INFLUENCE FEATURES OF EXOMETABOLITES OF CAT TAPEWORM CYSTICERCUS ON THE PROLIFERATIVE ACTIVITY OF L929 CELLS

Full Text

В процессе эволюции тканевые паразиты приспособились к физиологическим особенностям своих хозяев [2, 3]. Они выделяют комплекс биологически активных веществ (экзометаболитов)‚ которые вызы- вают в организме хозяина целый ряд местных и общих изменений‚ направленных на обеспечение па- разиту длительного существования. Тканевые паразиты подавляют реакцию лейкоцитов хозяина, изме- няют защитную реакцию его соединительной ткани, которая выражается в индукции формирования хо- зяином обильно васкуляризованной капсулы специфического строения, функционирующей как биоло- гический барьер с избирательной проницаемостью. Однако механизмы влияния экзометаболитов тка- невых паразитов на организм хозяина в настоящее время исследованы еще мало и требуют дальней- шего изучения. Для этих целей могут быть широко использованы различные модели in vitro [1, 4, 5, 6, 7, 8]. Целью настоящего исследования явилось изучение характера влияния экзометаболитов цистицерков кошачьего цепня Hydatigera taeniaeformis (Batsch, 1786, Lamarck, 1816) на некоторые показатели проли- феративной активности фибробластов линии L 929. Материалы и методы. В работе была использована культура трансформированных фибробластов линии L929, клона линии L, полученной Эрлом (Earle, 1943) из подкожной соединительной ткани взросло- го самца мыши линии С3Н/A. Клетки L929 культивировали на среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота о(без антибиотиков) во флаконах Карреля при температуре 37 С. Снимали клетки смесью 0,25- процентного раствора трипсина и 0,02-процентного раствора ЭДТА (версена) в соотношении 1:1. Пас- сирование клеток осуществляли один раз в неделю. При проведении экспериментов клетки культивировали на стеклянных чашках Петри (фирма «Anumbra», Чехия), пластиковых чашках (фирма «Plow», Англия) и покровных стеклах, помещенных в очашки Петри. Чашки содержали в термостате с автоматической подачей СО 2(5%) при 37 С. В опытных вариантах клетки культивировали на среде, предварительно кондиционированной цистицерками ко- шачьего цепня. Для изучения показателей пролиферативной активности культивируемых клеток использовали цисти- церков кошачьего цепня Hydatigera taeniaeformis (Batsch, 1786, Lamarck, 1816) - лабораторной модели ларвального цестодоза, полученной у неинбредных белых беспородных крыс. Все манипуляции с жи- вотными проводились согласно положениям Хельсинской Декларации Всемирной Медицинской Ас- социации «О гуманном обращении с экспериментальными животными». Цистицерков извлекали из печени крыс, трижды по 20 мин промывали в среде Игла с антибиотиками (по 150 ЕД/мл пенициллина и 150 мкг/мл стрептомицина). Три раза по 10 мин цистицерков отмывали от антибиотиков средой Игла и помещали на определенный срок в чашки Петри со средой для культиви- рования клеток. Такую среду считали кондиционированной цистицерками. Отношение веса цистицер- ка к объему среды составляло 1:10, 1:20, 1:40 г/мл. Использовали три режима кондиционирования: ---цистицерков содержали в среде 24 ч; цистицерков содержали в среде 48 ч; цистицерков содержали в среде в течение 48 ч, но со сменой среды через сутки, при этом в опыт брали вторую порцию среды, кондиционированной в течение последних 24 ч. Через 4 ч после посева клеток в опытных культурах стандартную культуральную среду заменяли сре- дой, кондиционированной цистицерками. Пролиферативный потенциал клеток L929 определяли по эффективности клонирования - доле кле- ток (выраженной в процентах), способных образовывать клоны с 50 и более клетками, от общего числа клеток, посеянных на чашку. На пластиковые чашки Петри высевали по 200 клеток. Спустя 12-15 суток образовавшиеся клоны фиксировали смесью 96-градусного этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Клоны подразделяли по размеру на три класса. I класс - крупные многослойные колонии, количество клеток в которых не поддается точному под- счету. II класс - однослойные колонии, содержащие больше 100 клеток. II класс - однослойные колонии, содержащие 50-100 клеток. Каждое значение показателя эффективности клонирования является средней величиной 15-30 под- счетов. Динамику размножения клеточных культур определяли на кондиционированных цистицерками в те- 5чение 48 ч средах при соотношениях веса гельминта и объема среды 1:10 и 1:40 г/мл. 10 клеток высе- вали на чашки Петри. Скорость роста культуры оценивали путем ежедневного подсчета клеток на чашке с помощью счетной камеры Горяева после снятия клеток смесью трипсина и версена. В каждом вари- анте ежедневно проводили подсчет в трех чашках. Часть культур вели на средах, не содержащих сыво- ротки. Для изучения морфологии фибробластов L929 клетки с той же начальной плотностью высевали на покровные стекла. Препараты фиксировали смесью Карнуа и окрашивали гематоксилином Карачи с подкраской эозином. Результаты проведенных исследований обрабатывали с учетом индивидуальной изменчивости при- знака. Оценку достоверности различий сравниваемых средних проводили с помощью t- критерия Стьюдента, при этом был принят уровень значимости - р < 0,05. Результаты определения эффективности клонирования представлены в таблице 1. Таблица 1 Влияние экзометаболитов цистицерков кошачьего цепня на эффективность клонирования мышиных фибробластов L 929 Эффективность клонирования при режимах Соотношение веса кондиционирования среды гельминта и объема среды (г/мл) 24 часа 17,2 ± 1,5 18,7 ± 1,6 58,4 ± 3,0* 48 часов 15,9 ± 1,8 35,5 ± 2,3 90,5 ± 1,6 24 часа после смены среды 55,8 ± 2,1* 111:10 :20 :40 80,9 ± 2,2 83,3 ± 2,5 Примечания: 1. В контроле эффективность клонирования - 60,5 ± 2,0%; 2. * р > 0,05 Достоверное увеличение эффективности клонирования по сравнению с контролем отмечено в трех вариантах: ) соотношение 1:40 г/мл при кондиционировании в течение 24 часов после предварительной смены среды; 12) соотношение 1:20 г/мл при кондиционировании в течение 24 часов после предварительной смены среды; 3) соотношение 1:40 г/мл при 48-часовом кондиционировании. Во всех остальных вариантах эффективность клонирования достоверно не отличалась от контроля. Максимальное значение эффективности клонирования получено при культивировании клеток L929 на кондиционированной цистицерками в течение 48 часов культуральной среде (соотношение веса цистицерков и объема среды 1:40 г/мл). В дальнейшем при описании результатов экспериментов кон- диционированная таким образом среда будет называться нами ростстимулирующей средой. Минимальное значение эффективности клонирования получено при культивировании клеток на кон- диционированной цистицерками в течение 48 часов культуральной среде при соотношении веса цис- тицерков и объема среды 1:10 г/мл. Такая культуральная среда в дальнейшем будет называться нами ростингибирующей. Доминирующим классом в контрольных вариантах и при культивировании клеток на ростстимули- рующей среде является класс II, в котором клоны характеризуются компактным расположением клеток. В контроле на долю клонов II класса приходится 66,8 ± 2,3%, в опыте при ростстимулирующем эффекте -76,7 ± 3,7% клонов. Мелкие разреженные клоны III класса составляют в контроле 33,5 ± 2,1%, при рост- стимулирующем эффекте - 20,3 ± 1,6%. Следует отметить, что доля клонов I класса, составляющая в контроле всего 0,7 ± 0,01%, при действии ростстимулирующей кондиционированной среды увеличива- ется боле чем в четыре раза по сравнению с контролем и составляет 3,0 ± 0,02%. При действии ростин- гибирующей среды преобладающими являются мелкие разреженные клоны II класса (53,0 ± 3,0%); кло- ны же I класса отсутствуют. При кондиционировании культуральных сред цистицерками в течение 48 часов выявляются как рост- стимулирующий, так и ростингибирующий эффекты экзометаболитов цистицерков. Характер действия экзометаболитов в данном случае также зависит от соотношения веса цистицерков и объема среды, а, следовательно, от дозы экзометаболитов. При соотношении 1:40 г/мл отмечается значительное увеличе- ние эффективности клонирования по сравнению с контролем. Увеличение соотношения веса цисти- церков и объема среды вдвое приводит к значительному снижению эффективности клонирования. Наименьшее значение эффективности клонирования клеток L929 при этом режиме кондиционирова- ния наблюдается при соотношении 1:10 г/мл. Оно достоверно не отличается от показателя, полученного при культивировании клеток на кондиционированной цистицерками в течение 24 часов среде при том же соотношении веса цистицерков и объема среды. Нами был использован и третий режим кондиционирования, при котором через 24 часа после экс- плантации цистицерков, среду меняли на свежую того же состава. В опыт брали вторую порцию среды, кондиционированную в течение последующих 24 часов. Использовали те же, что и в предыдущих вари- антах, соотношения веса цистицерков и объема среды: 1:40, 1:20; 1:10 г/мл. При этом было отмечено, что культивирование клеток на таких средах устраняло выраженный ростингибирующий эффект экзо- метаболитов цистицерков. При соотношении 1:40 г/мл отмечалось значительное увеличение эффек- тивности клонирования клеток L929 по сравнению с контролем. Полученное значение практически не отличается от эффективности клонирования клеток, культивируемых на среде, кондиционированной 48 часов, обладающей выраженным ростстимулирующим эффектом. Было проведено также изучение влияние экзометаболитов цистицерков в культурах с большей плот- ностью посева. Для этих экспериментов нами были использованы кондиционированные цистицерками среды с наиболее выраженными ростстимулирующим и ростингибирующим эффектами. При выращивании клеток L929 на кондиционированной цистицерками ростстимулирующей среде эффект стимуляции пролиферативной активности клеток сохраняется и в культурах с плотным посевом. Раньше, чем в кон- троле, наблюдается удвоение числа клеток в культуре, плотность клеточной популяции в культурах еже- дневно превышает контрольные показатели. В свою очередь, при выращивании клеток L929 на конди- ционированной цистицерками ростингибирующей среде наблюдается обратная картина. Происходит замедление пролиферации клеток, в результате чего позже отмечается удвоение числа клеток в культу- рах по сравнению с контролем и с культурами, выращенными на ростстимулирующей среде. Мень- шей оказывается также и плотность клеточной популяции при ежедневном ее определении. В специальной серии экспериментов была изучена зависимость характера влияния экзометабо- литов цистицерков на пролиферацию клеток L929 от присутствия в культуральной среде сыворотки. Ре- зультаты этих экспериментов представлены в таблице 2. Примечание: на среду без сыворотки клетки переводили через 4 часа после посева. Контрольные культуры продолжают пролиферировать в среде, не содержащей сыворотки, однако уровень пролиферативной активности снижается по сравнению с результатами культивирования в при- сутствии сыворотки. В опытных вариантах отмечается та же тенденция. При культивировании клеток на ростстимулирующей кондиционированной среде, не содержащей сыворотки, отмечается незначи- тельное стимулирующее влияние экзометаболитов цистицерков на пролиферативную активность кле- ток L929. При ежедневном подсчете числа клеток в культуре плотность клеточной популяции превышает контрольные показатели, однако остается меньшей, чем при культивировании в присутствии сыворотки. Следовательно, присутствие сыворотки в культуральной среде усиливает ростстимулирующий эффект экзометаболитов цистицерков. При культивировании клеток L929 на кондиционированной цистицерками ростингибирующей среде, не содержащей сыворотки, отмечено снижение пролиферативной активности клеток, как по сравне- нию с контролем, так и по сравнению с результатами культивирования в присутствии сыворотки. Оно выражается в уменьшении плотности клеточной популяции в таких культурах. Следовательно, ростинги- бирующий эффект экзометаболитов цистицерков сохраняется и при отсутствии сыворотки в культу- ральной среде. Следующим этапом работы явилось изучение морфологических особенностей клеток L929. Культивирование фибробластов L929 на среде, обладающей наибольшим ингибирующим влия- нием, сопровождалось характерным жировым перерождением этих клеток, которое можно рассмат- ривать как стимуляцию дифференцировки фибробластов L929 по пути превращения в адипоциты. Выводы: 1. Цистицерки кошачьего цепня Hydatigera taeniaeformis оказывают как стимулирующее, так и инги- бирующее влияние на пролиферативную активность трансформированных фибробластов мыши кле- точной линии L929. 2. Характер влияния экзометаболитов цистицерков зависит от отношения веса цистицерков к объему культуральной среды, от времени, прошедшего с момента эксплантации цистицерков до помещения клеток в среду, а также от времени нахождения цистицерков в среде.

About the authors

E. Ya Adoeva

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

L. M Bityutsky

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

V. V Zvezdin

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files