USING OF MUSEOGENOMICS METHODS TO STUDY THE HISTORICAL COLLECTION OF ARGAS TICKS
- Authors: Glushenko D.D1, Soloveva P.A1, Rakin A.I1
-
Affiliations:
- S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation
- Issue: Vol 2, No S1 (2020)
- Pages: 42-44
- Section: Articles
- URL: https://journals.eco-vector.com/RMMArep/article/view/43334
- DOI: https://doi.org/10.17816/rmmar43334
- ID: 43334
Cite item
Full Text
Abstract
There was made a sample survey of museum specimens of the unique Argasidae ticks collection of E.N. Pavlovsky, collected during his expeditions to Central Asia from 1934 to 1955, in order to determine DNA fragments of ticks and causative agents of tick-borne infections. The technology of Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) was used in this work. The increaease of the accumulation curve (Ct) occurred at the 30th-40th cycle of amplification of the conserved mitochondrial DNA site, thus indicating that museum samples are suitable for further research and study of the tick genome. Genetic markers of tick-borne infections were identified in 10 samples from 48 ticks. 8 samples were positive for the presence of nucleic acids fragments of tick-borne rickettsia (Rickettsia species). There were identified genetic markers of Lyme disease causative agent (Borrelia burgdorferi s.l.) in one of the samples. Also the DNA fragments specific to Q-fever (Coxiella burnetii) were discovered in one case. Obtained data represent high scientific significance of the E.N. Pavlovsky collection in modern time. The unique biological material can be used to study the structure and evolution of the genome of Argasidae ticks, as well as etiology and the spread of tick-borne infections.
Full Text
Музеогеномика (музеомика) - новая активно развивающаяся научная отрасль, связанная с рас- шифровкой генетической информации биологических объектов, хранящихся в зоологических, биологи- ческих, палеонтологических музеях мира. Одним из перспективных направлений музеомики служит ис- следование исторических коллекций клещей с целью изучения генома как самих членистоногих, так и передаваемых ими инфекционных агентов [10, 12, 13, 14, 15]. Ретроспективный анализ нуклеотидных по- следовательностей обеспечивает возможность эволюционного подхода при изучении наиболее акту- альных клещевых инфекций. В настоящее время наиболее подробно изучена группа риккетсиозов, пе- редаваемых клещами семейства Ixodidae (иксодовые клещевые боррелиозы, болезнь Лайма), оби- тающих в лесных умеренно климатических зонах. Вместе с тем, клещевые риккетсиозы, передаваемые клещами семейства Argasidae (Аргасовые клещи), обитающими в горно-пустынной местности с жар- ким климатом, изучены недостаточно. Так, до настоящего времени нет четких сведений о видах риккет- сий, вызывающих клещевые возвратные лихорадки (КВЛ, TBRF, tick-born relapsing fever) (Paster et al., 1991). Остается до конца не изученным видовой состав возбудителей клещевого возвратного тифа и роль от- дельных видов клещей рода Ornithodorus в их передаче [1, 3, 6, 7, 11]. Отсутствуют сведения о геноме возбудителей этих заболеваний, что затрудняет разработку эффективных методов их диагностики и предупреждения. Решению этих вопросов может способствовать обследование уникальной коллекции Аргасовых клещей академика Е.Н. Павловского, хранящейся на кафедре биологии Военно- медицинской академии (г. Санкт-Петербург), бессменным руководителем которой на протяжении бо- лее 40 лет являлся Е.Н. Павловский. Коллекция формировалась в период 1934-1955 гг. во время научных экспедиций по изучению краевой инфекционной патологии регионов Закавказья, Средней и Централь- ной Азии [4, 5]. Изначально коллекция создавалась как собрание живых клещей. Членистоногие парази- ты длительное время хранились при комнатной температуре в условиях естественной влажности. Это могло привести к потере значительного количества генетического материала. В настоящее время име- ются многочисленные данные о том, что нуклеиновые кислоты обладают устойчивостью во внешней среде [2, 10, 12]. Однако, в литературе недостаточно сведений о сохранности наследственного мате- риала членистоногих и возможности выявления генетических маркеров