METABOLISM AND CHEMILUMINESCENT ACTIVITY OF NEUTROPHILIC GRANULOCYTES IN PATIENTS WITH DIFFERENT SENSITIVITY TO ACETYLSALICYLIC ACID IN ACUTE CORONARY SYNDROME

Full Text

Введение Неспецифическое воспаление при атероскле- розе - одна из причин разрыва покрышки ате- ромы, атеротромбоза коронарных артерий и острого коронарного синдрома (ОКС) [1]. Ней- трофильные гранулоциты являются ключевыми клетками воспаления. Они первыми мобилизу- ются в очаг некроза при инфаркте миокарда и служат основным источником свободных ради- калов, вызывающих окислительный стресс [2]. Имеются доказательства непосредственного участия нейтрофилов в повреждении миокарда при острой ишемии [3]. Воспринимая много- численные сигналы о дестабилизации внутрен- ней среды, нейтрофилы модулируют свои функ- ции, нацеленные на ее восстановление. Активи- рованные нейтрофилы сами становятся мощ- ными эффекторами пусковых и регуляторных механизмов каскадных реакций, обеспечиваю- щих развитие воспаления. Функциональная активность нейтрофилов во многом зависит от интенсивности респираторного взрыва и состояния внутриклеточного метабо- лизма [4, 5]. Однако особенности функционально- метаболических процессов в нейтрофилах при развитии резистентности к АСК у пациентов ОКС до сих пор остаются неизученными. Цель исследования: изучение особенностей хемилюминесцентного состояния и активно- сти НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в нейтро- фильных гранулоцитах крови у пациентов с раз- ной чувствительностью к АСК при ОКС. Материалы и методы В исследование включены 53 пациента (сред- ний возраст 61,1±1,1 лет, 25 мужчин и 28 жен- щин). Критериями включения в исследование являлись: ОКС у пациентов обоего пола, в воз- расте от 35 до 75 лет, в первые 24 часа поступле- ния в стационар от начала заболевания, не при- нимавших до госпитализации антиагреганты и антикоагулянты, и подписавших информи- рованное согласие. Диагноз ОКС, а в дальней- шем острого инфаркта миокарда с элевацией или депрессией сегмента ST и положительным тропонином T устанавливался в соответствии с критериями Европейского общества кардиоло- гов [6]. Критерии исключения: сопутствующий сахарный диабет, тяжелая сопутствующая пато- логия (почечная недостаточность, последствия инсульта), сердечная недостаточность III ста- дии, кардиогенный шок при поступлении в ста- ционар, отсутствие информированного согла- сия. Всем пациентам была проведена реперфузионная терапия в виде чрескожного коронарного вмешательства или тромболитической тера- пии. В дальнейшем пациенты получали тера- пию антитромбоцитарными препаратами (АСК, клопидогрел), β-адреноблокаторами, ингибито- рами ангиотензин-превращающего фермента, статинами. Контрольная группа сформирована из 50 относительно здоровых добровольцев без сердечно-сосудистых заболеваний (все испыту- емые были обследованы на наличие сердечно- сосудистых заболеваний), сопоставимых по полу и возрасту (средний возраст 56,9±1,4 года, 27 мужчин и 23 женщины). Все пациенты до начала лечения и реваску- ляризации были обследованы на резистентность к АСК и, соответственно, разделены на группы чувствительных (АЧ) и резистентных к АСК (АР). Оценка резистентности/чувствительно- сти к АСК осуществлялась in vitro путем после- довательного инкубирования обогащенной тром- боцитами плазмы с 5 мкМ аденозиндифосфата (АДФ) и 3,36 мМ АСК и определения уровня агрегации тромбоцитов после каждого инкубиро- вания. Сущность определения заключалась в том, что у больных до начала терапии АСК исследо- вали АДФ-индуцированную и АСК-зависимую агрегации тромбоцитов и по их разнице опре- деляли величину коэффициента ингибирова- ния агрегации (КИА), величина КИА<24% сви- детельствует о резистентности к АСК, при КИА ≥24% - о чувствительности к АСК [7]. Нейтрофилы выделяли из цельной гепарини- зированной крови центрифугированием в двой- ном градиенте плотности фиколл-урографина: ρ=1,077 г/см3 - для отделения лимфоцитов; ρ=1,119 г/см3 - для выделения нейтрофилов. Состояние респираторного взрыва нейтрофиль- ных гранулоцитов исследовали с помощью хеми- люминесцентного анализа [8]. В качестве инди- каторов хемилюминесценции использовали люминол и люцигенин. Оценка спонтанной и зимозан-индуцированной хемилюминесценции осуществлялась в течение 90 минут на 36-каналь- ном хемилюминесцентном анализаторе “CL3606” (Россия). Определяли следующие характери- стики: время выхода на максимум (Тmax), макси- мальное значение интенсивности (Imax), а также площадь под кривой (S) хемилюминесценции. Усиление хемилюминесценции, индуцирован- ной зимозаном, оценивали отношением площади индуцированной хемилюминесценции (Sинд.) к площади спонтанной (Sспонт.) и определяли как индекс активации (Sинд./Sспонт.). Исследование активности НАД(Ф)-зави- симых дегидрогеназ в нейтрофилах прово- дили с помощью биолюминесцентного метода [9]. Метаболизм клеток оценивали по актив- ности следующих ферментов: глюкозо-6-фос- фатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фос- фатдегидрогеназы (Г3ФДГ), малик-фермента (НАДФМДГ), НАД- и НАДН-зависимой реак- ции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и НАДН-ЛДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатде- гидрогеназы (МДГ и НАДН-МДГ), НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ и НАДФН-ГДГ), НАД- и НАДНзависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и НАДН-ГДГ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАД- ФИЦДГ, соответственно) и глутатионредук- тазы (ГР). Активность дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах на 104 кле- ток, где 1 Е = 1 мкмоль/мин [10]. Исследова- ние проводили на ферментативном препарате NАD(Р): FMNоксидоредуктаза-люцифераза из Photobacterium leiognathi (получен в ФГБНУ «НИИ биофизики», Красноярск). Все исследования выполнены с информиро- ванного согласия испытуемых и в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоци- ации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2013 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федера- ции», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266. Описание выборки производили с помо- щью подсчета медианы (Ме) и интеркварталь- ного размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25 и С75, соответственно). Достоверность различий между показателями независимых выборок оце- нивали по Mann-Whitney U test. Статистичес- кий анализ осуществляли в пакете прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft Inc., 2004). Результаты исследования При исследовании люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофильных грану- лоцитов обнаружено снижение площади под кривой спонтанной хемилюминесценции у АР пациентов относительно показателей, выяв- ленных у АЧ пациентов при ОКС (табл. 1). Также у АР пациентов снижена площадь под кривой зимозан-индуцированной люцигенин- зависимой хемилюминесценции как относи- тельно контрольного диапазона, так и значений, выявленных у АЧ пациентов. Особенностями люцигенин-зависимой хемилюминесценции у АЧ пациентов является сокращение времени Люцигенин-зависимая хемилюминесцентная активность нейтрофильных гранулоцитов у чувствительных и резистентных к АСК пациентов ОКС (Ме, С25 - С75) Таблица 1 Показатели Контроль n=50 1 Чувствительные к АСК пациенты n=34 2 Резистентные к АСК пациенты n=19 3 Ме С25 - С75 Ме С25 - С75 Ме С25 - С75 Спонтанная хемилюминесценция Tmax, сек. 2246,5 1538,0 - 3418,2 1902,5 1563,5 - 3248,0 2821,8 2113,0 - 4223,5 Imax, о.е. × 103 7,38 2,58 - 15,61 11,98 7,00 - 20,00 10,70 5,48 - 14,70 S, о.е.ґ 4,28 0,44 - 24,78 6,25 1,15 - 20,34 3,52 1,01 - 15,77 p2=0,045 Зимозан-индуцированная хемилюминесценция Tmax, сек. 1830,9 1489,0 - 2439,1 1535,5 1262,5 - 1755,5 3084,0 2887,0 - 3724,1 p1=0,005 p2=0,020 Imax, о.