Клеточная терапия синдрома тонкого эндометрия

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Численность населения, его структура и репродуктивный потенциал являются важнейшими факторами, определяющими экономическое развитие страны. В настоящее время Российская Федерация находится на краю «демографической пропасти», при этом колоссальные материальные и человеческие ресурсы затрачиваются на преодоления инфертильности при бесплодном браке [1]. Одним из самых сложных вопросов репродуктивной медицины, за исключением мужского бесплодия, остается маточный фактор женского бесплодия, к которому относится прежде всего синдром тонкого эндометрия ¹ [2]. Несмотря на невысокую распространенность данного синдрома, снижение толщины эндометрия до 7 мм и менее уменьшает частоту имплантации эмбриона в 2 раза, а в некоторых случаях делает беременность практически невозможной, вследствие чего в качестве плодовместилища остается только вариант суррогатного материнства [3]. Следует отметить, что, за исключением эстрогенов, в настоящее время нет зарегистрированных лекарственных средств, влияющих на пролиферацию эндометрия [4]. Вариантами лечения, прошедшими проверку временем, остаются рекомбинантный сосудисто-эндотелиальный фактор, проангиогенные геннотерапевтические препараты и клеточная терапия [5].

Цель исследования — изучить эффективность инвазивного внутриматочного введения некультивированных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток на динамику роста эндометрия у пациенток с синдромом тонкого эндометрия и повторными неудачами имплантации в протоколах ЭКО.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика итоговой выборки

В исследование включены 36 пациенток в возрасте от 28 до 36 лет (средний возраст 34,2 ± 1,1 года) с наличием синдрома тонкого эндометрия и двумя и более неудачными попытками ЭКО. Основным условием для проведения клеточной терапии перед протоколом переноса эмбриона было наличие криоконсервированных эмбрионов высокого качества. У всех пациенток до начала исследования путем трехкратного измерения М-эха диагностирован сидром тонкого эндометрия, при этом у всех них зарегистрирован гипопластический эндометрий, подтвержденный при выполнении гистологического исследования биоптата эндометрия. Длительность заместительной терапии эстрогенами составила не менее 6 мес, при этом было зарегистрировано отсутствие ответа на комплексную терапию, включающую помимо терапии эстрогенами физиотерапевтическое лечение.

Забор костного мозга, выделение, хранение и трансплантация стволовых клеток

После подписания информированного согласия всем включенным в протокол женщинам с соблюдением всех стандартных правил асептики и антисептики под местной анестезией выполняли забор красного костного мозга в объеме не менее 20 мл из гребня подвздошной кости вне зависимости от дня менструального цикла. Выделение фракции мононуклеарных клеток проводили в градиенте плотности по стандартной методике. Посев, экспансия, криоконсервирование, реинициация клеточной культуры выполнялись согласно стандартным операционным процедурам и протоколам манипуляций с клетками человека. Для реинициации культуры мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), находящиеся в криовиалах, размораживались в водной среде до 37 °С. Клетки ресуспендировались в указанном температурном режиме и помещались в СО₂-инкубатор. По достижении 80 %-ной конфлюэнтности производился сбор клеток. Полученные клетки трехкратно отмывали физиологическим раствором путем центрифугирования и удаления супернатанта ММСК в концентрации 5 млн/мл и в асептических условиях расфасовывались в виалы емкостью 1,0 мл. Следует отметить, что на всех этапах производился забор проб для контроля качества выделенных клеток. Емкости с ММСК транспортировались в перевозных контейнерах для последующего введения пациенткам. Культура ММСК вводилась им внутриматочно [6, 7]. Процедура трансплантации выделенных, но не культивированных клеток проводилась на 5–7-й день менструального цикла. Катетер с заблаговременно набранной суспензией объемом 1 мл, содержащей около 5 млн ММСК, вводился по проводнику в полость матки под эхографической навигацией. Каждой пациентке проводилось 3 введения клеточной суспензии, после чего дважды в течение менструального цикла: на 9–10-й и 19–21-й дни каждого цикла, выполнялось ультразвуковое исследование органов малого таза с определением состояния эндометрия.

