VASCULAR WALL CONDITION, GUT MICROBIOTA COMPOSITION, AND DIET IN PATIENTS WITHOUTCARDIOVASCULAR DISEASES

Full Text

Введение Сердечно-сосудистые заболевания по-преж- нему занимают первое место в структуре смерт- ности как во всем мире, так и в России. Субстра- том развития ССЗ является увеличение жестко- сти сосудистой стенки и атеросклероз [1], кото- рые отражаются в повышении скорости распро- странения пульсовой волны (СРПВ), увеличе- нии толщины комплекса интима-медиа (КИМ). Сегодня в этиологии развития изменений сосудистой стенки выделяют нового «игрока» микробиоту кишечника. Микроорганизмы, населяющие организм человека, обладают огромным метаболическим потенциалом, число генов в метагеноме значительно превосходит число генов генома человека. Микробиота ока- зывает влияние на иммунитет, на процессы вос- паления, в том числе вялотекущее воспаление, лежащее в основе развития атеросклероза и дру- гих нарушений. Недавно были обнаружены раз- личия в составе кишечной микробиоты здоро- вых людей и пациентов с симптоматическим атеросклерозом. Большое содержание бакте- рий рода Collinsella было более характерно для клинической группы, а Eubacterium, Roseburia и Bacteroides - для здоровых испытуемых. Мета- геном пациентов с клиническим атеросклеро- зом содержал много генов, отвечающих за регу- ляцию синтеза пептидогликанов, что может быть одной из причин вялотекущего воспале- ния, в то время как метагеномы здоровых испы- туемых содержали больше генов, ответственных за выработку противовоспалительных веществ и антиоксидантов [2]. В 2014 году исследователем Jill Gregory и соавт. был проведен интересный эксперимент: микробиота кишечника пересаживалась от доноров-мышей с атеросклерозом и без него мышам-реципиентам с дефицитом аполипо- протеина Е (склонным к развитию атероскле- роза) и подавленной антибактериальными препаратами микрофлорой. У мышей, кото- рым была пересажена микробиота от доно- ров с атеросклерозом, атерогенез был намного более выраженным, нежели во второй группе, которой был пересажен кал от животных без атеросклеротических изменений. Таким нео- чевидным образом мыши были «заражены» атеросклерозом [3]. Большинство работ, в которых изучался вопрос взаимосвязи сосудов и микробиоты кишечника были посвящены клинически выра- женным атеросклеротическим изменениям, и единичные исследования - жесткости сосуди- стой стенки или субклиническому атероскле- розу. Было обнаружено, что метаболиты неко- торых бактерий ассоциированы с ускорением СРПВ и являются «кардиоваскулярными ток- синами» [4], позже эти данные были подтверж- дены в работе Gulhan и соавт.[5]. Однако в исследованиях не оценивался состав микро- биоты, а метаболиты измерялись прицельно, не в составе метаболома. В настоящей работе впервые описана взаи- мосвязь состава самой кишечной микробиоты не только с атеросклерозом, но и с жесткостью сосудов. Кроме того, в ряду первых изучался состав микробиоты кишечника у когорты из Москвы и Московской области. Цель: Изучить взаимосвязь состава микро- биоты кишечника с состоянием сосудистой стенки и потреблением макронутриентов у лиц без клинических проявлений сердечно- сосудистых заболеваний. Материал и методы В одномоментное исследование были вклю- чены пациенты с различным состоянием сосу- дистой стенки, но без клинических проявлений атеросклероза и сердечно-сосудистых заболева- ний, в возрасте старше 25 лет, прошедшие амбу- латорное обследование в ФГБУ «ГНИЦПМ» в 2013-2014 гг. Критерии включения Мужчины и женщины в возрасте старше 25 лет без клинических проявлений сердечно- сосудистых заболеваний (но с возможным нали- чием факторов кардиоваскулярного риска) и других хронических неинфекционных заболева- ний, подписавшие информированное согласие на участие в исследовании. Критерии исключения Клинические проявления атероскле- роза (ишемическая болезнь сердца, вклю- чая инфаркт миокарда; церебро-васкулярная болезнь, включая инсульт; перемежающаяся хромота и др.), наличие сердечно-сосудистых заболеваний, наличие клапанных пороков сердца. Регулярный прием любых препаратов (в т.