Overexpression of genes encoding asparagine-glutamine rich transcriptional factors causes nonsense suppression in Saccharomyces cerevisiae

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Терминация трансляции полипептидной цепи на рибосоме является одним из базовых молекулярных процессов, обеспечивающих экспрессию генетического материала. Его ключевыми и наиболее изученными участниками у дрожжей являются факторы терминации трансляции eRF1 (Sup45p) и eRF3 (Sup35p) (Zhouravleva et al., 1995; Stanfield et al., 1995). Снижение эффективности терминации трансляции приводит к повышению частоты прочтения стоп-кодонов в качестве значащих. Фенотипические изменения в эффективности терминации трансляции могут детектироваться у дрожжей S. cerevisiae по росту штаммов, несущих нонсенс-мутации в различных генах. Этот фенотипический эффект получил название нонсенс-супрессии. Так, снижение эффективности терминации трансляции в дрожжевом штамме, несущем аллель ade1–14UGA, вызывает рост на селективной среде без аденина (Инге-Вечтомов и др., 1988). Следует отметить, что причиной нонсенс-супрессии может быть не только снижение эффективности терминации трансляции, но и ряд других факторов. В их числе изменения в эффективности деградации некоторых мРНК или мутации в структурных и регуляторных участках генов ряда тРНК (Weiss et al., 1987; Ong et al., 1997; Ono et al., 2005). Определенные мутации в генах SUP35 и SUP45 влекут за собой снижение эффективности терминации трансляции и нонсенс-супрессию (Инге-Вечтомов, Адрианова, 1970). Таким образом, нонсенс-супрессия является основным фенотипическим маркером, сигнализирующим о нарушениях терминации трансляции. Это обусловливает важность исследования факторов, детерминирующих нонсенс-супрессию. Можно предположить, что изменения в уровне экспрессии генов, регулирующих SUP35 и SUP45, а прежде всего, генов, кодирующих транскрипционные факторы, будут оказывать влияние на эффективность терминации трансляции и, как следствие, на нонсенс-супрессию. Это связано с тем, что снижение уровня продукции факторов терминации трансляции может привести к недостаточной эффективности терминации трансляции. В случае нонсенс-аллели ade1–14 это будет приводить к прочтению с определенной частотой преждевременного нонсенс-кодона UGA как значащего, синтезу белка Ade1 и росту штамма на селективной среде без аденина. Вместе с тем таких свидетельств до настоящего времени получено не было, хотя выявлен целый ряд транскрипционных факторов для SUP35 и SUP45. Одной из наиболее примечательных особенностей известных транскрипционных факторов гена SUP45 является то, что все они обогащены остатками аспарагина (N) и глутамина (Q) (Dagkessamanskaya et al., 1997; Workman et al., 2006; Lee et al., 2002). Роль N/Q-обогащенных белков активно изучалась в дрожжах в связи с тем, что такие белки, зачастую могут формировать амилоидные полимеры, то есть высокомолекулярные упорядоченные агрегаты (Alberti et al., 2009; Chiti and Dobson, 2006). Некоторые N/Q-обогащенные белки дрожжей обладают прионными свойствами: они формируют инфекционные амилоидные агрегаты (Crow and Li, 2011). К N/Q-обогащенным прионам относится и белок Sup35p (Wickner, 1994). В последнее время получены новые, крайне любопытные свидетельства в пользу функциональной роли N/Q-трактов. Так, показано, что мутантный поли-Q тракт человеческого белка хантингтина обладает способностью связываться с промоторами и изменять уровень экспрессии целого ряда генов (Benn et al., 2008). Таким образом, повышенное содержание N и Q в первичных последовательностях белков может играть двоякую роль, с одной стороны детерминируя их потенциально амилоидные свойства, а с другой — определяя высокую афинность к нуклеиновым кислотам и соответствующие функции. Ранее мы проводили поиск новых супрессоров при помощи геномных скринингов в штаммах, несущих различные