некоторых случаях они были светлыми и содержали везикулы, митохондрии, гранулярную эндоплазматическую сеть, а иногда микротрубочки и нейрофиламенты (рис. 6). В других случаях «колбы роста» были гиперхромными и имели форму сапога (рис. 7).

 

Рис. 6. Колба роста из аксона со светлым осевым цилиндром (*), ×5 000.

Fig. 6. Growth flask from an axon with light axial cylinder (*), ×5,000.

 

Рис. 7. Колба роста из гиперхромного аксона в виде сапога (1). 2 — отросток oбычного вида, ×26 000.

Fig. 7. Growth flask from a hyperchromic axon in the form of a boot (1). 2 — process of normal axial cylinder, ×26,000.

 

Не менее значимыми были обнаруженные у крыс основной группы типичные изменения в цитоплазме ОДЦ. В одном типе клеток был полный набор органелл, в то время как в другом их количество значительно уменьшалось, что свидетельствовало о дистрофических изменениях по светлому типу.

Некоторые ОДЦ имели нормальное строение ядра с типичным расположением хроматина. В их цитоплазме обнаруживались крупные вакуолизированные канальцы гранулярной ЭПС, множество рибосом и единичные фаголизосомы (рис. 8). Такая морфология ОДЦ указывала на гетерогенность их популяции и неполное восстановление функциональной активности. В некоторых клетках наблюдалось формирование миелиновых волокон, что считается признаком нормальной морфофункциональной активности ОДЦ.

 

Рис. 8. Олигодендроцит спинного мозга крысы после лечения: 1 — ядро; 2 — цитоплазма; 3 — миелиновые волокна; 4 — капилляр с эритроцитом в просвете, ×5 000.

Fig. 8. Oligodendrocyte rat spinal cord after treatment: 1 — nucleus; 2 — cytoplasm; 3 — myelinated fibers; 4 — capillary with an erythrocyte, ×5,000.

 

Через 14 дней после невротмезиса у крыс из контрольной группы (без лечения) в поясничном сегменте спинного мозга были обнаружены миелиновые волокна с плотным миелином, в котором не были различимы ламеллы. Осевые цилиндры этих волокон либо оставались целыми, либо становились очень плотными, что свидетельствовало о дистрофических изменениях по темному типу (аксонопатии). Также были выявлены волокна с плотным миелином, но с осевыми цилиндрами, измененными по светлому типу. В некоторых волокнах осевые цилиндры были прозрачными, а миелиновая оболочка сильно истончалась или отсутствовала на некоторых участках. Все эти изменения указывают на миелино- и аксонопатию (рис. 1, 3).

Важно отметить, что у крыс из основной группы спустя 2 нед после невротмезиса в единичных миелиновых волокнах спинного мозга наблюдалось заметное восстановление структуры миелиновой оболочки при умеренной дистрофии осевого цилиндра (аксонопатия) и признаки ремиелинизации (рис. 9, а, б).

 

Рис. 9. Миелиновые волокна с признаками ремиелинизации: а — за счет внутреннего листка мезаксона, ×15 000; b — за счет наружного листка мезаксона (в центре снимка), ×20 000. Стрелкой обозначен участок начала ремиелинизации на обоих снимках.

Fig. 9. Myelinated fibers with remyelination patterns: a — due to the inner mesaxon leaflet. ×15,000; b — due to the outer mesaxon leaflet (in the center of the image), ×20,000. The arrow indicates the area of the onset of remyelination in both images.

 

В поясничном сегменте спинного мозга в группе без лечения в капиллярах микроциркуляторного русла базальная мембрана была в норме. Однако в просвете сосудов наблюдались монетные столбики из эритроцитов, что свидетельствует об эритростазе.

Эндотелиоциты были изменены дистрофически как по светлому, так и (чаще всего) по темному типу. Астроцитарные «ножки» вокруг капилляров часто отсутствовали, а вблизи них находилось большое количество миелиновых волокон с признаками миелино- и аксонопатии (рис. 10). Такое состояние сосудов и перикапиллярного пространства указывает на умеренное нарушение.

 

Рис. 10. Капилляр с эритроцитами (Э) в просвете. МВ — миелиновые волокна (стрелки), ×6 600.

