Wolbachia Infection among Fleas (Siphonaptera: Insecta) of Sverdlovsk Region and Khabarovsk Territory
- Authors: Ilinsky Y.Y.1, Yudina M.A.2, Kalmykova E.A.2, Bykov R.A.1, Vysochina N.P.3, Vinarskaya N.P.4, Zakharov I.K.1
-
Affiliations:
- Institute of Cytology and Genetics
- Novosibirsk State University
- Khabarovsk Antiplague Station
- Omsk State Research Institute of Natural Foci Infections
- Issue: Vol 11, No 1 (2013)
- Pages: 32-35
- Section: Articles
- URL: https://journals.eco-vector.com/ecolgenet/article/view/2392
- DOI: https://doi.org/10.17816/ecogen11132-35
- ID: 2392
Cite item
Full Text
Abstract
Keywords
Full Text
ВВЕДЕНИЕ Виды отряда блох (Siphonaptera) — это высокоспециализированные эктопаразиты млекопитающих и птиц. Строгая специфичность по отношению к хозяину существует только у блох летучих мышей, остальным представителям отряда присущ широкий спектр хозяев. Классификация блох неоднократно претерпевала изменения и не может считаться окончательной (Wagner, 1939; Jordan, 1948; Smit, 1982). В нашей работе мы используем классификацию, предложенную С. Г. Медведевым, согласно которой выделяются четыре инфраотряда: Pulicomorpha, Pygiopsyllomorpha, Hystrichopsyllomorpha и Ceratophyllomorpha, включающие более 2 тыс. видов (Медведев, 1990, 1994, 1998, 2009). При этом описанная фауна Палеарктики значительно превосходит по объему любые другие области (Медведев, 2009). Блохи могут выступать как самостоятельные болезнетворные агенты, в частности, вызывать кожные заболевания, такие как пуликоз (Pulex irritans) и саркопсиллез (Tunga penetrans). Кроме того, они являются переносчиками более двух десятков инфекционных агентов (Whiting et al., 2008; Росс и др., 1987). Следует отметить, что в исследованиях блох отдается предпочтение отдельным видам, таким как Pulex irritans, Ctenocephalides felis, C. сanis, Spilopsyllus cuniculi, Xenopsylla cheopis – блохи человека, кошек, собак, кроликов и крыс соответственно. Альфа-протеобактерия Wolbachia — матерински наследуемый внутриклеточный симбионт членистоногих и некоторых паразитических нематод. Среди насекомых, по разным оценкам, Wolbachia может быть обнаружена у 15–66 % видов насекомых (Werren, 1997; Jeyaprakash, Hoy, 2000; Hilgenboecker et al., 2008; Zag, Hammerstein, 2012). К началу проведения нашего исследования присутствие Wolbachia было отмечено только для 25 видов блох, которые относятся к трем наиболее многочисленным инфраотрядам отряда Siphonaptera: Pulicomorpha, Hystrichopsyllomorpha и Ceratophyllomorpha. В основном в работах исследовались образцы видов, собранные на территории Северной и Южной Америки (Gorham et al., 2003; Dittmar, Whiting, 2004; Luchetti et al., 2005), за исключением работы по кошачьей блохе (Ctenocephalides felis) из Франции (Rolain et al., 2003). Уровень инфицированности может сильно различаться между видами: от 7 % у Ctenocephalides сanis до 94 % у Pulex simulans (Gorham et al., 2003). Отмечается и высокая вариабельность уровня инфекции среди популяций разных частей ареала. Так, в различных сборах популяций песчаной блохи Tunga penetrans показано как отсутствие Wolbachia (Luchetti et al., 2004), так и тотальная зараженность (Fischer et al., 2002; Heukelbach et al., 2004; Luchetti et al., 2005). Кроме того, для этого вида выявлен факт суперинфицированности, т. е. присутствие в одной особи филетически удаленных штаммов Wolbachia (Luchetti, 2005). Исследования инфицированности Wolbachia видового разнообразия блох на обширной территории Северной Евразии и, в частности России, отсутствуют. Нами был проведен поиск фактов инфицированности эндосимбиотической бактерией Wolbachia среди видов блох, обитающих на территории Свердловской области и Хабаровского края, образцы которых были собраны в 2009 и 2011 гг. соответственно. В данной работе мы впервые показали инфицированность Wolbachia для шести видов блох: Doratopsylla birulai, Hystrichopsylla talpae, Neopsylla acanthina, Frontopsylla elata botis, Megabothris advenarius, M. сalcarifer. Учитывая результаты более ранних работ (Fischer et al., 2002; Gorham et al., 2003; Dittmar, Whiting, 2004; Heukelbach et al., 2004; Luchetti et al., 2005; Sekeyova et al., 2012), мы констатируем 31 симбиотическую ассоциацию Siphonaptera-Wolbachia. По нашим оценкам, как минимум 500 из описанных к настоящему моменту 2 тыс. видов блох могут оказаться инфицированными Wolbachia. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Коллекция блох. Коллекция блох создана на основе сбора насекомых с диких животных на территории Свердловской области (2009 г.) и Хабаровского края (2011 г.) и включает 252 образца (табл. 1). Видовое разнообразие представлено 15 видами, которые относятся к двум инфраотрядам: (1) Hystrichopsyllomorpha — сем. Hystrichpsyllidae 9 видов; (2) Ceratophyllomorpha — сем. Ceratophyllidae, 4 вида, и сем. Leptopsyllidae, 2 вида. Вид Palaeopsylla sorecis был представлен как в сборах Свердловской области, так и Хабаровского края. До выделения ДНК коллекция блох хранилась в 96%-м спирте при температуре –20 оС. Выделение ДНК и установление статуса инфицированности. Экстракцию ДНК проводили общепринятыми методом (Marmur, 1961) с модификациями. Блох индивидуально гомогенизировали в 100 µl экстрагирующего буфера (10 mM TRIS-HCl (pH 8.0), 25 mM ЭДТА, 0,5 % SDS, 0,1 M NaCl) и инкубировали при +56 оС в течение 5 часов. После преципитации ДНК растворяли в 100 µl бидистиллированной воды. Все образцы ДНК проверялись на качество посредством амплификации с универсальными для насекомых праймерами 28sF3633 (5'-TACCGTGAGGGAAAGTTGAAA-3') и 28sR4076 (5'-AGACTCCTTGGTCCGTGTTT-3') (Choudhury, Werren, не опубликовано). Статус инфицированности устанавливалb на основе амплификации ДНК со специфичными праймерами к 16SrRNA гену Wolbachia (рис. 1) W-Specf 5'-CATACCTATTCGAAGGGATAG-3' и W-Specr 5'-AGCTTCGAGTGAAACCAATTC-3' (Werren, Windsor, 2000). Дополнительно к этому Wolbachia-позитивные образцы в дальнейшем также проверяли с праймерами к генам gatB (5'-GAKTTAAAYCGYGCAGGBGTT-3', gatBR1: 5'-TGGYAAYTCRGGYAAAGATGA-3' (Baldo et al., 2006) и wsp (81F 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3', 691R 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3' (Zhou et al., 1998). Реакционная смесь общим объемом 20 µl содержала 2 µl ПЦР-буфера (Медиген, Новосибирск), 2 µl dNTP (0,8 мМ), 2 µl MgCl2 (3,0 мМ), по 4 µl каждого праймера (0,3 мМ), 0,5 U Taq-полимеразы. Условия ПЦР: 30 циклов, первичная денатурация +94 °C 2', затем +94 °C 30'' в каждом цикле, отжиг праймеров: +54 °C — 50'' для 28sF3633/R4076 и +55 °С — 45'' для W-Spec; элонгация для 28SrRNA — 1' и для W-Spec — 1'30'', финальная элонгация в течение 9'. Ампликоны визуализировали в 1,5 % агарозном геле. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Все выделенные образцы ДНК оказались надлежащего качества, после скрининга эндосимбиотическая бактерия была обнаружена у видов-представителей обоих инфраотрядов: Hystrichopsyllomorpha и Ceratophyllomorpha. В нашем исследовании все случаи присутствия инфекции выявлены впервые. В целом Wolbachia-позитивными оказались 40 % видового разнообразия коллекции и 11 % общего числа образцов (табл. 1). Количество экземпляров каждого вида в изучаемой коллекции варьирует от 1 до 82. Исходя из этого, мы разделили коллекцию на две группы: [1] виды, представленные малым (от 1 до 13) и [2] — значительным числом образцов (от 20 до 82). Среди первой группы у 4 из 11 видов была обнаружена Wolbachia, что может указывать на высокую долю инфицированных бактерией особей в популяции этих видов. При этом отсутствие Wolbachia во второй группе коллекции: Leptopsylla pectiniceps (82 особи) и Ctenophthalmus congeneroides (62) вовсе не означает, что эти виды свободны от Wolbachia. Действительно, Hilgenboecker et al. (2008) констатировали феномен распределения Wolbachia внутри отдельно взятого вида на очень высоком (>90 %) или низком уровне (<10 %). Высокая концентрация инфицированных особей в популяциях может указывать как на то, что бактерии вызывают какие-либо репродуктивные аномалии, так и на то, что симбиоз носит мутуалистический характер. Общеизвестно, что у членистоногих бактерия вызывает различные репродуктивные аномалии: цитоплазматическую несовместимость, андроцид, феминизацию и партеногенез (последние 3 приводят к сдвигу в соотношении полов). Однако для представителей блох нет никакой информации о возможной биологической роли Wolbachia. Так, регистрируемые случаи сдвига в соотношении полов в популяциях блох (Gorham et al., 2003) могут объясняться не влиянием Wolbachia, как отмечают сами авторы, а половым диморфизмом, когда самцы характеризуются более короткой продолжительностью жизни (Marshall, 1981). В нашей работе впервые получены данные о статусе инфицированности Wolbachia 15 видов блох для ранее неисследованного биоразнообразия и ареала, что существенно дополняет наше представление о распространенности эндосимбиотической бактерии Wolbachia среди видов отряда Siphonaptera. Суммируя ранее опубликованные и наши результаты мы констатируем о 31 факте симбиотической ассоциации «Wolbachia — виды отряда Siphonaptera». Мы попытались оценить уровень распространения бактерии среди видов блох. Dittmar и Whiting (2004) выявили инфицированность Wolbachia у 20 из 79 видов блох (25 %), но при этом анализировалась только одна особь от каждого вида. Следовательно, данное значение можно рассматривать как нижнюю границу инфицированности среди блох, в частности, таких больших инфраотрядов как Hystrichopsyllomorpha и Ceratophyllomorpha. В нашем исследовании общая зараженность Wolbachia составила 40 %, что, на наш взгляд, также можно рассматривать как заниженное значение, поскольку в большинстве своем выборки видов немногочисленны. Таким образом, принимая оценку нижней границы инфицированности блох на уровне 25 %, и экстраполируя на описанное видовое разнообразие, как минимум 500 видов отряда Siphonaptera инфицировано Wolbachia. В действительности это значение может оказаться значительно выше. Результаты анализов нуклеотидного разнообразия среди изолятов Wolbachia из различных видов блох демонстрируют несколько филетических линий (Ros et al., 2009), которые относятся к паразитам (артрапод-инфицирующим) и мутуалистам (нематод-инфицирующим). Поэтому дальнейшее направление исследований требует проведения филогенетического анализа выявленных изолятов Wolbachia на основе современного протокола описания штаммов (Baldo et al., 2006), а также расширения скрининга видового разнообразия и ареала исследования. Благодарности Авторы выражают благодарность к. б. н. В. А. Рар (ИХБФМ СО РАН) за помощь в осуществлении исследования. Работа частично поддержана Российским Фондом Фундаментальных исследований № 12-04-31784-мол_а, № 12-04-01319-а и Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Живая природа: Современное состояние и проблемы развития», проект № 30.33.About the authors
Yury Yuryevich Ilinsky
Institute of Cytology and Genetics
Email: paulee@bionet.nsc.ru
Candidate of Biological Sciences, Laboratory of Populations Genetics, Novosibirsk State University, Department of Cytology and Genetics
Mariya Aleksandrovna Yudina
Novosibirsk State University
Email: maryjudina@gmail.com
Student, Department of Cytology and Genetics
Ekaterina Alekseevna Kalmykova
Novosibirsk State University
Email: ekkalm@yandex.ru
Student, Department of Cytology and Genetics
Roman Andreyevich Bykov
Institute of Cytology and Genetics
Email: bikovra@gmail.com
Postgraduate student, Laboratory of Populations Genetics
Nelya Pavlovna Vysochina
Khabarovsk Antiplague Station
Email: neljavis@mail.ru
Head of the laboratory
Natalya Petrovna Vinarskaya
Omsk State Research Institute of Natural Foci Infections
Email: vinarskayan@inbox.ru
Can. of Biological Sciences, Lab. of Arthropod-Borne Viral Infections
Ilya Kuzmich Zakharov
Institute of Cytology and Genetics
Email: zakharov@bionet.nsc.ru
Doctor of Biological Sciences, Professor Head of the laboratory of Populations Genetics, Department of Cytology and Genetics
References
- Медведев С. Г., 1990. Классификация блох и проблемы ее обоснования // Успехи медицинской энтомологии и акарологии в СССР. С. 20–22.
- Медведев С. Г., 1998. Классификация отряда блох (Siphonaptera) и ее теоретические предпосылки //Энтомологическое обозрение. T. 77. C. 916–934.
- Медведев С. Г., 1994. Морфологические основы классификации отряда блох (Siphonaptera): Автореф. дис... докт. биол. наук. СПб, 50 c.
- Медведев С. Г., 2009. Систематика и географическое распространение и пути эволюции блох // Труды зоологического института РАН. Т. 313. C. 273–282.
- Росс Г., Росс Ч., Росс Д., 1985. Энтомология. М.: Мир. 576 с.
- Baldo L., Dunning Hotopp J. C., Jolley K. A., et al., 2006. Multilocus sequence typing system for the endosymbiont Wolbachia pipientis // Applied Environmental Microbiology. Vol. 72. P. 7098–7110.
- Dittmar K., Whiting M. F., 2004. New Wolbachia endosymbionts from nearctic and neotropical fleas (Siphonaptera) // J. Parasitol. Vol. 90. P. 953–957.
- Fischer P., Schmetz C., Bandi C. et al., 2002. Tunga penetrans: molecular identification of Wolbachia endobacteria and their recognition by antibodies against proteins of endobacteria from filarial parasites // Experimental Parasitology. Vol. 102. P. 201–211.
- Gorham C. H., Fang Q. Q., Durden L. A., 2003. Wolbachia endosymbionts in fleas (Siphonaptera) // J. Parasitol. Vol. 89. P. 283–289.
- Hilgenboecker K., Hammerstein P., Schlattmann P. et al., 2008. How many species are infected with Wolbachia? — A statistical analysis of current data //FEMS Microbiol. Lett. Vol. 281. P. 215–220.
- Jeyaprakash A., Hoy M. A., 2000. Long PCR improves Wolbachia DNA amplification: wsp sequences found in 76 % of sixty-three arthropod species // Insect Molecular Biology. Vol. 9, N 4. P. 393–405.
- Luchetti A., Mantovani B., Fioravanti M. L., Trentini M., 2004. Wolbachia infection in the newly described Ecuadorian sand flea, Tunga trimamillata // Exp. Parasitol. Vol. 108. P. 18–23.
- Luchetti A., Mantovani B., Trentini M., 2005. Wolbachia superinfection in an Ecuadorian sample of the sand-flea Tunga penetrans (Preliminary note) // Bull. Ins. Vol. 58. P. 93–94.
- Pampiglione S, Fioravanti M. L., Gustinelli A. et al., 2009. Sand flea (Tunga spp.) infections in humans and domestic animals: state of the art // Medical and Veterinary Entomology. Vol. 23. P. 172–186.
- Rolain J-M., Franc M., Davoust B., Raoult D., 2003. Molecular detection of Bartonella quintana, B. koehlerae, B. henselae, B. clarridgeiae, Rickettsia felis and Wolbachia pipientis in cat fleas, France // Emerging Infectious Diseases. Vol. 9. P. 338–342.
- Ros V. I. D., Fleming V. M., 2009. How diverse is the Genus Wolbachia? Multiple-gene sequencing reveals a putatively new Wolbachia supergroup recovered from spider mite (Acari: Tetranychidae) // Applied and Environment Microbiology. Vol. 7. P. 1036–43.
- Werren J. H., 1997. Biology of Wolbachia // Annual Review of Entomology. Vol. 42. P. 587–609.
- Whiting M. F., Whiting A. S., Hastriter M. W. et al., 2008. A molecular phylogeny of fleas (Insecta: Siphonaptera) and host association // Cladistics. Vol. 24. P. 677–707.
- Zag P., Hammerstein P., 2012. Still a host of hosts for Wolbachia: analysis of recent data suggests that 40% of terrestrial arthropod species are infected // PloS ONE. Vol. 7. I. 6. e38544.