модифицированные варианты SUP35. В результате были выявлены новые многокопийные супрессоры нонсенс-мутаций NAB2, NAB3 и VTS1 (Нижников и др., 2011; Nizhnikov et al., 2012). Одним из основных выводов из этих исследований стало то, что использование штаммов, несущих модифицированные варианты SUP35, позволяет выявлять супрессоры, которые не могут быть идентифицированы в штаммах, несущих SUP35 дикого типа. То есть за счет изменений в последовательности SUP35 возникает некий «провокационный» генетический фон, вскрывающий тех игроков, которые были замаскированы в нормальных условиях. В данной работе мы исследовали влияние сверхэкспрессии N/Q-обогащенных транскрипционных факторов гена SUP45. Мы предположили, что использование штаммов, несущих модифицированные варианты SUP35 позволит создать фон, на котором можно будет получить фенотипическое проявление сверхэкспрессии данных генов. Проведенный анализ показал, что сверхэкспрессия шести генов: ABF1, GLN3, FKH2, MCM1, MOT3 и REB1, вызывает нонсенс-супрессию на специфическом генетическом фоне. Эти данные имеют существенное значение в контексте исследования взаимосвязи между процессами транскрипции и трансляции. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Методы анализа in silico Выявление групп белков с достоверно повышенной частотой определенных функций в выборке по сравнению с протеомом проводили с использованием программы «GoMiner» (http://discover.nci.nih.gov/gominer/index.jsp). Функциональную характеристику белков проводили на основании данных из базы «Gene Ontology» (http://www.geneontology.org/). Поиск потенциальных транскрипционных факторов проводили в базе данных «YeasTract» (http://www.yeastract.com/). Штаммы, среды и условия культивирования микроорганизмов В работе применяли стандартные методы дрожжевой генетики (Kaiser et al. 1994). Генотипы штаммов дрожжей приведены в таблице 1. Для амплификации плазмидной ДНК использовали штамм Escherichia coli DH5α (Hanahan, 1985). При культивировании E. coli использовали жидкую и твёрдую среду LB (Sambrook et al., 1989). Дрожжи культивировали при 30 °С на твердой и жидкой среде YAPD, а также на синтетических средах, содержащих необходимые витамины, микроэлементы и аминокислоты (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986). Для экспрессии генов под контролем регулируемого промотора CUP1, в среды добавляли 150 мкМ CuSO4. Нонсенс-супрессию оценивали по росту штамма на селективной среде без аденина на седьмой день инкубации при 30 °С. Для селекции клонов, потерявших плазмиды, несущие ген URA3, использовали минимальную селективную среду с добавлением 1 г/л фтороротовой кислоты (ФОК) (Kaiser et al., 1994). Плазмиды Все использованные в работе плазмиды содержат дрожжевой и бактериальный ориджины репликации. Многокопийные плазмиды PCUP1-GFP (URA3) и pL-Aβ-Sup35MC, несущие гены GFP и Aβ-SUP35MC соответственно, под контролем промотора CUP1, получены нами ранее (Рубель и др., 2008; Saifitdinova et al., 2010). Центромерная плазмида pRS315-SUP35MC, несущая ген SUP35MC под контролем собственного промотора, а также гены AmpR и LEU2, любезно предоставлена Ю. О. Черновым (Технологический институт шт. Джорджия, США). Центромерная плазмида pASB-2, содержащая последовательность SUP35 под контролем собственного промотора, а также гены AmpR и LEU2, любезно предоставлена А. С. Борхсениусом (Санкт-Петербургский государственный университет, Россия). Плазмида pU-VTS1 содержит последовательность гена VTS1 под контролем промотора CUP1 (Нижников и др., 2011). Многокопийные плазмиды серии pU-CUP1 (pU-ABF1, pU-CYC8, pU-FKH2, pU-GAL11, pU-GLN3, pU-INO4, pU-MCM1, pU-MOT3, pU-PGD1, pU-REB1 и pU-SFP1) предназначены для сверхэкспрессии генов ABF1, CYC8, FKH2, GAL11, GLN3, INO4, MCM1, MOT3, PGD1, REB1, и SFP1. Плазмиды получены путем инсерции ПЦР-фрагментов соответствующих генов (условия ПЦР, матрицы и праймеры описаны