Забор эндометрия и иммуногистохимическое исследование

За 1–2 менструальных цикла до начала терапии и на 4-м менструальном цикле от начала терапии на 19–22-й день выполнялась пайпель-биопсия эндометрия с последующим гистологическим исследованием и иммуногистохимическим анализом на определение уровней экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону, а также маркеров хронического воспаления. При получении морфологических и эхографических показателей эндометрия, приемлемых для проведения подготовки эндометрия в протоколе переноса размороженных эмбрионов, пациентка включается в протокол подготовки эндометрия для переноса размороженного эмбриона в полость матки.

Гистологическое исследование проводили по классической методике на микроскопе Olympus CX31 (Япония) при увеличении ×100, ×400. Для обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин. Иммуногистохимическое исследование выполняли по стандартной схеме с использованием антител к ER, PR, СD4, СD8+, СD20+ и СD138+. Результаты иммуногистохимической реакции оценивались по 3-балльной шкале по методике McCarthy et al. (Hscore) или по удельному количеству клеток (%), экспрессирующих искомый антиген. Степень выраженности хронического эндометрита определяли в соответствие с общепринятыми критериями (см. табл. 1) [7].

 

Таблица 1. Иммуногистохимические критерии степени выраженности хронического эндометрита

Определяемый антиген	CD8+	CD20+	CD138+	CD4+
Наименование клеточной субпопуляции	Цитотоксические Т-лимфоциты	B-лимфоциты	Плазматические клетки	T-хелперы
Оцениваемый критерий	Количество клеток в поле зрения
Норма	До 10	До 3	0	До 10
Слабо выраженный	Увеличение в 2 раза и более		Единичные клетки	Ассоциированы с количеством CD8+
Умеренно выраженный	Увеличение в 3 раза и более		Увеличение в 2–3 раза и более
Выраженный	Увеличение в 5 раз и более	Увеличение в 4–5 раз и более	Увеличение в 5 раз и более

 

Этические правила и нормы

Исследование было проведено в полном соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы научных и медицинских исследований с участием человека», действующими порядками и стандартами оказания медицинской помощи и другими применимыми регуляторными требованиями к проведению клинических исследований и наблюдательных программ в Российской Федерации. Протокол наблюдения за пациентками, программа лечения и обследования были одобрены локальным этическим комитетом. С учетом отсутствия этапа культивирования ММСК исследование не подпадало под действие Федерального закона РФ от 23 июня 2016 г. № 180-ФЗ «О биомедицинских клеточных продуктах».

Используемые методы описательной статистики

В статистическом анализе описание количественных признаков, соответствующих нормальному распределению, представлено в виде среднего значения и стандартного квадратичного отклонения, признаки, отличающиеся от нормального распределения, — в виде медианы (с указанием границ доверительного интервала), качественные признаки представлены в виде долей (%) абсолютных чисел. Распределение признака в группах определяли по тесту Харке–Бера. Сравнение количественных признаков (толщина эндометрия до и после лечения) в группе выполнялось в зависимости от варианта распределения признака: t-теста Стьюдента при нормальном распределении признака, U-критерия Манна–Уитни — при ненормальном. Соотношение частот при расщеплении признаков в группах проводилось с использованием критерия χ² (хи-квадрат) К. Пирсона. Во всех случаях критический уровень значимости принимался при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Все пациентки, включенные в исследование, получили 3 цикла внутриклеточного введения суспензии выделенных ММСК. Средние показатели М-эхо эндометрия до и после введения ММСК составили 2,39 ± 0,64 и 6,56 ± 0,94 мм соответственно (t-тест Стьюдента: t = –21,94, p = 0,0001). Удельный вес пациенток с толщиной эндометрия 7 мм и более составил 77,8 %, именно им впоследствии был проведен модифицированный естественный цикл переноса размороженных эмбрионов. Результативность вспомогательных репродуктивных технологий у данных 28 пациенток была следующей: удельный вес наступления клинической беременности составил 32,1 % (9 пациенток), однако только у 21,6 % (6 пациенток) беременность достигла срока 12 нед.