е. × 103 14,03 7,61 - 28,49 17,45 5,12 - 34,21 17,41 14,95- 20,31 S, о.е.ґ 10,77 7,14 - 43,31 7,11 2,70 - 15,68 4,37 0,81 - 12,58 p1=0,044 p2=0,037 Sинд./Sспонт. 1,80 1,17 - 3,19 1,16 0,84 - 2,41 1,35 1,41 - 4,02 Примечания: р1 - статистически значимые различия с контролем, р2 - статистически значимые различия между АЧ и АР пациентами. Люминол-зависимая хемилюминесцентная активность нейтрофильных гранулоцитов у чувствительных и резистентных к АСК пациентов ОКС (Ме, С25 - С75) Таблица 2 Показатели Контроль n=50 1 Чувствительные к АСК пациенты n=34 2 Резистентные к АСК пациенты n=19 3 Ме С25 - С75 Ме С25 - С75 Ме С25 - С75 Спонтанная хемилюминесценция Tmax, сек. 634,0 506,5 - 1332,5 1913,0 1092,0 - 2594,0 1957,0 1595,0 - 2137,0 р1=0,049 р1=0,014 Imax, о.е. × 103 45,21 12,60 - 61,59 31,73 17,85 - 56,16 52,04 35,39 - 68,58 S, о.е.ґ 3,21 1,43 - 8,51 5,23 3,28 - 70,70 5,46 4,02 - 14,98 Зимозан-индуцированная хемилюминесценция Tmax, сек. 664,0 580,0 - 1285,5 1091,0 987,0 - 1819,0 1559,0 1374,0 - 1692,0 р1=0,041 р1=0,041 Imax, о.е. × 103 64,69 23,01 - 118,70 81,12 31,53 - 118,15 61,95 30,43 - 109,96 S, о.е.ґ 6,74 1,23 - 23,50 8,52 5,71 - 170,80 5,52 4,42 - 34,61 Sинд./Sспонт. 2,17 1,61 - 3,63 2,19 1,45 - 2,78 1,36 1,19 - 1,84 р1,2=0,040 Примечания: р1 - статистически значимые различия с контролем, р2 - статистически значимые различия между АЧ и АР пациентами. р1=0,037 а) б) р1=0,048 р2=0,033 р1<0,001 р2=0,012 р1=0,028 р1=0,045 р2=0,037 р2=0,046 р1=0,002 р2=0,006 в) г) в) р1=0,008 р2=0,004 р1=0,017 р2=0,009 Рис. 1. Активность НАДФ-зависимых дегидрогеназ в нейтро- филах крови у чувствительных и резистентных к АСК пациентов ОКС. Рис. 2. Активность НАД-зависимых дегидрогеназ в нейтро- филах крови у чувствительных и резистентных к АСК пациентов ОКС. Примечание к рис. 1 и 2: р1 - статистически значимые различия с контролем,р2 - статистически значимые различия между АЧ и АР пациентами. выхода на максимум индуцированной хемилю- минесценции. Исследование люминол-зависимой хемилю- минесценции позволило обнаружить, что неза- висимо от чувствительности к АСК у пациентов ОКС увеличивается время выхода на максимум спонтанной и зимозан-индуцированной хеми- люминесценции относительно контрольных значений (табл. 2). Кроме того, у АР, по срав- нению с АЧ пациентами и контролем, снижен индекс активации люминол-зависимой хемилю- минесценции. При исследовании активности НАДФ- зависимых дегидрогеназ в нейтрофилах крови обнаружено, что у АЧ пациентов в 2,7 раза выше активность ГР по сравнению с контрольными значениями (рис. 1 а). В то же время, у АР паци- ентов в нейтрофилах крови активность Г6ФДГ и НАДФГДГ значительно выше, а активность НАДФМДГ ниже, чем у АЧ пациентов и кон- троля (рис. 1, б-в). Изучение активности НАД-зависимых деги- дрогеназ в нейтрофилах крови позволило уста- новить, что независимо от чувствительно- сти к АСК у пациентов ОКС повышена актив- ность Г3ФДГ (рис. 2 а). Только у АЧ пациен- тов повышена активность НАДН-ГДГ относи- тельно контроля (рис. 2 б). У АР пациентов с ОКС в нейтрофилах крови повышена актив- ность НАДГДГ по сравнению с АЧ пациентами и контрольными значениями. (рис. 2 в). Обсуждение полученных результатов Активность респираторного взрыва в нейтро- филах определяется уровнями синтеза первич- ных и вторичных АФК [11]. Состояние респи- раторного взрыва было исследовано с помо- щью двух хемилюминесцентных индикато- ров: люцигенина и люминола. Люцигенин окис- ляется и люминесцирует только под влия- нием супероксид-радикала, который опреде- ляется как первичная АФК и синтезируется в системе НАДФН-оксидазы [8]. Люцигенин не проходит через мембрану клеток и связывается с супероксид-радикалом только во внеклеточ- ном пространстве. Соответственно, исследова- ние люцигенин-зависимой