инфекционных агентов в тканях клещей, длительно хранившихся в музейных коллекциях. Поэтому для оценки научно-практической зна- чимости клещевой коллекции возникла необходимость оценить ее состояние и определить пригодность биологического материала для проведения молекулярно-генетических исследований. Цель исследования: оценить состояния образцов исторической коллекции клещей и определить при- годность биологического материала для дальнейших исследований с помощью методов молекулярно- генетического анализа. Материалы и методы. В ходе ревизии коллекции клещей состояние членистоногих оценивали по ре- зультатам визуального осмотра, с помощью микроскопии в проходящем свете (Ломо МИКМЕД 6, ка- мера xc1313), а также посредством стереомикроскопии (Leica MZ6). Видовую идентификацию члени- стоногих проводили в соответствии с общепринятыми морфологическими признаками [13, 14, 15]. Дан- ные, полученные в результате проведенной нами выборочной проверки, полностью совпали со сведе- ниями о видовой принадлежности клещей, указанными в описаниях каждой партии членистоногих. По- этому, в дальнейшем о видовом составе коллекции клещей судили на основании результатов их об- следования, проведенное специалистами в прежние годы. Молекулярно-генетические исследования проводились на базе АО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск, Россия). Материал для исследования получали путем дезинтеграции клещей. Предварительно каждый исследуемый экземпляр подвергался индивидуальной промывке в 300 мкл 96% этилового спирта путем встряхивания пробирок с образцами на шейкере в течение 5 мин. и последующего центрифугирова- ния при 1000 об/мин. в течение 2 минут. Спирт удалялся с помощью вакуумного отсасывателя. Осаж- денные фрагменты клещей промывались от остатков спирта добавлением 500 мкл физиологического раствора с последующим центрифугированием и удалением надосадочной жидкости. Дезинтеграцию фрагментов клещей и гомогенизацию исследуемого материала проводили с по- мощью набора для измельчения образцов «Матрикс-К» (АО «Вектор-Бест», Россия) и гомогенизатора «MagNa Lyser» («Roche Diagnostics», Швейцария) [9, 10]. Выделение суммарной ДНК осуществляли с по- мощью набора реагентов «РеалБест экстракция 100» (АО «Вектор-Бест», Россия). Для этого использова- ли по 100 мкл суспензии каждого образца, обработку материала осуществляли в соответствии с инст- рукцией производителя. Выявление митохондриальной ДНК (мт-ДНК) в суспензиях из тканей клещей про- водили полуколичественным методом с использованием технологии полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Исследование проводили с помощью экспериментального ла- бораторного ПЦР-теста (АО «Вектор-Бест», Россия) [8, 9]. Для выявления ДНК-маркеров возбудителей клещевых инфекций использовали коммерческие набо- ры реагентов «РеалБест ДНК Rickettsia species», «РеалБест ДНК Borrelia burgdorferi s.l.», «РеалБест ДНК Borrelia miyamotoi» (АО «Вектор-Бест», Россия), а также экспериментальные разработки того же произ- водителя для детекции генетических маркеров Coxiella burnetii и Francisella tularensis [2, 8, 9]. Амплифи- кацию генетического материала и учет результатов реакции осуществляли с помощью амплификатора с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени «CFX 96» («Bio-Rad», США). Результаты и обсуждение. Ревизия клещевой коллекции показала, что сбор материала проводился на территории регионов Средней и Центральной Азии. Основная часть материала была собрана в пе- риод с 1934 по 1945 годы. При этом большая часть материала поступила в коллекцию с территории Уз- бекистана, Туркмении и Ирана. В качестве мест обитания клещей обследовались норы полевок, сусликов, лисиц, места обитания черепах, дикобразов, летучих мышей, а также кошары и другие помещения для содержания домашних животных, хозяйственные постройки, стойбища чабанов, жилые сооружения. Партии клещей, собранных в каждом из обследованных мест, помещались в отдельные пробирки. Каждая партия членистоногих снабжалась описанием, в котором указывалось дата и место сбора, количество и вид клещей. В настоящее время коллекция включает 580 лотов (партии клещей, собранных в одном месте), на- считывающих более 15000 экземпляров