При сравнении экспрессии рецепторов к прогестерону и эстрогену в железистом и стромальном компонентах эндометрия до и после лечения статистически достоверных различий выявлено не было. Иммуногистохимические данные за наличие хронического эндометрита до и после лечения имели место у 22 (61,1 %) и 19 (52,8 %) пациенток соответственно, при этом после лечения у оставшихся 19 пациенток установлено диагностически значимое (5-кратное) снижение количества провоспалительных маркеров — цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), В-лимфоцитов (CD20+) и плазмоцитов в стромальном компоненте эндометрия в 9 случаях (47,4 %), в 3 случаях (15,8 %) отмечено 3-кратное снижение экспрессии провоспалительных маркеров (табл. 2).

 

Таблица 2. Показатели хронического эндометрита до и после клеточной терапии

Показатель	До лечения n (%)	После лечения n (%)	χ2	p
Удельный вес хронического эндометрита	22 (61,1)	19 (52,8)	0,227	0,635
Изменение интенсивности воспаления на фоне лечения	–	12 (54,5 %*)	2,100	<0,001
Степень выраженности хронического эндометрита
Выраженный	11 (50,0)	2 (10,5)	5,627	0,018
Умеренно выраженный	7 (31,8)	10 (52,6)	1,063	0,303
Слабо выраженный	4 (18,1)	7 (36,8)	0,983	0,322

Примечание. * — от первичного количества пациенток с ХЭ (n = 22).

 

ВЫВОДЫ

Применение 3 введений выделенных, но не культивированных аутологичных ММСК для лечения синдрома тонкого эндометрия приводило к достоверному увеличению его толщины, снижению экспрессии маркеров аутоиммунного воспаления, а также по своей эффективности превосходит все имеющиеся средства медикаментозного и/или комплексного лечения, при которых ответ на лечение не превышает 5 %.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Финансирование данной работы проводилось в рамках фундаментальной научной темы, № гос. регистрации 122041500061-8.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Этическая экспертиза. Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом НИИ акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта (протокол № 11/10 от 11.10.2021).

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

¹ В англоязычной научной литературе имеется устоявшийся термин thin endometrium, что дословно переводится как «тонкий эндометрий». В русскоязычной научной литературе, клинических рекомендациях в настоящее время нет конкретной дефиниции данному состоянию, однако в обиход врачей акушеров-гинекологов входит понятие синдрома тонкого эндометрия, включающего соответствующие эхографические признаки в сочетании с бесплодием и/или невынашиванием беременности.

Об авторах

Наталья Игоревна Тапильская

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Автор, ответственный за переписку.
Email: tapnatalia@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-5309-0087
SPIN-код: 3605-0413
Scopus Author ID: 167924

докт. мед. наук профессор, заведующая отделом репродуктологии

Россия, Санкт-Петербург

Ксения Владимировна Объедкова

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Email: obedkova_ks@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2056-7907
SPIN-код: 2709-2890
Scopus Author ID: 1048781

канд. мед. наук, научный сотрудник отдела репродуктологии

Россия, Санкт-Петербург

Александр Мкртичевич Гзгзян

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Email: iagmail@ott.ru
ORCID iD: 0000-0003-3917-9493
SPIN-код: 6412-4801
Scopus Author ID: 231438

докт. мед. наук, руководитель отделения вспомогательных репродуктивных технологий

Россия, Санкт-Петербург

Олеся Николаевна Беспалова

Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта

Email: shiggerra@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-6542-5953
SPIN-код: 4732-8089
Scopus Author ID: D-3880-2018

докт. мед. наук, профессор, заместитель директора по научной работе

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы