Rol-GENES of Agrobacterium rhizogenes

Abstract

The review summarizes the information about rol-genes, which constitute a part of the T-DNA of Agrobacterium rhizogenes Ri-plasmid. Structure of each of the rol-genes, their regulatory sequences, and the possible roles of rol-genes when they are being transferred into the plant are discussed

Full Text

Введение Бактерии Agrobacterium rhizogenes являются причиной заболевания «бородатый корень» (Riker et al., 1930). В пределах Ri-плазмиды содержится район Т-ДНК, который способен интегрироваться в растительный геном. Экспрессия генов, содержащихся в Т-ДНК, нарушает нормальное функционирование растительного организма (в частности, влияет на гормональный баланс: изменяется содержание разных классов гормонов, их метаболизм и чувствительность к ним) и характеризуется определенными морфологическими изменениями. Т-ДНК Ri-плазмид агропинового типа состоит из двух копий: левой TL-ДНК и правой TR-ДНК (De Paolis et al., 1985), каждая из копий переносится независимо. В левой части Т-ДНК было выявлено 18 открытых рамок считывания (ОРС1 — ОРС18) (Slightom et al., 1986). При помощи инсерционного и делеционного мутагенеза было показано, что для развития заболевания «бородатый корень» критично присутствие четырех rol-генов (от англ. «root locus»): rolA, rolB, rolC и rolD (White et al., 1983). Эти гены соответствуют рамкам считывания ОРС10, ОРС11, ОРС12 и ОРС15. Важно отметить, что в норме у пораженного растения привнесенные последовательности Т-ДНК не наследуются в следующих поколениях. Однако известно несколько примеров, когда перенос Т-ДНК в геном растения являлся эволюционным событием при формировании таксономической единицы. У некоторых представителей рода Nicotiana и Linaria были выявлены последовательности, гомологичные агробактериальным rol-генам (White et al., 1983; Matveeva et al., 2012). Т-ДНК-подобные последовательности смогли закрепиться в геномах разных растительных видов и родов, причем для части видов было показано, что данные последовательности сохранились в практически не измененном виде. Поскольку данные мотивы не были элиминированы, то можно предположить, что они сыграли некую роль для растений, придали конкурентные преимущества. Чтобы понять, какой могла быть эта роль, рассмотрим подробнее функцию каждого из генов, участвующих в индукции и поддержании «бородатых корней». Изучение функции вышеперечисленных генов проводили у трансгенных растений, которые содержали или всю вставку Т-ДНК, или отдельные rol-гены. Ген rolA Ген rolA обнаружен во всех известных Ri-плазмидах, причем его N-конец высоко консервативен у разных штаммов, в то время как С-конец значительно варьирует. Предположительно, это белок с небольшой молекулярной массой (11,4 кДа) и высокой изоэлектрической точкой (11,2). Такие особенности позволяют предположить, что RolA может взаимодействовать с нуклеиновыми кислотами и может быть вовлечен в регуляцию экспрессии генов у растений (Levesque et al., 1988). Конститутивная экспрессия rolA у Nicotiana tabacum приводит к формированию и низкорослых, кустистых растений, с темно-зелеными морщинистыми листьями, у которых часто нарушена морфология цветка, которые характеризуются компактным соцветием. В культуре тканей (на листовых дисках) rolA вызывает корнеобразование (Schmulling et al., 1988; Sinkar et al., 1988; Carneiro, Vilaine, 1993; Serino et al., 1994). Транскрипты rolA выявляются в стеблях (в клетках флоэмы), и в меньшей степени в корнях и листьях (Carneiro, Vilaine, 1993). Работа гена rolA ингибирует рост растяжением клеток паренхимы в проводящих пучках, что приводит к укорочению междоузлий и формированию морщинистых листьев (Guivarch et al., 1996). Экспрессия rolA приводит к уменьшению содержания некоторых гормонов (ауксинов, цитокининов, гиббереллинов, этилена и абсцизовой кислоты) (Dehio et al., 1993). Делеционный анализ промоторной области показал наличие трех функциональных доменов (A, B, C: –638...–477 п. о., –473...–366 п. о. и –366...–200, соответственно) (Guivarch et al., 1996). Последовательное удаление каждого из доменов приводило к уменьшению содержания транскрипта в листьях вплоть до отсутствия. Таким образом, все три домена работают кооперативно при регуляции экспрессии rolA. У трансгенных растений, содержащих в промоторе только домен А, экспрессия rolA была выявлена в листьях и не обнаружена стебле и корнях, тогда как делеция этого домена приводила к накоплению транскрипта в стеблях и корнях и к отсутствию в листьях. Молекулярная природа этого эффекта пока неизвестна. В пределах домена А обнаружен мотив, который состоит из последовательностей, обнаруженных у некоторых ауксин-регулируемых и свето-индуцируемых генов (GT-2 связывающий сайт (Dehesh et al., 1990) и DUE-NDE elements (distal upstream element и Ndel element) (MacClure et al., 1989). Возможно, эти последовательности участвуют в активации/репрессии транскрипции rolA. Также предполагается, что домен А ингибирует функционирование доменов В и С. Совместная работа доменов B и C приводила к развитию морщинистых листьев и укороченных междоузлий, а наличие только домена С определяло карликовый фенотип с нормальными листьями. Было показано, что белок RolA влияет на формирование проводящих пучков, что приводит к укорочению междоузлий. Кроме того, локальная экспрессия rolA в проводящих пучках стебля приводит к уменьшению размеров прилежащих клеток паренхимы. По-видимому, этот эффект достигается благодаря тому, что белок RolA может взаимодействовать с неким диффундирующим фактором, и таким образом оказывать влияние на соседние ткани (Guivarch et al., 1996). Использование слитных конструкций rolA:: GUS позволило определить локализацию белка в плазматической мембране, однако в самом белке не было выявлено каких-либо мотивов для его заякоривания. Вероятно, rolA не интегрирующий белок, ассоциированный с мембраной (Vilaine et al., 1998) При изучении структуры гена rolA из разных штаммов в 5’-некодирующей области был выявлен интрон (длиной 85 п. о.) (Magrelli et al., 1994). Причем у трансгенных растений арабидопсиса, полученных с использованием штамма, у которого был нарушен процесс вырезания интрона (мутации в любом из нуклеотидов AG в точке сплайсинга), не наблюдалось морфологических изменений, к которым обычно приводит экспрессия гена rolA (Spena, Langenkemper, 1997). Последовательность интрона высоко консервативна среди изученных штаммов агробактерий. В пределах этого интрона была выявлена область, характерная для бактериального промотора (63 п. о.). Следовательно, rolA может работать как в бактериальных клетках (у агробактерий, свободно живущих ризобий, и бактероидов в клубеньках), так и в растительных клетках, в этом случае бактериальный промотор вырезается вместе с интроном. По-видимому, сам интрон также выполняет функцию регуляторного элемента, разграничивающего экспрессию rolA у бактерий и у трансгенных растений (Pandolfini et al., 2000). Важно отметить, что rolA — это единственный ген в пределах Т-ДНК A. rhizogenes, который содержит интрон. In vitro было показано, что наличие функциональной последовательности rolA не является обязательным для роста и жизнедеятельности агробактерий. Возможно, этот ген экспрессируется, когда бактериальная культура находится в стационарной фазе или при высокой плотности клеток (Pandolfini et al., 2000). Однако точная функция белка пока неизвестна. Ген rolB Долгое время считалось, что именно rolB играет ключевую роль в корнеобразовании (Nilsson, Olsson, 1997), поскольку трансформация растений всеми остальными онкогенами при инактивированном rolB, не приводила к фенотипу «бородатый корень», а трансформация только геном rolB вызывала обильное формирование быстро растущих, ветвящихся, агравитропных корней (Altamura, 2004). Однако роль гена rolB не ограничивается только формированием корней, так как в литературе описаны примеры с другими морфологическими изменениями, к которым приводит трансформация растения векторами, содержащими ген rolB. Например, экспрессия гена rolB вызывает формирование эктопических цветковых меристем как в культуре тканей (Altamura et al., 1994), так и на уровне целого растения (Koltunow et al., 2001). Экспрессия rolB была выявлена во всех типах меристем, в проводящей системе (во флоэме, ксилеме и перицикле) (Altamura et al., 1991). Кроме того, его экспрессия индуцирует развитие партенокарпических плодов, что было показано на трансгенных томатах, полученных с использованием конструкций с тканеспецифическими промоторами (Carmi et al., 2003), вызывает задержку развития пыльников и тычинок (фенокопию таких изменений можно получить добавлением экзогенного ауксина) (Cecchetti et al., 2004), влияет на дифференциацию ксилемы, изменяя соотношение пролиферирующих клеток прокамбия и дифференцированных клеток во время развития тычинок (Cecchetti et al., 2004). В экспериментах на изолированных тканях, полученных из стеблей и цветоножек растений и трансформированных геном rolB, было показано, что, возможно, rolB влияет на формирование различных типов меристем, а конкретный последующий тип дифференцировки определяется гормональным балансом исходной ткани (Altamura et al., 1994). Кроме того, rolB (также как и rolC) является мощным индуктором изменения вторичного метаболизма у трансгенных растений (Shkryl et al., 2008). В экспериментах с Rubia cordifolia было показано, что в трансгенных каллусах rolB (штамма A4) активирует экспрессию PR-генов (от англ. pathogenesis-related genes), в том числе генов, кодирующих пероксидазы 3-го класса (Veremeichik et al., 2012) и ферменты синтеза фитоалексинов (Bulgakov et al., 2003). Также rolB может приводить к нарушению баланса кальция в клетках трансгенного каллуса (Bulgakov et al., 2003). Молекулярный механизм, приводящий к такому широкому спектру изменений, пока не выяснен. Предполагается, что экспрессия гена rolB индуцируется ауксином. Так, через 6–9 часов после добавления ауксина в культуральную среду, в протопластах табака начинается активный синтез транскриптов rolB, а через 12–18 часов происходит 300-кратное увеличение их числа. Промотор гена rolB представляет собой комплекс из пяти доменов: A, B, C, В и E, которые взаимодействуют с различными растительными регуляторными факторами и моделируют работу гена в зависимости от типа ткани, гормональных сигналов и стадии развития. В корне наличие всех пяти доменов в промоторе приводит к экспрессии гена в корневом чехлике, в протодерме, в меристемах кортекса и проводящей системе, т. е. в тех клетках, из которых могут формироваться различные ткани корня. Делеция домена A подавляет экспрессию в корневом чехлике и протодерме, делеция доменов B и E блокирует работу гена во всех меристематических клетках, а домен D необходим для экспрессии в меристеме кортекса. Домен С требуется для экспрессии во внутренних меристемах и одновременно подавляет экспрессию в протодерме (Capone et al., 1994). Наиболее интересным является домен В (–341...–306), который играет ключевую роль в регуляции транскрипции гена rolB. Если этот домен делетирован, то rolB не экспрессируется в меристемах и не индуцируется ауксином. Последовательность ACTTTA (–312...–307) в пределах домена В высоко консервативна у разных штаммов агробактерий. Она необходима для тканеспецифичной экспрессии rolB и является цис-регуляторным элементом для индукции экспрессии гена ауксином (Baumann et al., 1999). У Nicotiana tabacum транскрипционный фактор NtBBF1 (Nicotiana tabacum rolB domain B Factor 1) содержит единичный цинковый палец и относится к семейству белков, содержащих Dof-домен (DNA binding with one finger). Это семейство специфических транскрипционных факторов, выполняющих функции активаторов и репрессоров во многих биологических процессах только у растений (Yanagisawa, 2004) и имеющих сродство к регуляторным последовательностям в промоторной области rolB. NtBBF1 способен связываться с доменом B и изменять экспрессию rolB, причем их паттерны экспрессии взаимосвязаны. Таким образом, растительные транскрипционные факторы могут участвовать в регуляции экспрессии агробактериальных онкогенов у трансгенных растений. Еще один растительный транскрипционный фактор может влиять на работу гена rolB. RBF1 (Rol Binding Factor) способен специфически взаимодействовать с последовательностью, расположенной на расстоянии –553...–530 от старт-кодона, и регулировать экспрессию в немеристематических клетках корня. Сайт связывания RBF1 частично перекрывается с доменом А промотора, что может указывать на взаимосвязь между связыванием RBF1 и высоким уровнем транскрипционной активности rolB в клетках корня (Filetici et al., 1997). Интересно отметить, что последовательность сайта связывания RBF 1 (TACGTITA) полностью комплементарна октомеру ATGCAAAT. Такие октомеры характерны для промоторов генов животных, и, в частности, необходимы для регуляции транскрипции генов иммуноглобулинов (Singh et al., 1986). На сегодняшний день нет единого представления о клеточной функции и о локализации генного продукта rolB. У разных штаммов выявлены отличающиеся последовательности этого гена, и белок был детектирован в разных клеточных частях. Ген rolB штамма pRiA4 кодирует тирозин-фосфатазу, которая локализуется в плазматической мембране, и, вероятно, участвует в проведении ауксинового сигнала (Filippini et al., 1996) В пределах белковой последовательности rolB штамма pRiA4 обнаружен мотив CX5R, который необходим для проявления фосфатазной активности (Lemcke, Schmulling, 1998a). Данный мотив этого гена отсутствует у остальных изученных штаммов агробактерий. Таким образом, либо только rolB штамма pRiA4 является тирозин-фосфатазой, либо у белков rolB других штаммов присутствует другой функциональный мотив, либо тирозин-фосфатазная активность не единственная и не основная активность этого белка в растительной клетке. У трансгенных табаков белок RolB штамма pRiA1724 локализован в ядерной мембране, и способен взаимодействовать с белком Nt14-3-3ωII. Причем ни у rolB, ни у Nt14-3-3ωII нет сигналов ядерной локализации, вероятно, они оба взаимодействуют с какими-либо челночными белками для транспорта в ядро. Возможно, в том случае продукт гена rolB играет роль транскрипционного коактиватора или посредника (вторичного мессенджера) (Moriuchi et al., 2004). Интересно отметить, что у млекопитающих тирозиновые фосфатазы и белок 14-3-3 участвуют в онкогенезе, клеточном росте, дифференциации и апоптозе (Dougherty, Morrison, 2004). На уровне клетки, по-видимому, rolB изменяет чувствительность к ауксину (Maurel et al., 1994). В трансгенных протопластах табака антитела к ауксин-связывающим белкам блокируют ауксиновый ответ, причем, чем выше уровень экпрессии rolB, тем большая концентрация антител требуется. Возможно, что rolB либо стимулирует наработку ауксин-связывающих белков, либо увеличивает их активность (Venis et al., 1992). Ауксин и транскрипционный фактор NtBBF1 участвуют в регуляции экспрессии rolB. Продукт гена rolB изменяет рецепцию ауксинового сигнала и увеличивает чувствительность клеток к ауксину, что приводит к заложению новых меристем. Дальнейшая судьба меристематических клеток зависит как от локального гормонального баланса, так и от общего физиологического состояния. Ген rolBTR. Штамм pRiA4 несет две копии Т-ДНК (левая TL-DNA и правая TR-DNA) (Huffman et al., 1984), которые содержат разный набор генов и могут независимо переноситься в геном растения в процессе агроинфекции. Bouchez и Camilleri выявили в пределах правой Т-ДНК открытую рамку считывания, гомологичную гену rolB из левой копии Т-ДНК, у которых на 52 % сходны нуклеотидные последовательности и на 40,6 % — аминокислотные. Однако в 5’ и 3’ областях сходства между rolB и rolBTR не обнаружено (Bouchez, Camilleri, 1990). В аминокислотной последовательности выявлен гидрофобный район (с 163 по 172 аминокислотный остаток), который имеет высокий уровень сходства (порядка 70 %) с трансмембранными мотивами других белков. Возможно белковый продукт гена rolBTR при помощи этого участка заякоривается в плазмолемме. Мотива CX5R, характерного для rolB из левой копии Т-ДНК, в пределах rolBTR не обнаружено. На N-конце белка выявлено 14 дополнительных аминокислот, которые у rolB отсутствуют. Возможно, биологическая активность белка rolBTR зависит от этой последовательности, так как, если этот фрагмент