ч. антибактериальных в течение последних 3-х месяцев и др.), СД1 и другие специфиче- ские типы СД, тяжелые диабетические микро- ангиопатии, СД2 в анамнезе (кроме впер- вые выявленного СД2). Наличие хронической печеночной и почечной недостаточности, онко- логических заболеваний, беременности, период лактации, анемия средней и тяжелой степени тяжести, инфекционные заболевания, забо- левания желудочно-кишечного тракта в ста- дии обострения, операции на органах брюшной полости, диагностированная лактазная непере- носимость, диагностированная аллергическая реакция любого типа на пищевые продукты, трансплантация органов в анамнезе, заболева- ния ротовой полости, зубочелюстной системы, отказ от участия в исследовании. Этические аспекты Всеми пациентами было подписано инфор- мированное согласие на участие в исследова- нии. Протокол исследования одобрен локаль- ным этическим комитетом ФГБУ «ГНИЦПМ» Минздрава России. Протокол заседания ЛЭК № 8 от 29 ноября 2011 г. Конфиденциальность данных пациента была обеспечена использова- нием кодовых идентификационных номеров, что позволяет соотнести пациента с электронными базами данных. Скрининг пациентов На этапе скрининга всем пациентам про- водилось стандартное клиническое обследо- вание: сбор анамнеза, клинический осмотр, в том числе измерение веса и роста с расчетом индекса массы тела (ИМТ), измерение систо- лического и диастолического артериального давления. Участникам проводили забор крови и мочи для лабораторных анализов (клиниче- ский и биохимический). Участникам была про- ведена регистрация ЭКГ с помощью электрокар- диографа SCHILLER CARDIOOVIT AT-10 в 12 отведениях. С целью исключения ишемии мио- карда проводилась проба с физической нагрузкой (тредмил-тест по протоколу BRUCE (Intertrack, SCHILLER). Биохимический анализ крови вклю- чал в себя определение уровней глюкозы, креати- нина, мочевины, мочевой кислоты, калия, натрия, АСТ, АЛТ, билирубина, также определяли общий холестерин (ОХС), триглицериды (ТГ), ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП) и уровень тиреотроп- ного гормона. Содержание ОХС, ТГ и ХС-ЛПВП в сыворотке крови определяли ферментативным колориметрическим методом с помощью наборов фирмы «DIASYS» (Германия). Результаты выра- жены в ммоль/л. Содержание ХС- ЛПНП вычис- ляли по формуле Фридвальда и соавт.: ХС-ЛПНП = ОХС-(ТГ/2,2 + ХС-ЛПВП), где ТГ/2,2 = ХС-ЛПОНП. Лица с отклонениями в анализах крови, и по данным ЭКГ считались не соответствовавшими критериям включения в исследование. По результатам скрининга 92 участника были включены в исследование. Всем обследуемым, которые соответство- вали критериям включения/исключения, были проведены основные методы исследования. При выявлении критериев исключения участ- ник выбывал из исследования на любом этапе. Протокол исследования был одобрен этическим комитетом и все участники дали письменное информированное согласие на участие в иссле- довании. Оценка состояния сосудов Измерение СРПВ: Измерение жесткости арте- риальной стенки проводили с помощью прибора SphygmoCor (AtCorMedical, Австралия). Пуль- совые волны регистрировались последовательно высокоточным аппланационным тонометром, который накладывался на проксимальную (сон- ную) и, с коротким промежутком, на дистальную (бедренную) артерии, при этом одновременно регистрировалась ЭКГ. Ускоренной СРПВ счи- талось значение 10 м/с и более [6]. Оценку толщины КИМ и субклинического атеросклероза проводили в В-режиме при парал- лельной записи ЭКГ с использованием про- граммы Q-LAB (Philips, Нидерланды). Согласно стандартам Европейского общества кардиоло- гов, нормальным считалась толщина КИМ < 0,9 мм. Значения КИМ 0,9-1,3 мм считались утол- щением комплекса. Наличие атеросклеротиче- ских бляшек идентифицировали как увеличе- ние КИМ более 1,3 мм для общей сонной арте- рии или как локальное увеличение КИМ на 0,5 мм или на 50% от