VALIDATION EVALUATION OF METHODS FOR DETERMINING FLAVONOIDS IN BASILIC GRASS

Full Text

Введение. Вопросы изучения лекарственных растений актуальны и в настоящее время, так как при правильном применении фитопрепараты обладают более мягким действием, менее токсичны, не вы- зывают привыкания и аллергии. Издавна траву базилика благородного используют в народной медицине в виде водного извлечения как противовоспалительное, спазмолитическое, возбуждающее аппетит, то- низирующее средство при проблемах желудочно-кишечного тракта, верхних дыхательных путей, воспа- лительных заболеваниях почек и др. [1]. В качестве объекта исследования выбрана трава базилика благородного (Ocinum Basillicum L.) из се- мейства Яснотковых (Lamiaceae), широко распространённая в наиболее экологически благоприятных регионах России (на Северном Кавказе и юге Европейской части) со значительными запасами дико- растущего лекарственного растительного сырья. Кроме того, базилик культивируется в Краснодарском и Ставропольском краях. Все надземные части травы базилика благородного содержат значительное количество ценных биоло- гически активных соединений, таких как флавоноиды, дубильные вещества, эфирное масло, антоциа- ны, макро и микроэлементы, органические кислоты [1, 2, 3]. Цель работы. Валидационная оценка методики количественного определения суммы флавоноидов в траве базилика благородного. Материалы и методы исследования. Исследуемое сырье - траву базилика благородного (сорт ого- родный) собирали в августе 2017 года в Ботаническом саду ПМФИ - филиала ВолгГМУ, сушили естест- венным путем под навесом. Флавоноиды в извлечении из травы базилика благородного, полученном путём экстракции (1:10) спир- том этиловым 70%, идентифицировали качественными реакциями, описанными в ГФ XIV [4, 5]. Для количественного определения суммы флавоноидов в траве базилика благородного использовали метод дифференциальной спектрофотометрии по реакции комплексообразования с алюминия хло- ридом [5, 6]. Методика: аналитическую пробу сырья измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с от- верстиями диаметром 2 мм. Около 0,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляли 50 мл спирта этилового 70%. Колбу присоединяли к обрат- ному холодильнику, нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Извлечение охлаждали, фильтровали в мерную колбу вместимостью 50 мл. Объем извлечения доводили тем же растворителем до метки и перемешивали (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл вносили 2,0 мл раствора А, прибавляли 2 мл 5% раствора алю- миния хлорида в спирте этиловом 95% и 1 мл 3% раствора уксусной кислоты, доводили до метки спир- том этиловым 95%, перемешивали. Через 40 минут измеряли оптическую плотность (А) раствора на спектрофотометре при длине волны 408 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм относительно раствора сравнения, содержащего 2,0 мл извлечения, 1 мл 3% раствора уксусной кислоты, доведённый спиртом этиловым 95% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Для приготовления раствора стандартного образца около 0,05 г (точная навеска) СО рутина, предва- рительно высушенного при температуре 130-135°С в течение 3 часов, растворяли в 85 мл спирта этило- вого 95% в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане. После охлаждения доводили объем раствора спиртом этиловым 95% до метки и перемешивали [5]. В мерную колбу вместимостью 25 мл вносили 1,0 мл 0,05% раствора СО рутина, 1 мл 3% раствора ук- сусной кислоты, 1 мл 5% раствора хлорида алюминия в спирте этиловом 95%, доводили до метки спир- том этиловым 95%, перемешивали. Через 40 мин измеряли оптическую плотность раствора (Аст) на спектрофотометре СФ 56 в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 408 нм относительно рас- твора сравнения, содержащего 1,0 мл 0,05% раствора СО рутина, 1 мл 3% раствора уксусной кислоты, доведённого спиртом этиловым 95% до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Содержание суммы флавоноидов рассчитывали в пересчёте на рутин (Х, %): A а 501 25100100 ст Х  А  а 100 2 25(100 -W) ст ,где А - оптическая плотность испытуемого раствора; ст - оптическая плотность раствора СО рутина; а - масса навески сырья, в граммах; ст - масса навески СО рутина, в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах. АаЛинейность разработанной методики количественного определения суммы флавоноидов в траве ба- зилика благородного оценивали путём построения градуировочного графика, отражающего зависи- мость оптической плотности от объема аликвоты извлечения (рис. 2). Определение проводили по выше- приведенной методике, используя соответственно 0,5 мл; 1,0 мл; 1,5 мл; 2,0 мл; 2,5 мл; 3,0 мл извлечения из сырья. Прецизионность оценивали на первом уровне по повторяемости (сходимости) 6 параллельных опре- делений, что достаточно для фармацевтического анализа (таблица 1). Правильность методики определяли по приведенной выше методике методом добавок. Для этого в аликвоты извлечения из сырья вносили точные количества рутина (таблица 2). Результаты и обсуждение. Положительные результаты качественных реакций извлечения из травы ба- зилика благородного (1:10) спиртом этиловым 70% с раствором натрия гидроксида (образование хал- конов), с раствором хлористоводородной кислоты и цинком (цианидиновая проба), с раствором ос- новного ацетата свинца показали наличие флавоноидов в траве базилика благородного [4, 5]. Стандартный образец для расчета количественного содержания суммы флавоноидов в траве базили- ка благородного выбран по сходству полос поглощения дифференциальных спектров с алюминия хлоридом комплексов флавоноидов базилика благородного и рутина при 408 нм (рис. 1). Разработанная методика количественного определения суммы флавоноидов в траве базилика благо- родного валидирована по критериям линейности, правильности, прецизионности [5, 7]. Линейность методики подтверждает градуировочный график, отражающий зависимость оптической плотности от объема аликвоты извлечения (рис. 2). Он имеет линейный характер и может быть описан уравнением: y=0,1546х+0,003. Коэффициент корреляции составляет 0,9996, что свидетельствует о доста- точно жесткой линейной зависимости оптической плотности от объема аликвоты извлечения, т.е. от кон- центрации. Установлена достаточная воспроизводимость разработанной методики: относительное стандартное отклонение RSD не превышает 3% (таблица 1). Методом добавок показано, что результаты количественного определения суммы флавоноидов в тра- ве базилика благородного в извлечении спиртом этиловым 70% (1:10) по реакции с алюминия хлоридом имеют достаточную сходимость полученных и вычисленных значений (таблица 2). Заключение. Валидационная оценка показала, что разработанная методика определения суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом валидна по критериям линейность, прецизионность и правильность и может быть использована для оценки качества травы базилика благородного.

About the authors

I. D Shevchenko

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

L. N Dukkardt

Рyatigorsk Medical Pharmaceutical Institute of Volgograd Medical State University of the Ministry of Health Care of Russia

Рyatigorsk, Russia

O. M Markova

Рyatigorsk Medical Pharmaceutical Institute of Volgograd Medical State University of the Ministry of Health Care of Russia

Рyatigorsk, Russia

E. I Hartyunova

Рyatigorsk Medical Pharmaceutical Institute of Volgograd Medical State University of the Ministry of Health Care of Russia

Рyatigorsk, Russia

A. S Saushkina

S.M. Kirov Military Medical Academy of the Ministry of Defense of the Russian Federation

St. Petersburg, Russia

References

Supplementary files