MOLECULAR ANALYSIS OF CELL DIVISDION GENES AND ADJACENT GENES IN THE CYANOBACTERIUM PLEUROCAPSA SP. CALU 1126

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Прокариоты размножаются посредством клеточного деления (цитокинеза), в котором можно выделить ряд стадий: 1) репликация хромосом (ы); 2) сегрегация сестринских хромосом; 3) выбор сайта деления; 4) сборка органеллы клеточного деления (дивисомы), в основе которой лежит кольцо деления (Z-кольцо); 5) собственно деление перетяжкой или септированием (Lutkenhaus, 1998; Errington et al., 2003). Белок FtsZ, главный материал кольца деления, имеется у большинства изученных бактерий и архей; его гомологи обнаружены у пластид и митохондрий (Osteryoung, Nunnari, 2003; Maple, Møller, 2007). Вспомогательные белки FtsA и ZipA взаимодействуют с белком FtsZ и фиксируют Z-кольцо на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Прочие белки дивисомы (FtsK, FtsL, FtsN, FtsQ и FtsW) участвуют в процессе сегрегации дочерних клеток с помощью кольцевой инвагинации цитоплазматической мембраны, а также центрипетального роста ригидного слоя клеточной стенки и, в случае грамотрицательных бактерий, наружной мембраны (Nanninga, 2001). Бактерии и археи унаследовали Z-кольцо от «универсального общего предка» (Wang, Lutkenhaus, 1996), тогда как у эукариотов Z-белок был заменен гомологичным цитоскелетным белком — тубулином (Faguy, Doolittle, 1998). В основе цитокинеза всех прокариотов лежат общие механизмы, с отличиями на уровне разных таксонов и внутри последних (Wang, Lutkenhaus, 1996). Особый интерес представляет цитокинез цианобактерий, прообраз пластокинеза (деления пластид). Однако его молекулярные детали слабо изучены, в основном у Synechococcus sp. PCC 7904 и Synechocystis sp. PCC 6803, делящихся бинарно (Koksharova, Wolk, 2002; Mazouni et al., 2004; Miyagishima et al., 2005). Что касается плеврокапсовых цианобактерий, обладающих уникальной способностью к множественному делению (Waterbury, Stanier, 1978), то механизм их цитокинеза остается неизвестным. Основной подход к решению данной проблемы состоит в изучении генов белков деления и продуктов их экспрессии. В частности, настоящая работа посвящена молекулярному анализу гена ftsZ и фланкирующих генов у цианобактерии Pleurocapsa sp. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Объект исследования и условия его культивирования В работе использована чистая культура Pleurocapsa sp. штамм CALU 1126 (коллекция культур микроорганизмов СПбГУ; см.: Pinevich et al., 2004). Культуру выращивали в жидкой или уплотненной (0,8 %-й агар Difco) минеральной среде BG-11M (Pinevich et al., 1997) при комнатной температуре, с непрерывным освещением интенсивностью 40 μЕ м–2 с–1, обеспечиваемой люминесцентными лампами белого света. Объекты, использованные при клонировании Реципиентом при клонировании фрагментов ДНК послужил штамм DH5α E. coli (F–, recA1, endA1, gyrA96, hsdR17, deoR, ∆ (lacZYA-argF)U169) (Grant et al., 1990). Культуру E. coli выращивали на среде LB (Маниатис и др., 1984), для отбора трансформантов при клонировании фрагментов ДНК использовали среду LB с добавлением ампициллина (100 мг × л–1), X-Gal (20 мг × л–1) и IPTG (10 мг × л–1). Для клонирования рестрикционных фрагментов использовали плазмиду pUC18 (Norrander et al., 1983), а в качестве T-вектора для клонирования ПЦР-фрагментов — плазмиду pTZ57R/T (MBI Fermentas, Литва). Манипуляции с ДНК Геномную ДНК выделяли с использованием коммерческого набора Nucleon PhytoPure Plant DNA Extraction Kit (Amersham, Великобритания) согласно протоколу фирмы-изготовителя. Для ПЦР-амплификации фрагмента гена ftsZ Pleurocapsa sp. CALU 1126 использовали праймеры, ранее сконструированные для Chroococcidiopsis sp. (Billi et al., 1998): (BF) 5'-AATGCYGTTAACCGSATGATT-3' и (BR) 5'-GCCYKYACRTCWGCAAARTC-3', а также Taq-полимеразы (Хеликон, Москва) в автоматическом амплификаторе iCycler (Bio-Rad, США) в следующем режиме: начальная денатурация при 95 °C, 3 мин (30 циклов); 94 °C, 30 с; 42 °C, 30 с; 72 °C, 1 мин; завершающий синтез, 72 °C, 15 мин. «Обратную» ПЦР проводили, используя праймеры (ftsZ483_out): 5'-TAGCCGATGATGTCTTGC-3 и (ftsZ71_out): 5'-GAGCATCGGTATTTATTGC-3' и набор «Long PCR Enzyme Mix» (MBI Fermentas, Литва), который позволяет амплифицировать протяженные фрагменты ДНК (до 20 т. п.