делетирован, то у трансгенных растений не наблюдается характерный для rolBTR фенотип. Экспрессия rolBTR в табаке под конститутивным промотором приводит к задержке роста и формированию боковых отростков в основании побега, листья слегка морщинистые, сильно отклоняющиеся от стебля. Растения, экспрессирующие rolBTR, фенотипически отличаются от растений, экспрессирующих ген rolB. Можно предположить, что rolBTR не является функциональным гомологом rolB (Lemke, Schmulling, 1998a). Ген rolC Ген rolC присутствует во всех изученных штаммах A. rhizogenes и является самым консервативным из всех rol-генов (Dandecar et al., 2008). У трансгенных растений морфологические эффекты rolC зависят от того, под каким промотором работает ген. Если rolC регулируется собственным промотором, то растения-трансформанты низкие, междоузлия укорочены, апикальное доминирование снижено, листья ланцетовидные, сморщенные по краям, цветки маленькие, фертильность пыльцы снижена и переход к стадии цветения происходит раньше, чем в контроле. Наблюдается общая ювенилизация растения (Schmulling et al., 1988; Oono et al., 1990). Сам по себе rolC слабо способствует корнеобразованию, а в сочетании с rolA и rolB активно его индуцирует (Schmulling et al., 1988; Palazón et al., 1998). В случае, если rolC работает под конститутивным промотором, растение-трансформант имеет более выраженный фенотип (в частности, пыльца становится стерильной) (Schmulling et al., 1988). Экспрессия rolC орган-специфична, максимальна в корнях и уменьшается в ряду: корни–стебель–цветки–листья. На тканевом уровне rolC экспрессируется во флоэме (во всех органах) (Schmulling et al., 1988; Sugaya et al., 1989; Guivarch et al., 1996), транскрипты rolC были выявлены в железистых клетках табака (Hu et al., 2003). На сегодняшний день нет точных представлений о биохимической активности белкового продукта rolC. Estruch с соавторами показали, что наработанный в гетерологичной системе белок RolC штамма pRiA4, обладает β-глюколитической активностью и способен высвобождать активные цитокинины из конъюгатов с N- и O-глюкозидами. Причем RolC был способен расщеплять N-глюкозиды, устойчивые к другим клеточным глюкозидазам. Также авторами было показано, что у rolC-трансформантов (rolC под конститутивным промотором) повышено содержание свободных цитокининов (Estruch et al., 1991a). Однако попытки других авторов измерить уровень свободных цитокининов дали противоречивые результаты. Например, в экспериментах Nilsson было выявлено, что нарушен баланс сразу нескольких классов гормонов: содержание гиббереллинов (в частности, GA19) повышено, а цитокининов, наоборот, — снижено (Nilsson et al., 1993). Faiss показал (с использованием тетрациклин-индуцибельного промотора), что не все глюкозиды являются потенциальными субстратами для белка RolC: только O- и N3-могут расщепляться, а N7-и N9- — нет. Кроме того, в трансгенных тканях табака был обнаружен только один тип глюкозидов — O-глюкозиды. Концентрации свободных цитокининов и конъюгатов в экспериментальных растениях не отличались от контрольных, а культура трансгенных тканей была способна расщеплять экзогенные O- и N3-конъюгаты (Faiss et al., 1996). Белок RolC локализован цитоплазме (Estruch et al., 1991b), а глюкозид-связанные цитокинины — в вакуолях. Вероятно, RolC успевал расщепить экзогенные глюкозиды до того, как они оказывались секвестрированы в вакуолях. Авторы склонны считать, что фенотип rolC-трансгенных растений в целом зависит вовсе не от способности белка RolC высвобождать цитокинины из конъгатов. По-видимому, RolC не прямо влияет на гормональный баланс, а косвенно воздействует на программы развития благодаря потенциальной способности расщеплять олигосахара (Faiss et al., 1996). Позже в лаборатории Оттена было показано, что rolC-трансформанты способны активно накапливать крахмал. Растения, трансформированные rolC под дексаметазон-индуцибельным промотором, помимо ювенильного фенотипа, демонстрировали энации (вдоль центральной жилки листа) и локальные хлорозы. Локальная индукция экспрессии rolC стимулирует накопление крахмала в зрелых тканях листа (при окрашивании йодом показано, что крахмал накапливается в местах хлорозов). Если rolC может воздействовать на зрелые ткани листа, то вероятно, может оказывать влияние на какие-либо «листо-специфические» процессы (например, на такие, как фотосинтез) и, как следствие, опосредованно влиять на процессы развития и в корнях. При агротрансформации активное всасывание сахарозы может стимулировать закладку и рост корней (Mohajjel-Shoja et al., 2011). В промоторной области rolC находится цис-регуляторный элемент, активируемый сахарозой (расположен в районе –135...– 94 от точки инициации транскрипции). Во флоэме высокое содержание сахарозы обеспечивается благодаря току продуктов фотосинтеза. Таким образом, сахароза может выступать в качестве сигнальной молекулы, индуцирующей работу rolC в проводящей системе (Yokoyama et al., 1994). Одновременно сахароза может являться субстратом для белка RolC, а продукты метаболизма сахарозы могут идти на «строительство» новых органов. Вероятно, такая положительная обратная связь обеспечивает эффективную пролиферацию клеток и заложение корней (Nilsson, Olsson, 1997). Кроме того, в промоторе rolC обнаружены myb-response elememts (AACG/TG) (Hu et al., 2003) и С-related elements (CCGAC) (Jaglo et al., 2001). Myb белки — это транскрипционные факторы, участвующие в адаптации организма к условиям стресса (Ganesan et al., 2012). С-related elements также участвуют в ответе растений на стресс (в частности, на холод и засуху) (Jaglo et al., 2001). Не исключено, что эти последовательности также вносят вклад в развитие характерного rolC-фенотипа. Карликовый фенотип rolC-трансформантов Schmulling с соавторами попытались объяснить нарушением баланса других классов гормонов (не цитокининов). Например, у табака и картофеля снижено содержание гиббереллина GA1, а добавление в среду GA3 восстанавливает нормальную длину междоузлий, но никак не влияет на стерильность пыльцы. Гибберелловая кислота влияет на рост клеток растяжением, но не участвует в микроспорогенезе (Schmulling et al., 1993). Накопление GA19 свидетельствует в пользу того, что продукт гена rolC блокирует превращение GA19 в GA20. У трансгенных растений также снижено содержание абсцизовой кислоты примерно на 50 % по сравнению с контролем. Это согласуется с общей ювенилизацией растения при трансформации rolC (Nilsson et al., 1993). Помимо того, что rolC изменяет содержание разных классов гормонов, он также влияет на чувствительность к ним. Например, трансформанты обладают повышенной устойчивостью к ауксину и абсцизовой кислоте, и напротив, чувствительны к цитокининам и предшественникам этилена (Schmulling et al., 1993). Ген rolD Ген rolD в отличие от других rol-генов, выявлен не у всех штаммов A. rhizogenes. При трансформации табаков было показано, что основным эффектом rolD является усиленная закладка пазушных генеративных почек, более раннее и обильное цветение по сравнению с контролем. Из-за раннего перехода к генеративной фазе развития у растений наблюдается уменьшенное количество закладываемых вегетативных почек и узлов, что приводит к ранней терминации побега и высота трансгенных растений меньше, чем контрольных. У цветков наблюдается явление гетеростилии, однако семена, полученные от самоопыления, жизнеспособны (Mauro et al., 1996). В культуре тканей (на тонких клеточных слоях) rolD также вызывал обильное формирование цветковых меристем, даже в тех условиях, когда в норме должны формироваться корни, т. е. можно предположить, что rolD подавляет развитие корней. На уровне целого растения табака никакого значительного влияния на корневую систему обнаружено не было (Mauro et al., 1996). Сходные данные были получены на томате (Bettini et al., 2003) и на арабидопсисе (Falasca et al., 2010). Таким образом, основной эффект rolD — это постэмбриональное формирование меристем, в частности пазушных почек. Эти меристемы появляются раньше, являются более многочисленными, по сравнению с контролем, и образуют соцветия, что приводит к формированию сильно ветвящихся побегов. Причем закладывается почек значительно больше, чем развивается побегов. То, что не все почки дают побеги, возможно, связано с тем, что формирующиеся побеги конкурируют за пространство и питательные вещества (Falasca et al., 2010). При попытке выяснить влияет ли rolD на основные гены, регулирующие процессы ветвления у растений, было показано, что rolD негативно регулирует экспрессию гена CYP79F1/SUPERSHOOT/BUSHY (SPS). SPS вовлечен в биосинтез глюкозинолатов (Tantikanjana et al., 2004). Глюкозинолаты — это вторичные метаболиты, выполняющие защитные функции у растений, а некоторые их метаболиты обладают цитостатическими свойствами (Yan, Chen, 2007). В норме SPS подавляет заложение боковых побегов. Нарушения синтеза глюкозинолатов приводят к нарушению гормонального баланса растения, в частности, sps мутанты характеризуются повышенным уровнем цитокинина, что приводит к обильному кущению (Tantikanjana et al., 2004). При трансформации растений геном rolD, снижается уровень экспрессии гена SPS, поэтому rolD-трансформанты обладают сходным фенотипом с sps-мутантами. У трансгенных растений экспрессия rolD не является тканеспецифичной, но связана со стадиями развития. rolD работает во всех растущих и дифференцирующихся тканях, кроме апикальных меристем, на всех стадиях развития от эмбриона до взрослого растения. В органах с детерминированным ростом, таких как семядоли, листья и части цветка, уровень экспрессии зависит от возраста ткани: максимум приходится на взрослые ткани и падает с их старением (Trovato et al., 1997). Вероятнее всего, что rolD играет роль на более поздних стадиях развития меристем, возможно, участвует в их детерминации (Altamura, 2004). Анализ нуклеотидной последовательности показал, что rolD имеет гомологию с последовательностью орнитин циклодеаминазы. Экспериментальные данные подтвердили, что данный белок обладает биохимической активностью, которая обеспечивает НАД+-зависимое превращение L-орнитина в L-пролин (Trovato et al., 2001). Орнитин циклодеаминаза принадлежит к семейству µ-кристаллинов. Сам белок состоит из нескольких гомодимерных субъединиц, каждая из которых имеет два функциональных домена (субстрат-связывающий и динуклеотид-связывающий — для связывания кофактора) (Goodman et al., 2004). Орнитин циклодеаминаза была обнаружена у A. tumefaciens, где она участвует в катаболизме опинов, синтезированных из аргинина в клетках опухоли. Причем орнитин циклодеаминаза закодирована за пределами Т-ДНК, т. е. в той части Ti-плазмиды, которая не переносится в геном растения при агротрансформации (Sans et al., 1988; Schindler et al., 1989). Интересно отметить, что у близкородственного вида A. rhizogenes последовательность орнитин циклодеаминазы входит в состав Т-ДНК и самой бактерией не используется для катаболизма опинов, но у нее появились характерные эукариотические цис-регуляторные мотивы, благодаря которым ген орнитин циклодеаминазы может экспрессироваться только в растительных клетках. Также как и у rolB, у rolD ауксин-регулируемый промотор: в его пределах обнаружен Dof-домен (Altamura, 2004). У растений нет аналогов орнитин циклодеаминазы, а пролин синтезируется преимущественно из глутамата (Mattioli et al., 2009). Гормональный баланс оказывает влияние на процессы роста и развития растений, в частности, соотношение ауксинов и цитокининов влияет на ветвление побегов (Shimizu-Sato et al., 2009). Milazzo с соавторами показали взаимосвязь между балансом ауксинов и цитокининов и содержанием пролина (Milazzo et al., 1999). Таким образом, у rolD-трансформантов активное развитие боковых меристем, ветвление и раннее цветение может быть связано с повышенным содержанием пролина и смещением гормонального баланса в сторону цитокинина. В органах цветка содержание пролина обычно повышено по сравнению с вегетативными органами. Отличия могут достигать 60-кратной величины (Schwacke et al., 1999). Пролин необходим для синтеза гидроксипролин-богатых гликопротеинов. Эти гликопротеины входят в состав клеточной стенки и участвуют в регуляции деления клеток и роста растяжением (Trovato et al., 2001). В условиях стресса растительные клетки накапливают различные осмо- и криопротекторы, в том числе пролин. Повышенное содержание пролина у rolD-трансформантов может играть адаптивную роль в неблагоприятных условиях. Например, Bettini с соавторами было показано, что томаты, несущие rolD, имеют повышенный уровень экспрессии PR-генов и более устойчивы к патогену Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici по сравнению с контрольными растениями (Bettini et al., 2003). Как было упомянуто ранее, в пределах левой части Т-ДНК содержится 18 рамок считывания. За развитие фенотипа «бородатый корень» отвечают четыре основных гена: rolA, rolB, rolC и rolD. Остальные гены сами по себе не способны вызывать данного заболевания, но предполагается их участие в патогенезе и поддержании опухолевого фенотипа. Биохимические функции достоверно не известны, однако ведутся работы по их изучению. Предполагается, что ORF3n вовлечен во вторичный метаболизм и/или транспорт гормонов, участвует в подавлении дедифференциации клеток «бородатого корня» (Lemke, Schmulling, 1998b). OFR8, по-видимому, участвует в транспорте сахаров, а его экспрессия индуцируется ауксином (Ouartsi et al., 2004). Экспериментальные данные позволяют предположить, что ORF13 участвует в биосинтезе ауксина, однако на уровне нуклеотидной последовательности не обнаружено сходства ни с одним из генов, участвующим в цепи синтеза ауксина. Ген ORF13 экспрессируется в ответ на поранение. ORF13 стимулирует каллусогенез, но препятствует дифференцировке клеток (Hansen et al., 1997). ORF13a располагается между ORF13 и ORF14, его транскрипты были выявлены в проводящей системе листа. Предполагается, что его генный продукт обладает активностью транскрипционного фактора и может напрямую взаимодействовать с ДНК, т. к. в его структуре обнаружен мотив SPXX (характерный для связывания с ДНК) (Hansen et al., 1994). ORF14 сам по себе не вызывает никаких морфологических эффектов, будучи перенесенным в геном растения с остальными генами Т-ДНК, не препятствует корнеобразованию (Aoki, Syono, 1999). Заключение Трансформация растений штаммами A. rhizogenes вызывает неопластический рост и дифференцировку тканей, что приводит к обильному корнеобразованию, снижению апикального доминирования, задержке роста, нарушению морфологии листьев и цветков и т. д. Суммарно, эти изменения называются синдромом «бородатого корня». За развитие этого заболевания отвечают rol-гены, входящие в Т-ДНК. Каждый из них вносит свой вклад в нарушение нормального хода программ развития растения. Наиболее полно описаны только морфологические изменения, вызываемые rol-генами по отдельности в сочетании друг с другом. Однако еще нет полного представления о структуре каждого из генов, биохимических функциях, о регуляции их активности. Кодирующие последовательности rol-генов бактериальные, а промоторы и цис-регуляторные элементы имеют эукариотическое происхождение, что позволяет транскрипционной машине растения регулировать работу rol-генов. По-видимому, в ходе эволюции растения «приспосабливались» к взаимодействию с агробактериями. А тот факт, что в геномах некоторых видов закрепились Т-ДНК-подобные мотивы, говорит о том, что Т-ДНК могла быть полезной (или, как минимум, нейтральной) для растения. Существует несколько гипотез. Например, согласно «фитогормональной» гипотезе в определенный момент времени в ходе эволюции скачкообразное изменение гормонального баланса растений (связанное с захватом Т-ДНК и ее передачей в половых поколениях) привело к повышению адаптационного потенциала трансформированных растений. Такой сценарий мог разворачиваться, например, при резком изменении водного баланса или при обеднении почв, а также при переходе в другие экологические ниши. Также существуют гипотезы, напрямую не связанные с rol-генами, объясняющие закрепление Т-ДНК в геноме растений. Детальные исследования структуры, функции и биохимической активности rol-генов помогут прояснить тонкое регулирование процессов взаимодействия агробактерий и растений и функционировании Т-ДНК в растительном геноме.