хемилюминесценции нейтрофилов позволяет охарактеризовать состо- яние активности НАДФН-оксидазы и уровень выделения супероксид-радикала для реализации механизма внешнего киллинга у больных ОКС. Обнаружено, что активность НАДФН- оксидазы в нейтрофилах крови у больных ОКС зависит от их чувствительности к АСК. Так, у АЧ больных ОКС выявляются минимальные отли- чия кинетики люцигенин-зависимой хемилюми- несценции нейтрофилов, которые определяются только снижением времени выхода на максимум индуцированной хемилюминесценции. Дан- ный показатель характеризует скорость разви- тия респираторного взрыва от момента регуля- торного или антигенного воздействия на клетку до максимальной активации ферментов, синте- зирующих АФК. Следовательно, у АЧ больных ОКС состояние респираторного взрыва характе- ризуется повышением скорости активации син- теза первичных АФК при антигенной стимуля- ции функциональной активности нейтрофилов. У АР больных ОКС особенность синтеза пер- вичных АФК нейтрофилами характеризуется снижением площади под кривой спонтанной и индуцированной люцигенин-зависимой хеми- люминесценции. Подобное состояние хемилю- минесцентной активности клеток отражает сни- жение активности НАДФН-оксидазы в синтезе супероксид-радикала. В формировании пула вторичных АФК в ней- трофильных гранулоцитах принимают участие такие ферменты, как супероксиддисмутаза, ката- лаза, миелопероксидаза и др. Для оценки интен- сивностисинтезавторичных АФКнейтрофилами крови нами использовалась люминол-зависимая хемилюминесценция. Необходимо отметить, что люминол способен вступать в хемилюминес- центную реакцию, как с первичными, так и вто- ричными АФК [8]. Особенность респираторного взрыва в нейтрофилах у АЧ больных ОКС опре- деляется увеличением времени активации син- теза вторичных АФК. У АР пациентов особен- ность синтеза вторичных АФК в фагоцитиру- ющих клетках также определяется ускоренной активацией ферментов, но при снижении вели- чины индекса активации, который характеризует уровень активации респираторного взрыва при антигенной стимуляции нейтрофилов. Респираторный взрыв тесно связан с основ- ными метаболическими процессами в клет- ках. Так доказано, что активность НАДФН- оксидазы зависит от образования НАДФН в системе пентозофосфатного цикла [12, 13]. В связи с этим мы исследовали уровни активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в ней- трофилах крови у больных ОКС в зависимости от их чувствительности к АСК. Установлено, что метаболизм нейтрофи- лов у АЧ больных ОКС характеризуется повы- шением активности ГР и НАДН-ГДГ. ГР явля- ется ферментом глутатион-зависимой антиок- сидантной системы клеток, активность которой может увеличиваться при повышении интен- сивности перекисных процессов [10]. При этом повышение интенсивности перекисных процес- сов может привести к стимуляции активности внтуриклеточных антиоксидантных ферментов (супероксиддисмутазы, каталазы и других), что может проявляться в увеличении времени раз- вития респираторного взрыва за счет синтеза вторичных АФК. НАДН-ГДГ - фермент, осу- ществляющий НАДН-зависимое перераспреде- ление интермедиатов с цикла трикарбоновых кислот на реакции аминокислотного обмена. В связи с тем, что у АЧ пациентов отсутствуют изменения активности ферментов лимонного цикла (НАДИЦДГ и МДГ) можно предполо- жить, что стимуляции аминокислотного обмена не приводит к ингибированию энергетических процессов в нейтрофилах крови. У АР больных ОКС особенности метабо- лизма нейтрофилов определяются выраженным повышением активности Г6ФДГ, НАДФГДГ и НАДГДГ, а также снижением активно- сти НАДФМДГ. Г6ФДГ - инициализирую- щий и ключевой фермент пентозофосфатного цикла, основными продуктами которого явля- ются рибозо-5-фосфат и НАДФН, используе- мые преимущественно в пластических процесса, но и, в том числе, для реализации ферментатив- ной