в разделе Молекулярно-биологические методы) в плазмиду PCUP1-GFP (URA3). Инсерция фрагмента производилась по сайтам BamHI и SacI (pU-ABF1, pU-CYC8, pU-GLN3, pU-INO4, pU-MCM1, pU-MOT3 и pU-REB1), BglII и SacI (pU-FKH2 и pU-SFP1), BamHI и NotI (pU-GAL11) или BglII и NotI (pU-PGD1). Плазмиды содержат перечисленные гены под контролем индуцибельного промотора CUP1, а также гены AmpR и URA3. Наличие вставок требуемых генов подтверждали при помощи секвенирования с использованием праймера CUP1-End. Молекулярно-биологические методы Использованные для конструирования плазмид серии pU-CUP1 последовательности генов ABF1, CYC8, FKH2, GAL11, GLN3, INO4, MCM1, MOT3, PGD1, REB1 и SFP1 были получены клонированием при помощи ПЦР с геномной ДНК штамма 1-Д933. Последовательности праймеров для ПЦР приведены в таблице 2. Метод бицистронной люминесценции для количественной оценки эффективности терминации трансляции выполняли как описано ранее (Nizhnikov et al., 2012). Для этого были использованы плазмиды pDB691 (UGAC) и pDB690 (CGAC), несущие тандемно расположенные гены, кодирующие люциферазы Renilla и светлячка, разделенные стоп-кодоном UGA (pDB691) или значащим кодоном CGA (pDB690). Измерения проводили в люминометре и с использование набора «Dual Reporter Assay» производства компании «Promega» (США). Процент считывания стоп-кодона как значащего вычисляли как частное показаний активности люциферазы Renilla и люциферазы светлячка, экспрессируемых с плазмиды pDB691, умноженное на частное показаний активности люциферазы светлячка и люциферазы Renilla (pDB690). Значения представлены с планками погрешностей, соответствующими стандартному отклонению. Достоверность отличия от контроля проверяли непараметрическим критерием Манна–Уитни с использованием программного обеспечения «Statistica» версии 6.0 производства «StatSoft» (США). РЕЗУЛЬТАТЫ Анализ комплекса N/Q-обогащенных белков дрожжей in silico Для выбора N/Q-обогащенных транскрипционных факторов была сформирована общая выборка N/Q-обогащенных белков дрожжей. Поиск таких белков in silico ранее был проведен в работе Харрисон и Герштейн (Harrison and Gerstein, 2003) при помощи композиционного подхода, основанного на поиске белков, наиболее насыщенных N и Q. Авторы получили список из 170 белков, в который, тем не менее, не вошел ряд N/Q-обогащенных белков, что связано с особенностями использованного алгоритма. Так, поскольку минимальная длина тракта для анализа насыщенности N и Q составляла 25 аминокислот, то в список Харрисон и Герштейн не вошли белки, имеющие короткие поли-N или поли-Q тракты, но не насыщенные данными аминокислотами на остальных участках последовательности. Большая часть таких белков была выявлена в списке, полученном при помощи скрытой Марковской модели (Alberti et al., 2009), параметры которой были заданы последовательностями известных N/Q-обогащенных амилоидов: New1p (Osherovich and Weissman, 2001), Rnq1p (Derkatch et al., 2001; Derkatch et al., 1997), Sup35p и Ure2p (Wickner, 1994; Ter-Avanesyan et al., 1994). Для того чтобы учесть максимальное количество N/Q-обогащенных белков мы объединили эти списки в один, состоящий из 238 генов (таблица 3). Данный список наиболее полно отражает состав комплекса N/Q-обогащенных белков дрожжей и может быть удобен для работы по поиску и характеристике амилоидов, так как в него входят все идентифицированные на данный момент N/Q-обогащенные амилоидные белки S. cerevisiae. Функциональный анализ этой выборки, проведенный при помощи программы «GoMiner» показал, что в ней статистически достоверно, в сравнении с протеомом в целом, повышены частоты белков, выполняющих различные функции, однако особенно сильно отличаются частоты белков, связывающих нуклеиновые кислоты (таблица 4). Так, в выборке более чем в три раза повышены частоты транскрипционных факторов, а также белков, связывающих мРНК и полипурины. Далее из полученной выборки мы отобрали ряд генов, кодирующих транскрипционные факторы. В этот список вошли 11 генов. Четыре из них (ABF1, INO4, REB1, SFP1) кодируют охарактеризованные транскрипционные факторы SUP45, три — потенциальные (FKH2, MCM1, MOT3), четыре оставшихся гена (CYC8, GAL11, GLN3, PGD1) являются глобальными регуляторами транскрипции, влияющими на экспрессию генов, кодирующих транскрипционные факторы SUP45. Мы проанализировали влияние сверхэкспрессии этих генов на нонсенс-супрессию в дрожжах S. cerevisiae. Изучение эффектов сверхэкспрессии генов, кодирующих N/Q-обогащенные транскрипционные факторы Для экспрессии выбранных для анализа генов под контролем промотора CUP1 нами была получена серия плазмид pU-CUP1, маркированных URA3. Этими плазмидами были трансформированы штаммы 1-1-2-1-1-Д931, 1-2-1-1-Д931 и 2-4-1-1-Д931 (табл. 1). Данные штаммы содержат делецию хромосомной копии SUP35, и несут плазмидные копии SUP35, SUP35MC и Aβ-SUP35MC. Эти варианты SUP35 обладают различной супрессорной способностью. Так, сверхэкспрессия гена VTS1 вызывает сильную нонсенс-супрессию на фоне продукции Aβ-Sup35MC, слабую на фоне SUP35MC, и не вызывает нонсенс-супрессии на фоне продукции полноразмерного SUP35 (Нижников и др., 2011; Nizhnikov et al., 2012). Штаммы 1-1-2-1-1-Д931, 1-2-1-1-Д931 и 2-4-1-1-Д931 были трансформированы плазмидами серии pU-CUP1 и высеяны на селективную среду без лейцина и урацила с добавлением 150 мкМ CuSO4, что обеспечивает активацию промотора CUP1 и сверхэкспрессию исследуемых генов. В дальнейших экспериментах во все среды был добавлен 150 мкМ CuSO4. Пятьдесят трансформантов каждой плазмидой были отобраны на селективной среде без лейцина и урацила и через двое суток методом отпечатков перенесены на селективные среды без лейцина, урацила и аденина, а также без лейцина урацила и триптофана. Далее, через четверо суток инкубации оценивали уровень нонсенс-супрессии. Поскольку многие из тестируемых генов являются глобальными регуляторами транскрипции, мы также провели оценку влияния сверхэкспрессии этих генов на вегетативный рост на средах с глюкозой и галактозой в качестве источника углерода (табл. 5). Результаты анализа нонсенс-супрессии на среде без аденина представлены на рисунке 1, на среде без триптофана в таблице 5. Полученные данные показывают, что сверхэкспрессия генов ABF1, GLN3, FKH2, MCM1, MOT3 и REB1 вызывает различную по эффективности нонсенс-супрессию на среде без аденина на фоне продукции химерного белка Aβ-Sup35MC, сверхэкспрессия гена MOT3 вызывает также слабую супрессию ade1–14 на фоне продукции Sup35MCp (рис. 1). Таким образом, среди всех проанализированных генов сверхэкспрессия MOT3 наиболее сильно влияет на нонсенс-супрессию на данном генетическом фоне. Это может быть связано с тем, что MOT3, по данным «YeasTract», потенциально может регулировать экспрессию и SUP35, и SUP45. Ни один из исследуемых транскрипционных факторов не вызывает супрессию ade1–14 в штамме, продуцирующем полноразмерный Sup35p, и ни один из них не вызывает супрессию trp1–289 ни в одном из анализируемых штаммов (табл. 5). Сверхэкспрессия генов ABF1, FKH2, GAL11, GLN3, MCM1, MOT3, REB1 и SFP1 вызывает подавление вегетативного роста во всех исследуемых штаммах (табл. 5). Нами также был проведен дополнительный эксперимент по анализу супрессии нонсенс-аллели ade1–14 после потери плазмид для сверхэкспрессии в штамме, продуцирующем Aβ-Sup35MC. Необходимость этого эксперимента вызвана тем, что тестируемые N/Q-обогащенные белки могут обладать также прионными свойствами (Cyc8p, Mot3p и Sfp1p являются дрожжевыми прионами), и наблюдаемая нонсенс-супрессия может быть связана с прионизацией соответствующего белка. В этом случае можно ожидать, что нонсенс-супрессия сохранится после потери плазмиды для сверхэкспрессии. Проведенный эксперимент по потере плазмид на среде с ФОК с последующим анализом нонсенс-супрессии на среде без аденина показал, что нонсенс-супрессия не сохраняется после потери всех исследуемых плазмид (табл. 5). Таким образом, наблюдаемая нонсенс-супрессия не является результатом прионизации исследуемых белков. Для того чтобы определить влияет ли сверхэкспрессия генов BF1, GLN3, FKH2, MCM1, MOT3 и REB1 на эффективность терминации трансляции, мы воспользовались методом бицистронной люминесценции, называемым также методом двойного репортера («dual reporter assay»). Дрожжевой штамм был ко-трансформирован многокопийными плазмидами для сверхпродукции соответствующих транскрипционных факторов из геномной библиотеки YSC4613 (“Open Biosystems”) и одной из плазмид pDB: pDB691 (в опыте) или pDB690 (в контроле). В качестве общего контроля базового уровня эффективности терминации трансляции использовали штамм, трансформированный контрольным вектором pRS315. Полученные результаты (рис. 2) показывают, что эффективность терминации трансляции снижается при сверхэкспрессии ABF1 и GLN3 (p ≤ 0,05). Для других транскрипционных факторов достоверного снижения эффективности терминации трансляции не установлено, хотя штаммы со сверхэкспрессией FKH2, MCM1 и MOT3 демонстрируют более высокие средние значения частоты прочтения стоп-кодона UGA, чем контрольный штамм. ОБСУЖДЕНИЕ Исторически исследования N/Q-обогащенных последовательностей и нонсенс-супрессии у дрожжей S. cerevisiae тесно связаны. У этого организма идентифицированы уже два N/Q-обогащенных прионных белка: Sup35p и Sfp1p (Wickner, 1994; Rogoza et al. 2010), а также гены, кодирующие N/Q-обогащенные белки Nab2p, Nab3p и Vts1p, участвующие в регуляции нонсенс-супрессии (Нижников и др., 2011; Nizhnikov et al., 2012). Следует отметить, что все эти гены, по всей видимости, регулируют нонсенс-супрессию путем влияния на эффективность терминации трансляции, хотя возможны и другие механизмы, опосредующие данный процесс. В настоящем исследовании проведен поиск генов, кодирующих N/Q-обогащенные транскрипционные факторы, влияющих на нонсенс-супрессию. Функциональный анализ полученного набора N/Q-обогащенных белков, проведенный при помощи программы «GoMiner», показал, что его наиболее примечательной особенностью является существенно повышенная частота белков, связывающих нуклеиновые кислоты (табл. 4). Данные о том, что именно N/Q-обогащенные домены участвуют во взаимодействии с ДНК или РНК, на данный момент, ограничены. Наиболее существенными являются свидетельства в пользу того, что поли-Q тракт человеческого амилоида хантингтина может выступать в качестве кофактора транскрипционной активации (Cong et al., 2012). При этом роль хантингтина в регуляции транскрипции, согласно предложенным гипотезам, сводится к специфическому взаимодействию с белками-транскрипционными факторами, что, собственно, и меняет их функциональные свойства. В этом случае возникает вопрос, почему среди N/Q-обогащенных белков так много белков непосредственно связывающих нуклеиновые кислоты? На этот вопрос может быть получено два ответа. Первый состоит в том, что поли-N и поли-Q являются функциональными последовательностями, связывающими нуклеиновые кислоты. В пользу этого варианта есть определенные свидетельства. Так, показано, что мутантный хантингтин, содержащий увеличенное количество повторов Q, связывается непосредственно с промоторами и изменяет их конформацию, препятствуя посадке нормальных транскрипционных факторов (Benn et al., 2008). Второй возможный ответ касается взаимодействия амилоидов друг с другом. Можно предположить, что различные белковые комплексы, в том числе комплексы транскрипционных факторов, могут состоять преимущественно из N/Q-обогащенных белков, взаимодействующих друг с другом через поли-N или Q последовательности. В поддержку этой гипотезы есть конкретный пример: ранее мы выявили в качестве омнипотентного супрессора N/Q-обогащенный белок Vts1, формирующий при сверхпродукции агрегаты (Nizhnikov et al., 2012). Этот белок вызывает деградацию специфических мРНК путем связывания с эволюционно-консервативной деаденилазой Ccr4-Pop2-Not (Rendl et al., 2008; Aviv et al., 2003). Белки Pop2 и Ccr4 также являются N/Q-обогащенными. Другим примером является ядерный поровый комплекс дрожжей, семь белков которого попали в наш список: Nup1, Nup42, Nup49, Nup57, Nup100, Nup116, Nup145. Таким образом, постепенно накапливаются свидетельства о функциональной роли поли-N и Q последовательностей, которая может заключаться как в непосредственном связывании ими нуклеиновых кислот, так и во взаимодействии друг с другом в составе макромолекулярных белковых комплексов. Последнее касается и N/Q-обогащенных транскрипционных факторов, которые исследовались в данной работе. Так, по данным базы «String» (рис. 3), восемь из этих 11 белков взаимодействуют между собой. Это взаимодействие интересно не только в контексте обсуждаемых проблем, но и поскольку оно может объяснять причины наблюдаемой нами нонсенс-супрессии. Действительно, наиболее вероятным объяснением нонсенс-супрессии, возникающей при сверхэкспрессии генов ABF1, GLN3, FKH2, MCM1, MOT3 и REB1 является снижение эффективности терминации трансляции за счет изменения уровня экспрессии каких-либо генов (в том числе SUP45), вовлеченных в данный процесс. Полученные нами данные показали, что при сверхэкспрессии генов ABF1 и GLN3 наблюдается снижение эффективности терминации (p ≤ 0,05). При сверхэкспрессии FKH2, MCM1 и MOT3 среднее значение частоты считывания нонсенс-кодона UGA также возрастает, однако значения полученных измерений имеют очень большую дисперсию (рис. 2). Это может объясняться общей нестабильностью исследуемых клонов, так как сверхэкспрессия большинства генов, кодирующих исследуемые транскрипционные факторы, существенно снижает жизнеспособность. Нонсенс-супрессия доминирует над подавлением вегетативного роста только в штамме 2-4-1-1-Д931, продуцирующем химерный гомолог Sup35p — белок Aβ-Sup35MC. Возможное объяснение таких эффектов состоит в том, что Aβ-Sup35MC наименее эффективно из всех использованных вариантов Sup35p выполняет функцию фактора терминации трансляции eRF3. Гибридный ген Aβ-SUP35MC является криптическим супрессором по отношению к выявленным нами генам, то есть фактором, модифицирующим генетический фон и позволяющим выявлять новые гены, контролирующие нонсенс-супрессию. По-видимому, генетическая дестабилизация исследуемого признака является эффективным подходом для поиска новых факторов, вовлеченных в его контроль. В данном исследовании проведен анализ влияния сверхпродукции охарактеризованных и потенциальных транскрипционных факторов SUP45 на нонсенс-супрессию. Впервые показано, что сверхэкспрессия генов ABF1, GLN3, FKH2, MCM1, MOT3 и REB1 вызывает нонсенс-супрессию на специфическом генетическом фоне. Эти эффекты частично связаны со снижением эффективности терминации трансляции, возникающим при сверхэкспрессии данных генов.

About the authors

Anton Aleksandrovich Nizhnikov

St. Petersburg Branch of Vavilov Institute of General Genetics (Russian Academy of Science)

Email: ant.nizhnikov@gmail.com
Jounior Researcher, Postgraduete student, Deptartament of Genetics and Biotechnology, Saint-Petersburg State University

Aleksandra Mikhaylovna Kondrashkina

Saint-Petersburg State University

Email: alex_sandra2502@mail.ru
Student, Deptartament of Genetics and Biotechnology

Kirill Sergeyevich Antonets

Saint-Petersburg State University

Email: kir_ant@mail.ru
Student, Deptartament of Genetics and Biotechnology

Aleksey Petrovich Galkin

St. Petersburg Branch of Vavilov Institute of General Genetics (Russian Academy of Science)

Email: apgalkin@mail.ru
PhD. Head of Laboratory for Genetic Modeling of the Human and Mammalian Disorders, Vice-Director

References

Supplementary files