членистоногих, среди которых преобладают клещи Ornithodorus papillipes. Помимо этого, в материалах коллекции присутствуют такие виды членистоногих, как Ornithodorus tartakovsyi, Ornithodorus lahorensis, Ornithodoros verrucosusа, Argas persicus, Hyalomma anatolicum. Таким образом, в ходе проведенных исследований установлено, что коллекция имеет удовлетвори- тельное состоянии. Образцы сохранили основные морфологические признаки, необходимые для уточ- нения видовой принадлежности клещей, и пригодны для дальнейшего обследования. В ходе ревизии материалы коллекции были учтены и систематизированы, информация о каждой партии членистоногих внесена в электронную базу данных. В результате проведенного нами обследования среди музейных образцов жизнеспособных клещей не выявлено. Большинство клещей сохранили характерный внешний вид. Лишь в некоторых партиях об- наружены частично фрагментированные экземпляры членистоногих (отрыв конечностей, частичная фрагментация тела и др.). С целью определения сохранности нуклеиновых кислот проведено обследование 48 экземпляров коллекционных клещей O. papillipes, собранных в период с 1936 по 1945 гг. на территории Армении, Да- гестана, Грузии, Ирана, Киргизии, Туркмении, Узбекистана, Таджикистана. В ходе оценки содержания в пробах нуклеиновых кислот установлено, что во всех случаях кривые накопления флуоресценции при амплификации внутреннего контрольного образца ВКО имели S-образный (сигмовидный) профиль, а показатель Ct не превышал пороговых значений. Это свидетельствовало о пригодности выбранной ме- тодики обработки клещей с целью пробоподготовки материалов исторической коллекции для молеку- лярно-генетических исследований. Анализ кривых накопления флуоресценции при амплификации консервативного участка митохонд- риальной ДНК клещей показал, что при обследовании музейных образцов, хранившихся в течение 70-80 лет, Ct превышал пороговое значение и составлял от 30 до 40 циклов амплификации. Вместе с тем при обследовании клещей, собранных в последние годы, этот показатель составлял 14-20 циклов. Это позво- ляет сделать предположение о частичной деградации мтДНК, которая могла произойти в процессе дли- тельного хранении биологического материала. Полученные результаты также свидетельствуют о том, что несмотря на некоторое снижение содержания общей ДНК музейные образцы пригодны для дальней- ших исследований и изучения генома клещей. Анализ кривых накопления флуоресценции при амплификации маркерных участков бактериальной ДНК показал, что во всех случаях Ct превышал пороговое значение и составлял от 32 до 44 циклов ам- плификации. Это может свидетельствовать о частичной деградации бактериальной ДНК в музейных об- разцах. Полученные результаты также свидетельствуют о том, что несмотря на некоторое снижение со- держания неизмененной общей ДНК музейные образцы пригодны для использования в дальнейших ис- следованиях генома возбудителей клещевых инфекций. Выводы. Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют об эффективности молекулярно-генетических методов при исследовании исторической коллекции клещей. Полученные данные подтверждают высокую научную значимость и актуальность коллекции Аргасовых клещей, соб- ранных в период 1934-1954 гг. в ходе экспедиций сотрудников Военно-медицинской академии под руко- водством академика Е.Н. Павловского. Биологический материал сохранился в хорошем состоянии и пригоден для проведения молекулярно-генетических исследований. Образцы содержат фрагменты нуклеиновых кислот возбудителей клещевых инфекций, которые могут идентифицироваться посредст- вом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.×
About the authors
D. D Glushenko
S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian FederationSt. Petersburg, Russia
P. A Soloveva
S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian FederationSt. Petersburg, Russia
A. I Rakin
S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian FederationSt. Petersburg, Russia
References
- Балашов, Ю.С. Экспериментальная межвидовая гибридизация Аргасовых клещей Ornithodoros papillipes, O. tartakovskyi, O. verrucosus (Argasidae, Ixodoidea) / Ю.С. Балашов // Паразитология. - 1970. - Т.6, №3. - С.274-282.