значения близлежащего участка КИМ [7]. Оценка характера питания Характер питания изучался частотным мето- дом с количественной оценкой потребленных продуктов при помощи стандартизованной ком- пьютерной программы «Анализ состояния пита- ния человека» (версия 1.2.4 ГУ НИИ питания РАМН 2003-2006). Оценивали качественный состав и объем потребляемых продуктов, общую калорийность рациона, химический состав, риски недостатка и избытка потребления основ- ных витаминов и минеральных веществ с учетом «Норм физиологических потребностей в энер- гии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации» (Методи- ческие рекомендации MP 2.3.1.2432-08). Оценка состояния микробиоты кишечника: Собранные у участников образцы кала, хра- нящиеся при температуре -20°С, были разморо- жены, из 2 мл образцов выделены ДНК, после выделения тотальной ДНК и подготовки библи- отек для секвенирования было выполнено сек- венирование вариабельных участков V3-V4 гена 16S рРНК с использованием набора MiSeq Reagent Kit v2 (300 циклов) и прибора MiSeq (Illumina, США) согласно рекомендациям про- изводителя. Фильтрация ридов по качеству и их таксономическая классификация по байессов- скому алгоритму против БД Greengeens V13.5 были произведены с помощью ПО QIIME [8]. Биоинформатическая обработка Фильтрация ридов по качеству и таксономи- ческая классификация происходили с исполь- зованием встроенного программного комплекса QIIME [8]. Таксономический состав образцов был оценен путем классификации по базе дан- ных 16S рРНК генов Greengenes v. 13.5 с помо- щью байесовского классификатора. Результа- том классификации являются количества легших ридов на операционные таксономические единицы (ОТЕ). Специальными программами выдача классификатора была приведена к виду матрицы образцов ОТЕ, с описанной филоге- нией последних. Весь статистический анализ выполнен на языке программирования R, версия 3.1.0. Ста- тистический анализ сравнения групп образцов был выполнен с использованием теста Манна- Уитни (поправка на множественное сравнение false discovery rate, FDR) и построение обобщен- ных линейных моделей [9]. При построении графиков многомерного шкалирования было использовано расстояние UniFrac [10]. Для иллюстраций был использо- ван пакет ggplot. На графиках «ящики с усами» горизонтальной чертой отмечены медианы, нижняя и верхняя грань прямоугольника отве- чают первой и третьей квартили соответственно, «усы» соответствуют расстоянию между квар- тилями помноженному на 1,5. Значения, выхо- дящие за пределы «усов» считаются выбросами и отмечаются точками. Результаты В исследование было включено 92 человека (26 мужчин и 66 женщин) в возрасте от 25 до 76 лет. Средний возраст всех участников 57±34 лет. Доля мужчин составила 29% (n=28), жен- щин 71% (n=69). Общая картина микробиоты секвениро- ванных образцов кала После секвенирования образцов кала в сред- нем получили 102582±46284 ридов на образец. В обсчете были задействованы 102,581 ± 39,210 высококачественных ридов, 87%±2% от общего числа. Из них классифицированы 87.40±7.4 %. Средний процент классификации с точностью до рода составил 97.41±0,9%. Результатом классификации ридов стала таблица представленности операционных так- сономических единиц ОТЕ (англ. operational taxonomic units) - условная таксономическая единица, соответствующая таксону по 16S рРНК генам [10]. Тепловая карта относительной пред- ставленности ОТЕ отображена на рис. 1. Индекс альфа-разнообразия Шеннона Для оценки разнообразия микробиоты мы использовали индекс альфа-разнообразия Шен- нона. В нашем исследовании индекс альфа- разнообразия оказался достаточно высоким и составил3,71±0,56,чтоявляетсядовольновысоким показателем. Для сравнения была взята выборка здоровых добровольцев исследования Turnbaugh Рис. 1. Тепловая карта относительной представленности ОТЕ в образцах в процентах,составляющих 85% суммарной представленности. и соавт. [11], индекс альфа-разнообразия для кото- рой составил 2,46 ± 0,29 (рис. 