н.). Реакцию проводили в режиме: начальная денатурация, 95 °C, 3 мин (30 циклов); 94 °C, 30 с; 50 °C, 30 с; 72 °C, 4 мин; завершающий синтез, 72 °C, 15 мин. Матрицей служила геномная ДНК Pleurocapsa sp. CALU 1126, фрагментированная рестриктазой AvaII и лигированная в ковалентно замкнутое кольцо. Реакции рестрикции и лигирования, а также электрофорез в агарозе и извлечение фрагментов ДНК из геля проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Плазмиды в клетки E. coli вводили посредством высокоэффективной трансформации (Hiroaki et al., 1990). Молекулярное секвенирование ДНК Нуклеотидные последовательности ДНК реконструировали с использованием набора реагентов фирмы Beckman Coulter (США) на автоматическом капиллярном секвенаторе CEQ8000 в соответствии с методикой фирмы-изготовителя. В случае секвенирования фрагмента, прилегающего к векторной плазмиде, были использованы стандартные М13-праймеры: M13for (–20) и M13rev (–26). Для секвенирования центральных, не прилегающих к векторной плазмиде участков фрагмента, на основе уже известных краевых участков были сконструированы и использованы следующие праймеры: pEE2_for1: 5′-GCGACAAGAGAGGATTGATTA-3′ (для плазмиды pEE2); pEE2_rev1: 5′-CTGGCTGCACATCTTTCAA-3′ (для плазмиды pEE2); pEE2_for2: 5′-CAACCATTGCCACCAACTG-3′ (для плазмиды pEE2); pEE2_rev2: 5′-CAGACAATCACCGCAAGC-3′ (для плазмиды pEE2); p3HH2_for1: 5′-GATGCTCCAATTTCAGTCCA-3′ (для плазмиды p3 НН2); p3HH2_rev1: 5′-GAGCTTTATGGTGGCGAT-3′ (для плазмиды p3 НН2); p3HH2_rev2: 5′-CTCAATTAGCTGCGAGCTG-3′ (для плазмиды p3 НН2); p4HH1_rev1: 5′-GGCGTATTATACCTCCTCAAA-3′ (для плазмиды p4 НН1); p4HH1_rev2: 5′-GCAGCGAAATTAACTACATAGA-3′ (для плазмиды p4 НН1). Анализ полученных данных Компьютерную обработку нуклеотидных последовательностей и дальнейшую их трансляцию в аминокислотные последовательности проводили с помощью программ Vector NTI, ClustalX и Mega 3.1. Матрицы генетических расстояний составляли, а дендрограммы строили с помощью программы Mega 3.1. с использованием модели PAM Matrix (Dayhoff) и метода для кластеризации Neighbor-Joining. Реконструированные последовательности сопоставляли с базой GenBank при помощи программы BLAST (Altschul et al., 1990). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В соответствии с поставленной задачей был осуществлен детальный молекулярно-биологический анализ гена ftsZ Pleurocapsa sp., кодирующего белок, который играет ключевую роль в образовании кольца деления. С этой целью на первом этапе работы были осуществлены ПЦР-амплификации фрагмента гена ftsZ с его последующим клонированием и секвенированием. В связи с тем, что нуклеотидные последовательности генов клеточного деления Pleurocapsa sp. были ранее неизвестны, для ПЦР-амплификации фрагмента гена ftsZ использовались праймеры (BF, BR), ранее предложенные для Chroococcidiopsis sp. (Billi et al., 1998). В результате был амплифицирован фрагмент размером ~500 п. н., который был извлечен из геля, клонирован в векторе pTZ57R/T и секвенирован. На основе реконструированной нуклеотидной последовательности были разработаны ориентированные «наружу» от секвенированного фрагмента праймеры ftsZ71_out и ftsZ483_out, предназначенные для проведения «обратной» ПЦР. Это позволило амплифицировать фрагмент генома Pleurocapsa sp. CALU 1126 размером ~7,5 т. п. н. Он был клонирован в векторе pTZ57R/T (сконструированная плазмида получила название