VALIDATION EVALUATION OF METHODS FOR DETERMINING FLAVONOIDS IN BASILIC GRASS

全文:

Введение. Вопросы изучения лекарственных растений актуальны и в настоящее время, так как при правильном применении фитопрепараты обладают более мягким действием, менее токсичны, не вы- зывают привыкания и аллергии. Издавна траву базилика благородного используют в народной медицине в виде водного извлечения как противовоспалительное, спазмолитическое, возбуждающее аппетит, то- низирующее средство при проблемах желудочно-кишечного тракта, верхних дыхательных путей, воспа- лительных заболеваниях почек и др. [1]. В качестве объекта исследования выбрана трава базилика благородного (Ocinum Basillicum L.) из се- мейства Яснотковых (Lamiaceae), широко распространённая в наиболее экологически благоприятных регионах России (на Северном Кавказе и юге Европейской части) со значительными запасами дико- растущего лекарственного растительного сырья. Кроме того, базилик культивируется в Краснодарском и Ставропольском краях. Все надземные части травы базилика благородного содержат значительное количество ценных биоло- гически активных соединений, таких как флавоноиды, дубильные вещества, эфирное масло, антоциа- ны, макро и микроэлементы, органические кислоты [1, 2, 3]. Цель работы. Валидационная оценка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве базилика благородного. Материалы и методы исследования. Исследуемое сырье - траву базилика благородного (сорт ого- родный) собирали в августе 2017 года в Ботаническом саду ПМФИ - филиала ВолгГМУ, сушили естест- венным путем под навесом. Флавоноиды в извлечении из травы базилика благородного, полученном путём экстракции (1:10) спир- том этиловым 70%, идентифицировали качественными реакциями, описанными в ГФ XIV [4, 5]. Для количественного определения суммы флавоноидов в траве базилика благородного использовали метод дифференциальной спектрофотометрии по реакции комплексообразования с алюминия хло- ридом [5, 6]. Методика: аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с от- верстиями диаметром 2 мм. Около 0,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляли 50 мл спирта этилового 70%. Колбу присоединяли к обрат- ному холодильнику, нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Извлечение охлаждали, фильтровали в мерную колбу вместимостью 50 мл. Объем извлечения доводили тем же растворителем до метки и перемешивали (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл вносили 2,0 мл раствора А, прибавляли 2 мл 5% раствора алю- миния хлорида в спирте этиловом 95% и 1 мл 3% раствора уксусной кислоты, доводили до метки спир- том этиловым 95%, перемешивали. Через 40 минут измеряли оптическую плотность (А) раствора на спектрофотометре при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения, содержащего 2,0 мл извлечения, 1 мл 3% раствора уксусной кислоты, доведённый спиртом этиловым 95% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Для приготовления раствора стандартного образца около 0,05 г (точная навеска) СО рутина, предва- рительно высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 часов, растворяли в 85 мл спирта этило- вого 95% в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводили объем раствора спиртом этиловым 95% до метки и перемешивали [5]. В мерную колбу вместимостью 25 мл вносили 1,0 мл 0,05% раствора СО рутина, 1 мл 3% раствора ук- сусной кислоты, 1 мл 5% раствора хлорида алюминия в спирте этиловом 95%, доводили до метки спир- том этиловым 95%, перемешивали. Через 40 мин измеряли оптическую плотность раствора (Аст) на спектрофотометре СФ 56 в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 408 нм относительно рас- твора сравнения, содержащего 1,0 мл 0,05% раствора СО рутина, 1 мл 3% раствора уксусной кислоты, доведённого спиртом этиловым 95% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Содержание суммы флавоноидов рассчитывали в пересчёте на рутин (Х, %): A а 501 25100100 ст Х  А  а 100 2 25(100 -W) ст ,где А - оптическая плотность испытуемого раствора; ст - оптическая плотность раствора СО рутина; а - масса навески сырья, в граммах; ст - масса навески СО рутина, в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах. АаЛинейность разработанной методики количественного определения суммы флавоноидов в траве ба- зилика благородного оценивали путём построения градуировочного графика, отражающего зависи- мость оптической плотности от объема аликвоты извлечения (рис. 2). Определение проводили по выше- приведенной методике, используя соответственно 0,5 мл; 1,0 мл; 1,5 мл; 2,0 мл; 2,5 мл; 3,0 мл извлечения из сырья. Прецизионность оценивали на первом уровне по повторяемости (сходимости) 6 параллельных опре- делений, что достаточно для фармацевтического анализа (таблица 1). Правильность методики определяли по приведенной выше методике методом добавок. Для этого в аликвоты извлечения из сырья вносили точные количества рутина (таблица 2). Результаты и обсуждение. Положительные результаты качественных реакций извлечения из травы ба- зилика благородного (1:10) спиртом этиловым 70% с раствором натрия гидроксида (образование хал- конов), с раствором хлористоводородной кислоты и цинком (цианидиновая проба), с раствором ос- новного ацетата свинца показали наличие флавоноидов в траве базилика благородного [4, 5]. Стандартный образец для расчета количественного содержания суммы флавоноидов в траве базили- ка благородного выбран по сходству полос поглощения дифференциальных спектров с алюминия хлоридом комплексов флавоноидов базилика благородного и рутина при 408 нм (рис. 1). Разработанная методика количественного определения суммы флавоноидов в траве базилика благо- родного валидирована по критериям линейности, правильности, прецизионности [5, 7]. Линейность методики подтверждает градуировочный график, отражающий зависимость оптической плотности от объема аликвоты извлечения (рис. 2). Он имеет линейный характер и может быть описан уравнением: y=0,1546х+0,003. Коэффициент корреляции составляет 0,9996, что свидетельствует о доста- точно жесткой линейной зависимости оптической плотности от объема аликвоты извлечения, т.е. от кон- центрации. Установлена достаточная воспроизводимость разработанной методики: относительное стандартное отклонение RSD не превышает 3% (таблица 1). Методом добавок показано, что результаты количественного определения суммы флавоноидов в тра- ве базилика благородного в извлечении спиртом этиловым 70% (1:10) по реакции с алюминия хлоридом имеют достаточную сходимость полученных и вычисленных значений (таблица 2). Заключение. Валидационная оценка показала, что разработанная методика определения суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом валидна по критериям линейность, прецизионность и правильность и может быть использована для оценки качества травы базилика благородного.

作者简介

I. Shevchenko

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

L. Dukkardt

Рyatigorsk Medical Pharmaceutical Institute of Volgograd Medical State University of the Ministry of Health Care of Russia

Рyatigorsk, Russia

O. Markova

Рyatigorsk Medical Pharmaceutical Institute of Volgograd Medical State University of the Ministry of Health Care of Russia

Рyatigorsk, Russia

E. Hartyunova

Рyatigorsk Medical Pharmaceutical Institute of Volgograd Medical State University of the Ministry of Health Care of Russia

Рyatigorsk, Russia

A. Saushkina

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

参考

补充文件