2). Нами не было найдено отличий в разнообра- зии микробиоты у людей разного возраста, пола, и среди испытуемых с различными клиниче- скими показателями или различным питанием. Доминирующие бактерии Самыми представленными оказались бак- терии двух крупных филумов - Bacteroidetes (12,7±9,86%) и Firmicutes (57,09±13,6%). Среди всех этих бактерий в среднем 50% составили представители пяти родов: Blautia, Bacteroides, Prevotella, Faecalibacterium, Clostri- dium. Наиболее представленным оказался род Blautia, в частности, Blautia coccoides. Оценка состояния стенки сосудов и взаи- мосвязи его с составом микробиоты кишечника. Целью нашего исследования было выявление взаимосвязей между составом микробиоты кишечника и состоянием сосудистой стенки. Для этого нами были выбраны следующие кри- терии: атеросклеротического поражения сосу- дов - толщина комплекса интима-медиа, а также жесткости сосудистой стенки - скорости распространения пульсовой волны. Субклинический атеросклероз и микро- биота кишечника Среднее значение толщины КИМ (наиболь- шее из двух) среди всех участников составило 0,84±0,4мм. У 20 человек толщина КИМ пре- вышала 0,9 мм. В таблице 1 представлена харак- теристика испытуемых с различными показате- лями толщины комплекса интима-медиа. Толщина комплекса была ассоциирована с большим числом бактерий родов Blautia (р=0,004) и Serratia (р=0,009) (рис. 3). Бакте- рии рода Prevotella, напротив были более пред- ставлены у лиц с нормальной толщиной КИМ (р=0,0003). Жесткость сосудистой стенки и микро- биота кишечника В таблице 2 представлена характеристика испытуемых с различной СРПВ. Жесткость артерий коррелировала с возрастом, систоличес- ким артериальным давлением, уровнями глю- козы и мочевины, а также показателем SCORE. Среднее значение СРПВ составляло 11±2,76 м/с. Значение СРПВ более 10 м/с наблюдалось у 55 человек. В нашем исследовании при первом рассмотрении всей выборки не было достовер- ных различий в составе микробиоты кишечника у пациентов с разной СРПВ. После разделения пациентов и изучения вза- имосвязи СРПВ с составом микробиоты у испы- туемых без СД2, было обнаружено, что пред- ставленность Bacteroides была достоверно выше у лиц с СРПВ=10 м/с и более. Результаты по анализу взаимосвязей состоя- ния сосудистой стенки с составом микробиоты кишечника представлены в таблице 3. Рис. 2. Разнообразие видового состава микробиоты кишечника по индексу альфа-разнообразия в исследуемой группе (чер- ные точки) и в работе Turnbaugh и соавт. Красная линия - среднее альфа-разнообразие ± стандартное отклонение для образцов из исследования Turnbaugh и соавт. Рис. 3. Представленность родов Blautia и Serratia у лиц с нормальным и утолшенным КИМ Сравнительная характеристика лиц в группах с толщиной КИМ < и ≥ 0,9 мм Таблица 1 Показатель КИМ <0,9 мм КИМ≥ 0,9мм среднее станд.откл. среднее станд.откл. р Возраст (лет) 49,9286 12,14564 62,7500 6,68758 0,0000 САД (мм рт.ст.) 123,7714 15,90294 136,9500 16,09340 0,0029 ДАД (мм рт.ст.) 77,6657 9,76368 79,7500 8,76521 0,3674 ИМТ (кг/м2) 27,1695 5,41872 28,1970 5,27166 0,4506 ОТ/ОБ (см) 0,8469 0,09382 0,7829 0,42083 0,5077 ИЛ-6 (пг/мл) 11,0281 25,85051 5,3310 5,16649 0,0878 SCORE 1,5714 2,81080 3,8000 3,39659 0,0123 СРПВ (м/с) 10,3235 2,15075 12,9300 3,24526 0,0024 Мочевина (ммоль/л) 5,0943 1,58104 6,3500 2,33925 0,0333 Глюкоза натощак 5,4800 1,26004 6,7515 2,01230 0,0133 вчС-РБ (мг/л) 2,9637 2,74844 5,4450 7,71914 0,1729 HbA1c (%) 5,2870 0,96630 6,1005 1,13411 0,0069 Микробиота кишечника и питание 86 участникам был проведен анализ пита- ния. Средняя калорийность питания соста- вила 2176,16±654,21 ккал. Среднее суточное потребление углеводов 209,27±91,81 г; белков 76,62±22,63 г; жиров 101,52±33,04 г. Примечательно, что с особенностями пита- ния были обнаружены зависимости для «полез- ных» бактерий рода Bifidobacterium, а также для ранее упомянутых представителей рода Blautia, которые были в большей степени представлены у лиц с утолщением КИМ. Представленность