pFTSZ). После этого плазмида pFTSZ была секвенирована с использованием стандартных праймеров, что позволило «прочесть» последовательности, содержащие 3′- и 5′-концевые участки гена ftsZ, которые затем были объединены с ранее секвенированной областью гена. В результате была реконструирована полная нуклеотидная последовательность открытой рамки считывания гена ftsZ размером 1266 п. н. В результате компьютерной трансляции нуклеотидной последовательности была реконструирована первичная структура белка FtsZ (422 а. о.). Сравнение с базой данных GenBank показало его значительное сходство с белком FtsZ других цианобактерий (табл. 1). Сходство составило ~70 % по идентичным и ~80 % по аналогичным аминокислотам. После выравнивания аминокислотной последовательности белка FtsZ Pleurocapsa sp. с таковыми других цианобактерий (рис. 1) были выявлены четыре типичных домена: вариабельный N-концевой домен (1); консервативный кор, служащий для связывания ГТФ (2); вариабельный спейсер (3); консервативный C-концевой домен, необходимый для взаимодействия с другими белками клеточного деления (4). Следующей задачей стала реконструкция нуклеотидных последовательностей, фланкирующих ген ftsZ, и идентификация входящих в них генов. Для этого из состава плазмиды pFTSZ были повторно клонированы в векторе pUC18 семь EcoRI- и HindIII-фрагментов. В результате было получено семь плазмид: pEE1 (размер клонированного фрагмента 0,3 т. п. н.); рЕЕ2 (2 т. п. н.); р3 НН1 (0,8 т. п.н.); р3 НН2 (1,6 т. п. н.); р3 НЕ3 (0,5 т. п. н.); р4 НН1 (1,2 т. п. н.); р4 НЕ2 (0,1 т. п. н.). Все они были секвенированы с использованием стандартных праймеров. Для плазмид рЕЕ2, р3 НН2 и р4 НН1 на основе реконструированных нуклеотидных последовательностей были разработаны внутренние (дополнительные) праймеры, и затем было продолжено секвенирование (рис. 2). После объединения центральной и фланкирующих нуклеотидных последовательностей была получена общая последовательность, размером ~7,5 т. п. н. В результате ее компьютерного анализа были выявлены четыре полные открытые рамки считывания для генов ctpA, гена транспозазы из молекулярного семейства IS200/IS605, гена ftsQ и гена thiD а также часть рамки считывания для гена gcvT (рис. 2). Ген ctpA у оксигенных фототрофов кодирует «С-концевую» протеазу из молекулярного семейства эндопротеаз (Inagaki et al., 2001). Она катализирует «С-концевой» процессинг белка D1, принимающего участие в сборке марганцевого кластера — активного центра окисляющего воду комплекса второй фотосистемы. Мутанты с инактивированным геном ctpA теряют способность использовать воду в качестве донора электронов (Anbudurai et al., 1994). Сходство гена ctpA Pleurocapsa sp. с генами, кодирующими «С-концевую» протеазу у других цианобактерий составляет ~80 %. Мобильный элемент IS 605 является инсерционным элементом из широко представленного у бактерий молекулярного семейства IS200/IS605 (Mahillon, Chandler, 1998). Оно особо интересно тем, что у его представителей отсутствуют концевые инвертированные последовательности, характерные для большинства транспозонов у прокариотов и эукариотов. Как и другие IS-элементы, IS 605 содержит транспозазу TnpA (фермент, связывающий одноцепочную ДНК и встраивающий ее в геномную ДНК). Гены транспозазы в составе инсерционных элементов IS200/IS605 имеют самый маленький размер и наименее изучены (Barabas et al., 2007). Участки, фланкирующие ген транспозазы IS605, содержат последовательности, которые формируют небольшие шпилечные структуры, играющие важную роль в перемещении транспозона (они служат сайтами распознавания транспозазы и связывают ее с одноцепочной ДНК). Шпилечные структуры транспозона IS605 могут выборочно сохраняться в ходе эволюции, даже после исчезновения самого гена транспозазы (Barabas et al., 2007; Delihas, 2009). Семейство инсерционных элементов IS200/IS605 имеет