Fig. 10. Capillary with erythrocytes (Э) in the lumen. MB — myelin fibers (arrows), × 6,600.

 

Через семь дней после лечения ипидакрином в изученном сегменте спинного мозга некоторые капилляры были заполнены эритроцитами неправильной формы, которые не собирались в столбики. Стенки капилляров были сильно вакуолизированы, а перикапиллярное пространство прозрачно, то есть в нем отсутствовали «ножки» астроцитов, являющиеся важной составляющей гематоэнцефалического барьера (рис. 11). Это свидетельствует о том, что микроциркуляторное русло восстановилось не полностью.

 

Рис. 11. Капилляр с вакуолизированной стенкой (стрелки) и эритроцитом (Э) неправильной формы в просвете, ×5 000.

Fig. 11. Capillary with vacuolized wall (arrows) and erythrocyte (Э) irregularly shaped in the lumen, ×5,000.

 

Обсуждение

Полученные результаты о состоянии структуры поясничного сегмента спинного мозга после травмы седалищного нерва (по типу невротмезиса) при последующем 7-дневном лечении ипидакрином и без него свидетельствуют о начале структурных улучшений во всех составляющих его элементах: нейронах, глиальных клетках, миелиновых волокнах, микроциркуляторном русле в экспериментальной (основной) группе животных.

Обращает на себя внимание более высокая морфофункциональная активность нейронов на фоне лечения ипидакрином, о чем свидетельствует хорошее состояние органелл, в особенности ядра и митохондрий. Сохранный энергетический статус клеток спинного мозга препятствует развитию эксайтоксичности и окислительного стресса как основных механизмов повреждения и не дает развиться некрозу и апоптозу [9].

Морфологические изменения олигодендроцитов были качественно одинаковыми в контрольной и экспериментальной группах, но количество измененных клеток в них различалось. Количество и качество сохранных ОДЦ отражает возможности последующего восстановления нервной ткани в целом, так как известно, что помимо продуцирования миелина они обеспечивают нейронам трофическую поддержку и регуляцию [10–14].

Обнаруженные нами в спинном мозге нейроны в состоянии внутриклеточной репарации и так называемые «колбы роста» ранее в работах, посвященных травмам нервов, не были описаны. Ранее «колбы роста» после травмы нерва также на 7-е сут лечения ипидакрином находили лишь в периферических нервах в единичных зарубежных исследованиях [4, 15]. Интересно отметить, что впервые «колбы роста» на ранних этапах восстановления после перерезки нерва были замечены еще в XIX в. Ramon y Cajal. Наличие «колб роста» говорит о целенаправленном характере регенерации от центра к периферии и возможности навигации данного процесса. Сохранность центральных спинальных структур обеспечивает центробежный рост аксона к органу мишени [16].

Реакция микроциркуляторного русла и нарушение гематоэнцефалического барьера на ранних сроках невротмезиса — ключевые факторы гибели нейронов [17]. Через 7 сут лечения ипидакрином мы наблюдали некоторое улучшение состояния микроциркуляторного русла.

Число измененных и типично структурированных миелиновых волокон в контрольной и основной группах было неодинаковым. В обеих группах наблюдались различные варианты аксонопатии и миелинопатии, но без применения ипидакрина миелиновые волокна с нарушениями встречались чаще, чем в основной группе животных. Важным фактом, доказывающим положительный эффект ипидакрина на восстановление миелиновых волокон, является обнаружение ремиелинизации в волокнах изученного сегмента спинного мозга, что совпадает с результатами других исследований по восстановлению периферического нерва [4, 15].

Одним из центральных эффектов невротмезиса является спинальная реорганизация нейрональных «ансамблей», где главную роль играет изменение количества и структуры синапсов [5]. Синаптическая пластичность лежит в основе адаптивной нейропластичности [18]. Этот процесс является динамичным и регулируется активностью нейронов [19]. В ряде работ показано, что в развитии и поддержании адаптивной нейропластичности особую роль играет ацетилхолин и именно поэтому ипидакрин, увеличивающий концентрацию ацетилхолина, повышает возможности адаптивной нейропластичности [20].