рода молочнокислых бактерий Bifidobacterium зна- чительно снижалась у доноров, потребляющих большое количество холестерина или этанола. С ростом количества потребляемого крахмала пред- ставленность Bifidobacterium возрастала, а Blautia падала. Кроме того, были выявлены и другие ассоциации, которые представлены в таблице 3. Питание - мощнейший фактор воздействия на кишечную микрофлору. И, как оказалось, потребление сложных углеводов ассоциировано с меньшим содержанием бактерий, в большей степени представленных у лиц с изменениями сосудистой стенки. Обсуждение В ходе нашего исследования впервые были показаны различия в составе микробиоты не только в зависимости от субклинических ате- росклеротических поражений сосудов, но и от жесткости сосудистой стенки. После секвенирования всех образцов мы обнаружили, что в микробиоте кишечника испы- туемых жителей Москвы и Московской области преобладали филумы Firmicutes и Bacteroidetes. Схожие результаты получены и в зарубежных исследованиях [12]. Что примечательно, состав микробиоты у испытуемых оказался довольно богатым, индекс альфа-разнообразия был выше среднего показателя в исследованиях с исполь- зованием метода 16 sРНК секвенирования в западных странах (рис. 2) [11, 13]. Индекс Шен- нона, который мы использовали для проведе- ния этого анализа, учитывает не только непо- Сравнительная характеристика клинических параметров пациентов и их питания с высокой и нормальной СРПВ. Таблица 2 Показатель СРПВ<12м/с СРПВ≥12 м/с среднее станд.откл. среднее станд.откл. р Возраст (лет) 50,0794 12,32006 59,2692 10,02221 0,0005 САД (мм рт.ст.) 124,3492 16,07659 133,1154 16,68131 0,0275 ДАД (мм рт.ст.) 77,0730 10,38642 80,5769 6,39483 0,0570 ИМТ (кг/м2) 27,0251 5,00529 28,6948 6,03555 0,2204 ОТ/ОБ (см) 0,8456 0,09159 0,8115 0,37306 0,6495 ИЛ-6 (пг/мл) 9,7911 24,53268 10,4212 19,66157 0,8989 SCORE 1,3333 1,68485 3,9231 4,63830 0,0098 Мочевина (ммоль/л) 5,0222 1,68566 6,2692 1,95464 0,0069 Глюкоза натощак 5,4497 1,22687 6,5615 1,93330 0,0104 вчС-РБ (мг/л) 2,6756 1,71845 5,5846 7,49966 0,0611 HbA1c (%) 5,2331 0,72785 6,0446 1,46343 0,0115 Взаимосвязь состояния сосудистой стенки и состава микробиоты кишечника Таблица 3 Параметр Оценка Ст.ошибка Значение р Род Утолщение КИМ ≥0,9мм 0,2109 0,0555 0,004 Blautia 0,9009 0,2586 0,0092 Serratia КИМ <0,9мм -0,7592 0,1668 0,0003 Prevotella Повышение СРПВ = 10 м/с и более 0,3735 0,0782 0,0001 Bacteroides средственно видовое богатство, но и выравнен- ность (равномерность распределения видов по их обилию) сообщества. Богатое разнообра- зие флоры говорит о ее стабильности как экоси- стемы, а отобранные нами пациенты, в свою оче- редь, не имели тяжелых нарушений или заболе- ваний. В дальнейшем при оценке разнообразия микробиоты мы не нашли различий в группах с и без изменений сосудистой стенки. Наиболее представленными родами в нашей выборке оказались Blautia, Bacteroides, Prevotella, Faecalibacterium, Clostridium. Род Blautia (в част- ности spp Blautia coccoides) оказался самым рас- пространенным. В нашем исследовании именно с Blautia было ассоциировано и увеличение тол- щины КИМ. Blautia coccoides относится к классу грамположительных анаэробных бактерий Clostridia (филум Firmicutes). Не так давно, после филогенетического ана- лиза этих бактерий, Clostridium coccoides были Характер питания и состав микробиоты кишечника Таблица 3 Среднее Ст. ошибка Значение p Таксон Калорийность 0,1094 0,0353 0,0087 Bacteroidetes Жиры 0,6500 0,1766 0,0081 Eubacterium -0,1559 0,0437 0,004 Megasphaera Углеводы 0,2158 0,0557 0,0009 Bacteroidetes Крахмал -0,0011 0,0003 0,0071 Blautia 0,0023 0,0007 0,009 Bifidobacterium Холестерин -0,0020 0,0006 0,0081 Bifidobacterium Этанол -0,0521 0,0144 0,0062 Bifidobacterium переименованы в Blautia coccoides [14]. По дан- ным исследования Tuovinen и соавт, Blautia coccoides активируют секрецию TNF-, цито- кинов, причем интерлейкина-8 даже в большей степени, чем токсин грамотрицательных бакте- рий