INFLUENCE FEATURES OF EXOMETABOLITES OF CAT TAPEWORM CYSTICERCUS ON THE PROLIFERATIVE ACTIVITY OF L929 CELLS
- 作者: Adoeva E.Y.1, Bityutsky L.M1, Zvezdin V.V1
-
隶属关系:
- S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation
- 期: 卷 2, 编号 S1 (2020)
- 页面: 7-10
- 栏目: Articles
- URL: https://journals.eco-vector.com/RMMArep/article/view/43310
- DOI: https://doi.org/10.17816/rmmar43310
- ID: 43310
如何引用文章
全文:
详细
Tissue parasites in the host organism cause a number of local and general changes aimed at ensuring a long-term existence. They secrete a complex of biologically active substances that stimulate the proliferation of various cells. This work is a fragment of a comprehensive study of relationships in host-parasite systems in tissue larval helminthiases. The purpose of this study was to investigate the influence of the nature of the cat tapeworm cysticerci exometabolites on some parameters of the proliferative activity of L929 fibroblast line. Fibroblasts were cultured on media containing cysticercal metabolites. The level of proliferative activity of fibroblasts was assessed by the number of mitoses and cloning efficiency. It was shown that exometabolites of feline cysticerci have wide spectra of biological action. The variety of effects caused by exometabolites probably allows the parasite to flexibly adapt to the conditions of parasitization in host tissues, act on various links of its homeostasis and maintain a certain level of specialization and functional activity of various target cells. Exometabolites of feline chain cysticerci alter the level of proliferative activity, the degree and direction of differentiation of connective tissue and epithelial cells in cultures. The nature of this effect is determined by the belonging of cells to one or another tissue type, the degree of their differentiation, as well as the dose of exometabolites and, probably, the ratio of their various components. The dependence of the nature of the influence of exometabolites of cysticerci on the proliferation of L929 cells on the presence of serum in the culture medium was studied. The cultivation of L929 fibroblasts on the medium with the greatest inhibitory effect was accompanied by a characteristic fatty degeneration of these cells, which can be considered as stimulation of differentiation of L929 fibroblasts along the pathway of conversion into adipocytes.
全文:
В процессе эволюции тканевые паразиты приспособились к физиологическим особенностям своих хозяев [2, 3]. Они выделяют комплекс биологически активных веществ (экзометаболитов)‚ которые вызы- вают в организме хозяина целый ряд местных и общих изменений‚ направленных на обеспечение па- разиту длительного существования. Тканевые паразиты подавляют реакцию лейкоцитов хозяина, изме- няют защитную реакцию его соединительной ткани, которая выражается в индукции формирования хо- зяином обильно васкуляризованной капсулы специфического строения, функционирующей как биоло- гический барьер с избирательной проницаемостью. Однако механизмы влияния экзометаболитов тка- невых паразитов на организм хозяина в настоящее время исследованы еще мало и требуют дальней- шего изучения. Для этих целей могут быть широко использованы различные модели in vitro [1, 4, 5, 6, 7, 8]. Целью настоящего исследования явилось изучение характера влияния экзометаболитов цистицерков кошачьего цепня Hydatigera taeniaeformis (Batsch, 1786, Lamarck, 1816) на некоторые показатели проли- феративной активности фибробластов линии L 929. Материалы и методы. В работе была использована культура трансформированных фибробластов линии L929, клона линии L, полученной Эрлом (Earle, 1943) из подкожной соединительной ткани взросло- го самца мыши линии С3Н/A. Клетки L929 культивировали на среде Игла с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота о(без антибиотиков) во флаконах Карреля при температуре 37 С. Снимали клетки смесью 0,25- процентного раствора трипсина и 0,02-процентного раствора ЭДТА (версена) в соотношении 1:1. Пас- сирование клеток осуществляли один раз в неделю. При проведении экспериментов клетки культивировали на стеклянных чашках Петри (фирма «Anumbra», Чехия), пластиковых чашках (фирма «Plow», Англия) и покровных стеклах, помещенных в очашки Петри. Чашки содержали в термостате с автоматической подачей СО 2(5%) при 37 С. В опытных вариантах клетки культивировали на среде, предварительно кондиционированной цистицерками ко- шачьего цепня. Для изучения показателей пролиферативной активности культивируемых клеток использовали цисти- церков кошачьего цепня Hydatigera taeniaeformis (Batsch, 1786, Lamarck, 1816) - лабораторной модели ларвального цестодоза, полученной у неинбредных белых беспородных крыс. Все манипуляции с жи- вотными проводились согласно положениям Хельсинской Декларации Всемирной Медицинской Ас- социации «О гуманном обращении с экспериментальными животными». Цистицерков извлекали из печени крыс, трижды по 20 мин промывали в среде Игла с антибиотиками (по 150 ЕД/мл пенициллина и 150 мкг/мл стрептомицина). Три раза по 10 мин цистицерков отмывали от антибиотиков средой Игла и помещали на определенный срок в чашки Петри со средой для культиви- рования клеток. Такую среду считали кондиционированной цистицерками. Отношение веса цистицер- ка к объему среды составляло 1:10, 1:20, 1:40 г/мл. Использовали три режима кондиционирования: ---цистицерков содержали в среде 24 ч; цистицерков содержали в среде 48 ч; цистицерков содержали в среде в течение 48 ч, но со сменой среды через сутки, при этом в опыт брали вторую порцию среды, кондиционированной в течение последних 24 ч. Через 4 ч после посева клеток в опытных культурах стандартную культуральную среду заменяли сре- дой, кондиционированной цистицерками. Пролиферативный потенциал клеток L929 определяли по эффективности клонирования - доле кле- ток (выраженной в процентах), способных образовывать клоны с 50 и более клетками, от общего числа клеток, посеянных на чашку. На пластиковые чашки Петри высевали по 200 клеток. Спустя 12-15 суток образовавшиеся клоны фиксировали смесью 96-градусного этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1) и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Клоны подразделяли по размеру на три класса. I класс - крупные многослойные колонии, количество клеток в которых не поддается точному под- счету. II класс - однослойные колонии, содержащие больше 100 клеток. II класс - однослойные колонии, содержащие 50-100 клеток. Каждое значение показателя эффективности клонирования является средней величиной 15-30 под- счетов. Динамику размножения клеточных культур определяли на кондиционированных цистицерками в те- 5чение 48 ч средах при соотношениях веса гельминта и объема среды 1:10 и 1:40 г/мл. 10 клеток высе- вали на чашки Петри. Скорость роста культуры оценивали путем ежедневного подсчета клеток на чашке с помощью счетной камеры Горяева после снятия клеток смесью трипсина и версена. В каждом вари- анте ежедневно проводили подсчет в трех чашках. Часть культур вели на средах, не содержащих сыво- ротки. Для изучения морфологии фибробластов L929 клетки с той же начальной плотностью высевали на покровные стекла. Препараты фиксировали смесью Карнуа и окрашивали гематоксилином Карачи с подкраской эозином. Результаты проведенных исследований обрабатывали с учетом индивидуальной изменчивости при- знака. Оценку достоверности различий сравниваемых средних проводили с помощью t- критерия Стьюдента, при этом был принят уровень значимости - р < 0,05. Результаты определения эффективности клонирования представлены в таблице 1. Таблица 1 Влияние экзометаболитов цистицерков кошачьего цепня на эффективность клонирования мышиных фибробластов L 929 Эффективность клонирования при режимах Соотношение веса кондиционирования среды гельминта и объема среды (г/мл) 24 часа 17,2 ± 1,5 18,7 ± 1,6 58,4 ± 3,0* 48 часов 15,9 ± 1,8 35,5 ± 2,3 90,5 ± 1,6 24 часа после смены среды 55,8 ± 2,1* 111:10 :20 :40 80,9 ± 2,2 83,3 ± 2,5 Примечания: 1. В контроле эффективность клонирования - 60,5 ± 2,0%; 2. * р > 0,05 Достоверное увеличение эффективности клонирования по сравнению с контролем отмечено в трех вариантах: ) соотношение 1:40 г/мл при кондиционировании в течение 24 часов после предварительной смены среды; 12) соотношение 1:20 г/мл при кондиционировании в течение 24 часов после предварительной смены среды; 3) соотношение 1:40 г/мл при 48-часовом кондиционировании. Во всех остальных вариантах эффективность клонирования достоверно не отличалась от контроля. Максимальное значение эффективности клонирования получено при культивировании клеток L929 на кондиционированной цистицерками в течение 48 часов культуральной среде (соотношение веса цистицерков и объема среды 1:40 г/мл). В дальнейшем при описании результатов экспериментов кон- диционированная таким образом среда будет называться нами ростстимулирующей средой. Минимальное значение эффективности клонирования получено при культивировании клеток на кон- диционированной цистицерками в течение 48 часов культуральной среде при соотношении веса цис- тицерков и объема среды 1:10 г/мл. Такая культуральная среда в дальнейшем будет называться нами ростингибирующей. Доминирующим классом в контрольных вариантах и при культивировании клеток на ростстимули- рующей среде является класс II, в котором клоны характеризуются компактным расположением клеток. В контроле на долю клонов II класса приходится 66,8 ± 2,3%, в опыте при ростстимулирующем эффекте -76,7 ± 3,7% клонов. Мелкие разреженные клоны III класса составляют в контроле 33,5 ± 2,1%, при рост- стимулирующем эффекте - 20,3 ± 1,6%. Следует отметить, что доля клонов I класса, составляющая в контроле всего 0,7 ± 0,01%, при действии ростстимулирующей кондиционированной среды увеличива- ется боле чем в четыре раза по сравнению с контролем и составляет 3,0 ± 0,02%. При действии ростин- гибирующей среды преобладающими являются мелкие разреженные клоны II класса (53,0 ± 3,0%); кло- ны же I класса отсутствуют. При кондиционировании культуральных сред цистицерками в течение 48 часов выявляются как рост- стимулирующий, так и ростингибирующий эффекты экзометаболитов цистицерков. Характер действия экзометаболитов в данном случае также зависит от соотношения веса цистицерков и объема среды, а, следовательно, от дозы экзометаболитов. При соотношении 1:40 г/мл отмечается значительное увеличе- ние эффективности клонирования по сравнению с контролем. Увеличение соотношения веса цисти- церков и объема среды вдвое приводит к значительному снижению эффективности клонирования. Наименьшее значение эффективности клонирования клеток L929 при этом режиме кондиционирова- ния наблюдается при соотношении 1:10 г/мл. Оно достоверно не отличается от показателя, полученного при культивировании клеток на кондиционированной цистицерками в течение 24 часов среде при том же соотношении веса цистицерков и объема среды. Нами был использован и третий режим кондиционирования, при котором через 24 часа после экс- плантации цистицерков, среду меняли на свежую того же состава. В опыт брали вторую порцию среды, кондиционированную в течение последующих 24 часов. Использовали те же, что и в предыдущих вари- антах, соотношения веса цистицерков и объема среды: 1:40, 1:20; 1:10 г/мл. При этом было отмечено, что культивирование клеток на таких средах устраняло выраженный ростингибирующий эффект экзо- метаболитов цистицерков. При соотношении 1:40 г/мл отмечалось значительное увеличение эффек- тивности клонирования клеток L929 по сравнению с контролем. Полученное значение практически не отличается от эффективности клонирования клеток, культивируемых на среде, кондиционированной 48 часов, обладающей выраженным ростстимулирующим эффектом. Было проведено также изучение влияние экзометаболитов цистицерков в культурах с большей плот- ностью посева. Для этих экспериментов нами были использованы кондиционированные цистицерками среды с наиболее выраженными ростстимулирующим и ростингибирующим эффектами. При выращивании клеток L929 на кондиционированной цистицерками ростстимулирующей среде эффект стимуляции пролиферативной активности клеток сохраняется и в культурах с плотным посевом. Раньше, чем в кон- троле, наблюдается удвоение числа клеток в культуре, плотность клеточной популяции в культурах еже- дневно превышает контрольные показатели. В свою очередь, при выращивании клеток L929 на конди- ционированной цистицерками ростингибирующей среде наблюдается обратная картина. Происходит замедление пролиферации клеток, в результате чего позже отмечается удвоение числа клеток в культу- рах по сравнению с контролем и с культурами, выращенными на ростстимулирующей среде. Мень- шей оказывается также и плотность клеточной популяции при ежедневном ее определении. В специальной серии экспериментов была изучена зависимость характера влияния экзометабо- литов цистицерков на пролиферацию клеток L929 от присутствия в культуральной среде сыворотки. Ре- зультаты этих экспериментов представлены в таблице 2. Примечание: на среду без сыворотки клетки переводили через 4 часа после посева. Контрольные культуры продолжают пролиферировать в среде, не содержащей сыворотки, однако уровень пролиферативной активности снижается по сравнению с результатами культивирования в при- сутствии сыворотки. В опытных вариантах отмечается та же тенденция. При культивировании клеток на ростстимулирующей кондиционированной среде, не содержащей сыворотки, отмечается незначи- тельное стимулирующее влияние экзометаболитов цистицерков на пролиферативную активность кле- ток L929. При ежедневном подсчете числа клеток в культуре плотность клеточной популяции превышает контрольные показатели, однако остается меньшей, чем при культивировании в присутствии сыворотки. Следовательно, присутствие сыворотки в культуральной среде усиливает ростстимулирующий эффект экзометаболитов цистицерков. При культивировании клеток L929 на кондиционированной цистицерками ростингибирующей среде, не содержащей сыворотки, отмечено снижение пролиферативной активности клеток, как по сравне- нию с контролем, так и по сравнению с результатами культивирования в присутствии сыворотки. Оно выражается в уменьшении плотности клеточной популяции в таких культурах. Следовательно, ростинги- бирующий эффект экзометаболитов цистицерков сохраняется и при отсутствии сыворотки в культу- ральной среде. Следующим этапом работы явилось изучение морфологических особенностей клеток L929. Культивирование фибробластов L929 на среде, обладающей наибольшим ингибирующим влия- нием, сопровождалось характерным жировым перерождением этих клеток, которое можно рассмат- ривать как стимуляцию дифференцировки фибробластов L929 по пути превращения в адипоциты. Выводы: 1. Цистицерки кошачьего цепня Hydatigera taeniaeformis оказывают как стимулирующее, так и инги- бирующее влияние на пролиферативную активность трансформированных фибробластов мыши кле- точной линии L929. 2. Характер влияния экзометаболитов цистицерков зависит от отношения веса цистицерков к объему культуральной среды, от времени, прошедшего с момента эксплантации цистицерков до помещения клеток в среду, а также от времени нахождения цистицерков в среде.×
作者简介
E. Adoeva
S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian FederationSt. Petersburg, Russia
L. Bityutsky
S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian FederationSt. Petersburg, Russia
V. Zvezdin
S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian FederationSt. Petersburg, Russia
参考
- Адоева, Е.Я. Использование различных экспериментальных моделей в изучении патогенеза и лечения ларвальных гельминтозов / Е.Я. Адоева, С.С. Козлов, В.И. Пустовойт // Вестник Российской Военно-медицинской академии. - 2018. - Т.64, №4. - С.6-9;
- Березанцев, Ю.А. Проблема тканевого паразитизма / Ю.А. Березанцев // Паразитология. - 1982. - T.16, №4. - С.268-272;
- Фадеев, Ф.А. Влияние состава ростовой среды и концентрации фетальной сыворотки на пролиферативную активность фибробластов дермы / Ф.А. Фадеев [и др.] // Гены и клетки. - 2016. - Т.11, №4. - С.75-79;
- Березанцев, Ю.А. Инкапсуляция личинок паразитических нематод и цестод в тканях позвоночных как форма взаимоотношения паразита и хозяина / Ю.А. Березанцев, Д.В. Борщуков, И.В. Оксов, М.В. Чеснокова // Сборник трудов Зоологического института АН СССР (паразитология). - 1989. - №36. - С.131-160;
- Калмыкова, Н.В. Биопластический материала на основе гиалуроновой кислоты как матрица для создания биомедицинских клеточных экспресс-продуктов для восстановления кожи / Н.В. Калмыкова, О.Г. Спичкина, В.Н. Эллиниди [и др.] // Гены и клетки. - 2014. - Т.9, №2. - С.68-75;
- Ahearne, M. Combined influence of basal media and fibroblast growth factor on the expansion and differentiation capabilities of adipose-derived stem cells / М. Ahearne, J. Lysaght, A. Lynch // Cell Regeneration. - 2014. - №3. - P.13;
- Liu, M. The effect of serum concentration on the growth, proliferation and collagen secretion in mouse L929 fibroblasts / M. Liu, P. Hu., K. Ding // Chinese J. Cell Mol. Immun. - 2011. - Vol.27, №7. - P.36-39;
- Thangapazham, R. Alteration of skin properties with autologous dermal fibroblasts / R. Thangapazham, T. Darling, J. Meyerle // Int. J. Mol. Sci. - 2014. - Vol.15, №5. - P.8407-8427.
补充文件
![](/img/style/loading.gif)