интересную особенность: его представители всегда встраиваются непосредственно за 3′-концевой четырех-пяти нуклеотидной последовательностью — в отличие от большинства транспозонов, которые встраиваются случайным образом (Barabas et al., 2007). Сходство гена транспозазы у Pleurocapsa sp. CALU 1126 с транспозазами в составе мобильных элементов IS 605 у других цианобактерий составляет 72–78 %. Ген ftsQ кодирует белок, который состоит из трансмембранного и периплазматического домена и играет важную роль в формировании дивисомы. Предполагается, что он вместе с другими вспомогательными белками деления, локализация которых зависит от предшествующей локализации белка FtsZ, координирует биосинтез материала клеточной стенки и инвагинацию цитоплазматической мембраны (Robson, King, 2006).. В клетке содержится не более 20 копий этого белка (Robson, King, 2006, Villanelo et al., 2011). Из числа анализируемых генов ген ftsQ Pleurocapsa sp. характеризуется наиболее низким сходством с соответствующими генами у других цианобактерий (54–57 %). Ген thiD кодирует фосфометилпиримидинкиназу из молекулярного семейства фосфотрансфераз. Она катализирует реакцию синтеза тиаминпирофосфата (Mizote et al., 1999). Сходство гена thiD Pleurocapsa sp. с соответствующими генами у других цианобактерий составляет 75–81 %. Ген gcvT кодирует аминометилтрансферазу — один из четырех компонентов системы расщепления глицина. Белок GcvT участвует в передаче метильной группы с глицина на тетрагидрофолат (Teplyakov et al., 2004). Для гена gcvT сходство с соответствующими генами у других цианобактерий составляет 52–61 %. Накопленная информация о генах, содержащихся в анализируемом участке генома Pleurocapsa sp., позволила сравнить его с соответствующими участками у других цианобактерий и сопоставить полученные схемы расположения (локальные генетические карты). Описываемый участок может иметь разное строение у разных родов и даже разных штаммов одного и того же рода — примером служат Cyanothece sp. PCC 8802 и Cyanothece sp. PCC 8801. Тем не менее в анализируемом случае локальная генетическая карта Pleurocaposa sp. сходна с таковыми Cyanothece sp. PCC 7882 и Microcystis aeruginosa NIES-843. Исследованные у цианобактерий гены ftsQ и ftsZ сцеплены и транскрибируются в одинаковом направлении. Ген ctpA расположен в upstream-положении от гена ftsQ; между ними находится ген транспозазы, входящий в состав мобильного элемента из молекулярного семейства IS200/IS605, представители которого часто встречаются в разных участках генома у цианобактерий. В частности, у Microcystis aeruginosa PCC 7806 и Trichodesmium erythraeum IMS 101 он находится в upstream-положении от гена ftsQ, тогда как у Microcystis aeruginosa NIES-843 он в downstream-положении от гена thiD. При построении дендрограмм использовалось древо цианобактерий, реконструированное по данным сопоставления нуклеотидных последовательностей РНК большой и малой субъединицы рибосомы, а также выведенных путем компьютерной трансляции аминокислотных последовательностей 137 консервативных белков (Blank, Sanchez-Baracaldo, 2010). Основа этого древа — обособленный вид Gloeobacter violaceus и четыре клады: SPM (Synechococcus sp. PCC 7002, Synechocystis sp. PCC 6803, Microcystis aeruginosa NIES-843, Crocosphaera watsonii WH 8501 и Cyanothece sp. CCY 0110); PNT (Lyngbya sp. PCC 8106, Trichodesmium erythraeum IMS 101, Nodularia spumigena CCY 9414, Nostoc punctiforme PCC 73102, Nostoc sp. PCC 7120 и Anabaena variabilis ATCC 29413); SynPro (морские пикоцианобактерии Synechococcus sp. и Prochlorococcus marinus, а также морской штамм Synechococcus sp. WH 5701 и пресноводный штамм Cyanobium sp. PCC 7001) и LPP (Leptolyngbya, Plectonema, Phormidium и Synechococcus sp. PCC 7335). Отметим, что к обособленной кладе SynPro относятся пикоцианобактерии диаметром < 0,2 мкм, которые численно доминируют в эуфотической зоне Мирового океана (Goericke, Welschmeyer, 1993). Термофильные штаммы Synechococcus sp. (JA-2–3Ba (2–13) и JA-3–3Ab) также образуют достоверно обособленную группу. В то же время различие в филогении Acaryochloris marina, Thermosynechococcus elongatus, Synechococcus elongatus и Synechococcus sp. PCC 7335, прослеживаемой по разным генам, может быть следствием ложного объединения «длинных» ветвей (Blank, Sanchez-Baracaldo, 2010). Анализ дендрограмм, построенных на основе сравнения аминокислотных последовательностей белков FtsZ, FtsQ, ThiD и CtpA, показал, что филогенетическое распределение их генов у Pleurocapsa sp. CALU 1126 существенно различается (рис. 3 и 4). Так, в соответствии с особенностями первичной структуры белков FtsZ и ThiD Pleurocapsa sp. CALU 1126 попадает в кладу SPM, что соответствует литературным данным (рис. 3 А, Б) (Blank, Sanchez-Baracaldo, 2010). Однако если для белка ThiD наблюдается кластеризация с Crocosphaera watsonii WH 8501, то для белка FtsZ штамм Pleurocapsa sp. CALU 1126 обособлен от других представителей клады. Для белка CtpA можно говорить о кластеризации с представителями клады PNT (нитчатые цианобактерии родов Pseudanabaena, Nostoc и Trichodesmium), тогда как в случае белка FtsQ Pleurocapsa sp. CALU 1126 проявляет родство с представителями клады SynPro (рис. 4 А, Б). Такое разнообразие филогенетической «топологии» Pleurocapsa sp. CALU 1126 можно объяснить либо горизонтальным переносом генов, либо ложным объединением «длинных» ветвей (см. выше). Вопрос требует дальнейшего анализа; возможно, что после получения данных по генам других плеврокапсовых цианобактерий последние составят обособленную кладу. Следует отметить, что различия филогении, прослеживаемой по рассматриваемым генам, проявляет не только Pleurocapsa sp. CALU 1126. Так, для Synechococcus sp. PCC 7002, который попадает в кладу SPM (Blank, Sanchez-Baracaldo, 2010), не показана кластеризация с другими цианобактериями ни по одному из данных генов (рис. 3 и 4). Клада PNT сохраняет целостность только при кластеризации по белку FtsQ (рис. 4 А). В остальных случаях она распадается на две группы: представители Cубсекции «Nostocales» (Anabaena variabilis ATCC 29413, Nostoc sp. PCC 7120, Nodularia spumigena CCY 9414 и Nostoc punctiforme PCC 73102) и представители Субсекции «Oscillatoriales» (Lyngbya sp. PCC 8106 и Trichodesmium erythraeum IMS 101). Вторая группа образует обособленный кластер в случае белков FtsZ и CtpA (рис. 3 А и 4 Б). В то же время по белку ThiD данные цианобактерии не кластеризуются (рис. 3 Б). Таким образом, на примере Pleurocapsa sp. CALU 1126 впервые для группы плеврокапсовых цианобактерий определены нуклеотидные последовательности гена ftsZ и фланкирующих его генов. Показано также, что структура локуса ftsZ Pleurocaposa sp. CALU 1126 различается у разных цианобактерий, равно как и филогения, прослеживаемая по его отдельным генам. Такой неординарный факт требует более глубокого анализа на основе дальнейшего накопления экспериментальных данных.

About the authors

Mariya Yuryevna Skopina

Saint-Petersburg State University

Email: masha_sk@list.ru
Postgraduate student, Junior Researcher, Deptartament of Microbiology

Elena Petrovna Chizhevskaya

All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology

Email: chizhevskaya@yandex.ru
Ph. D. Senior Researcher, Deptartament of Genetics and Breeding of Microorganisms

Evgeny Evgenyevich Andronov

All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology

Email: eeandr@gmail.com
Ph. D., Head of the Laboratory of Microbiological Monitoring and Mioremediation of Soils

Aleksandr Vasilyevich Pinevich

Saint-Petersburg State University

Email: Pinevich.A@mail.ru
Doctor of Biological Sciences, Professor, Head of the Deptartament of Microbiology

References

Supplementary files