активности НАДФН-оксидазы [10]. Между тем, активность самой НАДФН-оксидазы в нейтрофилах у лиц данной группы снижена. Можно предположить, что метаболические про- цессы в нейтрофилах даже при высокой актив- ности Г6ФДГ не могут обеспечить достаточную активность НАДФН-оксидазы. Тем более, что у АР пациентов значительно снижена активность НАДФМДГ - фермента цитоплазматического компартмента, в ходе ферментативной реакции которого также образуется НАДФН. НАДГДГ и НАДФГДГ - ферменты, преимущественно лока- лизующиеся в митохондриальном компартменте и осуществляющие отток субстратов с реакций аминокислотного обмена на цикл трикарбоно- вых кислот [10]. Активация данных ферментов связана с необходимостью субстратной стимуля- ции энергетических процессов клетки. Г3ФДГ - фермент, осуществляющий пере- нос продуктов липидного катаболизма на окислительно-восстановительные реакции гли- колиза [10]. Активность фермента повышается в нейтрофилах как у АЧ, так и у АР пациентов с ОКС. Можно предположить, что подобное изменение активности данного фермента опре- деляется необходимостью субстратной стиму- ляции гликолиза. Тем более, что в нейтрофи- лах АР пациентов более выраженное увеличе- ние активности Г3ФДГ совпадает с активацией Г6ФДГ, которая является основным конкурен- том гликолиза за субстрат. Необходимо отметить, что особенности состояния респираторного взрыва и метаболизма нейтрофилов крови у больных ОКС, зави- симые от чувствительности к АСК, могут опре- деляться как внутриклеточными процессами, так и регуляторными реакциями в иммунной системе и гемостазе. Доказано участие циклоок- сигеназы в реализации функциональной актив- ности нейтрофилов [4]. Ингибирование метабо- лизма арахидоновой кислоты приводит к выра- женному снижению фагоцитарной и перевари- вающей активности нейтрофильных гранулоци- тов [5]. Установлено значение тромбоцитарно- нейтрофильной ассоциации в патогенезе ОКС, которая реализуется через рецепторное взаимо- действие и с помощью гуморальных факторов [14]. Таким образом, у больных ОКС обнару- жены изменения кинетики и интенсивности респираторного взрыва и активности НАД(Ф)- зависимых дегидрогеназ в нейтрофилах крови, зависимые от чувствительности к АСК. У АЧ пациентов выявляются минимальные измене- ния кинетики респираторного взрыва, кото- рые определяются ускоренной активацией син- теза первичных АФК в клетках при антиген- ной индукции, а также замедлением синтеза вто- ричных АФК. Метаболизм нейтрофилов харак- теризуется увеличением активности фермен- тов, продукты которых стимулируют энергети- ческие процессы, а также повышением интен- сивности внутриклеточных перекисных процес- сов. У АР больных ОКС состояние респиратор- ного взрыва определяется понижением скорости синтеза первичных АФК, замедлением синтеза вторичных АФК и снижением индекса актива- ции нейтрофилов по люминол-зависимой хеми- люминесцентной реакции. Изменения активно- сти ферментов в нейтрофилах АР больных также более выражены, чем при наличии чувствитель- ности к АСК и характеризуются активацией пен- тозфосфатного цикла и повышением интенсив- ности субстратной стимуляции гликолиза, но при повышении уровня оттока интермедиатов с реакций цикла трикарбоновых кислот. При рези- стентности к АСК отмечается понижение функ- циональной активности нейтрофилов, что пред- ставляет интерес при изучении межклеточных взаимоотношений формирования тромба. Воз- можной причиной понижения функциональной активности нейтрофилов являются энергетиче- ские потери клетки, обусловленные повышением интенсивности субстратной стимуляции глико- лиза и активацией окисления глюкозы по пенто- зофосфатному пути.

About the authors

I Yu Grinshtein

Email: grinst@yandex.ru

A A Savchenko

Yu I Grinshtein

Email: grinstein.yi@mail.ru

I I Gvozdev

Email: leshman-mult@mail.ru

References

Supplementary files