- Бондаренко, Е.И. Выявление генетических маркеров возбудителей клещевых риккетсиозов в ПЦР с помощью наборов реагентов «РеалБест ДНК Rickettsia species» и «РеалБест ДНК Rickettsia sibirica / Rickettsia heilongjiangensis» / Е.И. Бондаренко, Л.Д. Щучинова, Д.И. Тимофеев [и др.] // Новости «Вектор-Бест». - 2018. - №1(87). - С.2-10.
- Кербабаев, Э.Б. Кровососущие клещи семейства Argasidae Canestrini 1890 на территории бывшего СССР / Э.Б. Кербабаев // Российский паразитологический журнал. - 2012. - №2. - С.16-29.
- Мокроусов, В.Н. Советские эпидемиолого-паразитологические экспедиции в Иран в 1941-1943 гг. / В.Н. Мокроусов, В.Ю. Кравцов, Л.Л. Кравцова // Военно-медицинский журнал. - 2018. - Т.339, №9. - С.82-87.
- Никитин, А.Ф. К истории кафедры биологии и паразитологии (малоизвестные страницы) / А.Ф. Никитин. - СПб.: ВМедА, 1998. - 50 с.
- Павловский, Е.Н. Распространение Ornithodoros papillipes в связи с эпидемиологией клещевого рекурренса в юго-восточном Таджикистане / Е.Н. Павловский, Г.Я. Змеев // Труды Таджикской базы АН СССР. - 1939. - С.11.
- Петрищева, П.А. Клещевой возвратный тиф / П.А. Петрищева, А.Н. Скрынник / География природноочаговых болезней человека в связи с задачами их профилактики. - М.: Медицина, 1968. - С.95-119.
- Тимофеев, Д.И. Экстракция нуклеиновых кислот из клещей: проблемы и возможности стандартизации / Д.И. Тимофеев, Н.В. Фоменко, М.К. Иванов // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - №4. - С.45-48.
- Тимофеев, Д.И. Новые наборы реагентов для выявления нуклеиновых кислот вируса клещевого энцефалита и боррелий комплекса Borrelia burgdorferi s.l. методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени / Д.И. Тимофеев, Е.И. Бондаренко, Н.Г. Топычканова [и др.] // Новости «Вектор-Бест». - 2014. - №1(71). - С.2-11.
- Durden, L.A. The U.S. National Tick Collection: A Vital Resource for Systematics and Human and Animal Welfare / L.A. Durden, J.E. Keirans, J.H. Oliver // American entomologist. - 1996. - Vol.42, №4. - P.239-249.
- Hoogstraal, H. Argasid and Nuttalliellid ticks as parasites and vectors / H. Hoogstraal // Adv. Parasitol. - 1985. - Vol.24. - P.135-238.
- Kuo, C. Tick-borne pathogens in ticks collected from birds in Taiwan / C. Kuo, Y. Lin, C. Yao [et al.] // Parasites & Vectors. - 2017. - №10. - P.1-13.
- Laaksonen, M. Crowdsourcing-based nationwide tick collection reveals the distribution of Ixodes ricinus and I. persulcatus and associated pathogens in Finland / M. Laaksonen, E. Sajanti, J.J. Sormunen // Emerging Microbes & Infections. - 2017. - №6. - P.1-7.
- Persing, D.H. Detection of Borrelia burgdorferi DNA in museum specimens of Ixodes dammini ticks / D.H. Persing, S.R. Telford III, P.N. Rys [et al.] // Science (New York, N.Y.). - 1990. - Vol.249. - P.1420-1423.
- Tobolewski, J.I. Detection and identification of mammalian DNA from the gut of museum specimens of ticks / J.I. Tobolewski, MJ. Kaliszewski, R.K. Colwell [et al.] // J. Med. Entomol. - 1992. - №6. - P.1049-1051.
Supplementary files
![](/img/style/loading.gif)