липополисахарид [15]. При изучении осо- бенностей питания нами было обнаружено, что у испытуемых, потреблявших большее количе- ство крахмала, количество бактерий Blautia было меньшим, а количество «полезных» Bifidobacteria - большим. Ранее было показано, что увеличение потребления крахмалов снижает уровень общего холестерина, липопротеинов низкой плотности [16], а также способствует улучшению эндотели- альной функции [17]. Возможно, такое влияние происходит опосредованно, через воздействие на состав микробиоты кишечника. Также было обнаружено, что бактерии рода Serratia больше представлены у пациентов с утолщением КИМ и стенозом артерий. Serratia - грамотрицательные бактерии семейства Enterobacteriaceae, факультативные анаэробы, оппортунистические патогены. Как и все грамотрицательные бактерии, содержат липополисахарид (ЛПС) - эндотоксин, высво- бождение которого происходит в процессе физи- ологической гибели микроорганизмов и син- теза компонентов мембраны во время жизнеде- ятельности бактерий. Липополисахарид при- сутствует в крови в физиологических концен- трациях, необходимых для поддержания тонуса иммунной системы, что повышает неспецифи- ческую устойчивость к инфекциям и новооб- разованиям [18]. Увеличение концентрации ЛПС выше физиологических запускает систем- ное вялотекущее воспаление, и это может при- водить к дисфункции эндотелия и другим, свя- занным с неспецифическим воспалением, состо- яниям. В ходе исследования был определен род бак- терий, представленность которого была больше у пациентов с нормальными сосудами - это Prevotella - одни из представителей филума Bacteroidetes. В свою очередь Bacteroides -пред- ставители того же филума - в большем количестве присутствовали в микробиоте доноров с ускоренной СРПВ. Причем именно в этом ана- лизе мы исключили лиц с начальной стадией СД2, которые включались в исследования как пациенты с фактором риска ССЗ, то есть, мак- симально исключили воздействие других фак- торов. Интересно, что количество именно этих бактерий в кишечнике было положено неко- торыми исследователями в основу определе- ния энтеротипов, или «фекотипов». Фекотип «Prevotella» фиксирован у людей, потребля- ющих большое количество пищевых волокон, перевариваемых бактериями кишечника, т.е. со «здоровым питанием», относительно лиц с фекотипом «Bacteroides», ассоциированным с т.н. «западной диетой» с большим содержанием животных белков и жиров [19, 20]. Согласно недавно опубликованному исследованию, пред- ставители Bacteroides имеют гены, работа кото- рых запускает воспалительную реакцию [21]. Кроме того, Bacteroides также содержат ЛПС и являются оппортунистическими патогенами. Анализ микробиоты у здоровых доброволь- цев Москвы и Московской области показал, что большее содержание бактерий, потенциально способных вызывать неспецифическое вяло- текущее воспаление, ассоциировано с утолще- нием комплекса интима-медиа и ускорением СРПВ. Возможно, повышение числа этих бак- терий может оказывать воздействие на сосу- дистую стенку путем инициации воспаления, однако для подтверждения подобной гипотезы необходимо проведение более масштабного про- спективного исследования. Основным фактором влияния на микро- биоту является диета, и, как было обнаружено в настоящей работе, чем больше потребление крахмальных полисахаридов, тем меньше пред- ставленность в микробиоте кишечника бакте- рий, показавших взаимосвязь с утолщением КИМ, что было подтверждено в ранних зару- бежных работах, и при более глубоком изуче- нии может стать новой мишенью в воздействии на сосудистую стенку.

About the authors

D A Kashtanova

Email: dr.kashtanova@gmail.com

O N Tkacheva

Email: Tkacheva@rambler.ru

L V Egshatyan

Email: lilit.egshatyan@yandex.ru

E V Plokhova

Email: evplokhova@gmail.com

A S Popenko

Email: a.s.popenko@niifhm.ru

A V Tyakht

Email: at@niifhm.ru

D G Alexeev

Email: exappeal@gmail.com

Yu V Kotovskaya

S А Boytsov

Email: prof-boytsov@mail.ru

References

Supplementary files