В данной работе применение ипидакрина привело к морфологическим изменениям во всех структурах сегментарного аппарата спинного мозга: нейронах, нейроглии, нервных волокнах и в микроциркуляторном русле. Представленное детальное электронно-микроскопическое исследование дает более полную картину развития спинальных реактивных изменений после невротмезиса и позволяет обоснованно подойти к терапии повреждений периферических нервов антихолинэстеразными препаратами.

Заключение

Таким образом, результаты проведенного исследования указывают на сходство микроскопической картины ранних ретроградных патоморфологических изменений сегментарного аппарата спинного мозга в обеих группах.

Однако сравнительный анализ выявил следующие особенности у животных, получавших ипидакрин: сохранность органелл нейронов, наличие аксональных «колб роста», признаки активной ремиелинизации миелиновых волокон, относительно большее количество ОДЦ, улучшение состояния гематоэнцефалического барьера.

Учитывая эффекты раннего применения ипидакрина на состояние сегментарного аппарата спинного мозга после травмы седалищного нерва, можно говорить о повышении регенераторного потенциала вследствие лучшей сохранности спинальных структур.

Это, в свою очередь, может способствовать благоприятному исходу и прогнозу лечения пациентов данного профиля.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Участие авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора. И.В. Литвиненко — дизайн статьи, анализ полученных данных, подготовка рукописи; С.А. Живолупов — дизайн статьи, анализ полученных данных, подготовка рукописи; Л.С. Онищенко — сбор и обработка материала, анализ и интерпретация данных электронной микроскопии, подготовка рукописи; А.В. Климкин — подготовка рукописи; Е.Н. Гневышев — интерпретация данных, подготовка рукописи; К.Р. Магомедов — сбор литературы, подготовка рукописи.

Финансирование. Поисково-аналитическая работа проведена на личные средства авторского коллектива.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Этическая экспертиза. Проведенное исследование одобрено локальным этическим комитетом ФГБВОУ ВО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» в 2008 г.

ADDITIONAL INFO

Authors’ contribution. All authors made a substantial contribution to the conception of the study, acquisition, analysis, interpretation of data for the work, drafting and revising the article, final approval of the version to be published and agree to be accountable for all aspects of the study. Personal contribution of each author: I.V. Litvinenko, article design, data analysis, manuscript preparation; S.A. Zhivolupov, article design, data analysis, manuscript preparation; L.S. Onishchenko, material collection and processing, electron microscopy data analysis and interpretation, manuscript preparation; A.V. Klimkin, manuscript preparation; E.N. Gnevyshev, data interpretation, manuscript preparation; K.R. Magomedov, literature collection, manuscript preparation.

Funding source. The study was not supported by any external sources of funding.

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Ethical expertise. The conducted study was approved by the local ethics committee of the S.M. Kirov Military Medical Academy in 2008.

作者简介

Igor' Litvinenko

Military Medical Academy

Email: litvinenkoiv@rambler.ru
ORCID iD: 0000-0001-8988-3011
SPIN 代码: 6112-2792

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Sergey Zhivolupov

Military Medical Academy

Email: peroslava@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-0363-102X
SPIN 代码: 4627-8290

MD Dr Sci (Medicine), Professor

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Lyudmila Onishchenko

Military Medical Academy

Email: ludonis1947@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3562-1029
SPIN 代码: 4985-7683

Cand. Sci. (Biology)

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Andrei Klimkin

Pediatric Research and Clinical Center for Infectious Diseases of the Federal Medical and Biological Agency

Email: klinkinpark@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6180-4403
SPIN 代码: 6309-3260

MD Cand. Sci (Medicine)

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Evgeny Gnevyshev

Institute of Applied Psychoanalysis and Psychology of the Autonomous Non-Commercial Organization of Higher Education “University under the Interparliamentary Assembly of the Eurasian Economic Community”

Email: evg-gnevyshev@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-9671-462X
SPIN 代码: 9885-0260

MD Cand. Sci (Medicine), Associated Professor

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

Kamil Magomedov

Saint Luke’s Clinic

编辑信件的主要联系方式.
Email: kamagomedov@gmail.com
ORCID iD: 0009-0000-5649-2321
SPIN 代码: 8555-9957

MD doctor neurologist

俄罗斯联邦, Saint Petersburg

参考

补充文件