Dynamics of chromosomal aberrations level in residents of an industrial city in conditions of changing atmosphere pollution

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Одной из важнейших задач современной экологии является изучение реакций генома организмов на воздействие мутагенных факторов окружающей среды. Для анализа уровня повреждений ДНК чаще всего изучают: хромосомные аберрации (ХА), сестринские хроматидные обмены, микроядра, анеуплоидии и стабильные аберрации хромосом с использованием FISH-метода, а на уровне организма - врожденные морфогенетические варианты, врожденные пороки развития (Cычева, 2013). Наиболее детально разработанным является тест на ХА в лимфоцитах крови человека. ХА - это нарушения структуры хромосом, которые возникают спонтанно или в результате экзогенных (химических, физических, биологических) воздействий (Russell, 2002). Структурные ХА в лимфоцитах периферической крови изучаются уже более 40 лет как биомаркеры ранних эффектов действия генотоксических канцерогенов (Бочков и др., 2001; Hagmar et al., 2004). В многочисленных работах выполнены исследования частоты ХА у жителей территорий с различной степенью антропогенной нагрузки (Дружинин, 2003; Пилинская и др., 2011; Минина, 2013). Показана возможность использования теста на ХА в лимфоцитах крови при популяционной оценке риска онкологических заболеваний у населения урбанизированных территорий (Bonassi et al., 2000; Минина, 2011). Установлено повышение уровня ХА у жителей городов с развитой промышленностью (Валинуров и др., 1998; Волков и др., 2001; Ингель, Прихожан, 2002; Дружинин, 2003). В Кузбассе была создана и постоянно обновляется база данных ХА у населения Кемеровской области, в том числе и г. Кемерово. Количественные характеристики данной базы впервые были опубликованы более 10 лет назад (Дружинин, 2003). За последние годы данная база была значительно расширена, что потребовало пересмотра и верификации полученных ранее оценок. Город Кемерово - крупный промышленный, административный и культурный центр Кузбасса расположен на юго-востоке Западной Сибири в центре Кузнецкой котловины по обоим берегам реки Томь. Высокая концентрация предприятий углеперерабатывающей, химической промышленности и теплоэнергетики, интенсивные транспортные потоки, а также неблагоприятные метеорологические условия с частыми штилями и температурными инверсиями создают сложную экологическую ситуацию в городе. В результате цитогенетических исследований, проведенных в Кемерово ранее, было установлено, что население этого промышленного города, вне зависимости от района проживания, можно характеризовать как единую популяцию в плане воздействия генотоксикантов (Дружинин, 2003). Показано, что существует корреляционная связь между динамикой уровня ХА у населения и изменением концентрации отдельных генотоксических загрязнителей воздуха (Волков и др., 2001). В двухтысячные годы произошли значительные трансформации в состоянии окружающей среды, вызванные изменением социально-экономической ситуации в регионе. Снизились валовые выбросы загрязняющих веществ базовыми отраслями промышленности (угледобывающая, металлургическая промышленность, теплоэнергетика), изменилась степень их экологической опасности (Мун и др., 2011). Однако канцерогенные риски для населения, связанные с присутствием в воздухе городов и отдельных районов Кузбасса мощных канцерогенов, остаются очень высоки (Ларин и др., 2004; Глушков и др., 2006; Мун С. А. и др., 2006). Поэтому целью данного исследования стал сравнительный анализ генотоксических эффектов (уровня и спектра ХА) у населения г. Кемерово в двух периодах: 1986-2000 гг. и 2001-2012 гг. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Анализ состояния окружающей среды в г. Кемерово проводили на основании данных, представленных в Докладах о состоянии окружающей среды в Кемеровской области (в 1998-2013 гг.), и сведений, любезно предоставленных Центром гигиены и эпидемиологии по Кемеровской области. Материалом для анализа динамики кластогенных эффектов послужили результаты цитогенетических исследований, выполненных кафедрой генетики Кемеровского госуниверситета и лабораторией цитогенетики Института экологии человека СО РАН в период 1986-2012 гг. Были проанализированы данные для 668 человек, проживающих в г. Кемерово и профессионально не контактирующих с промышленными генотоксикантами. В обследованную группу включили детей школьного возраста и взрослых: преподавателей и студентов КемГУ (1986, 1995, 1998 гг.), сотрудников центра здоровья «Энергетик» (2005, 2008 гг.), здоровых доноров областной станции переливания крови (2010, 2012 гг). Всего цитогенетический анализ был выполнен у 431 взрослого (средний возраст - 40,4 лет) и 237 детей и подростков (средний возраст - 14,5 лет), мужского пола - 388, женского - 280. Из них 333 человека было обследовано в период до 2000 г. (девяностые годы) и 335 - позднее, в двухтысячные года (2005-2012 гг.). Половозрастная характеристика обследованных групп представлена в таблице 1. Материалом для исследования ХА служила цельная периферическая кровь, которую забирали у жителей г. Кемерово из локтевой вены в асептических условиях. Культивирование клеток крови проводили по единому стандартному протоколу в 48-часовых культурах лимфоцитов периферической крови (Hungerford, 1965; Дружинин, 2003). Питательную смесь готовили из расчета: среда RPMI-1640 (4,5 мл), эмбриональная телячья сыворотка (1 мл) и 0,1 мл фитогемагглютинина (ПанЭко). Смесь помещали в стерильные культуральные флаконы и добавляли 0,5 мл гепаринизированной крови. Культуральные флаконы выдерживали при 37 °С в течение 48 ч. За 2 часа до фиксации в культуры вводили колхицин (0,5 мкг/мл). После гипотонической обработки и фиксации клеток суспензию раскапывали на охлажденные чистые предметные стекла и высушивали. Препараты окрашивали 1%-м красителем Гимза (Merk) и анализировали при помощи микроскопа Axio Scope 2 plus (Carl Zeiss). Отбор метафаз, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических нарушений соответствовали общепринятым рекомендациям (Бочков и др., 1971). На каждого человека анализировали по 100- 200 метафаз. Долю аберрантных метафаз определяли как отношение числа клеток c аберрациями хромосом к общему числу изученных клеток. Учитывали аберрации хроматидного (одиночные фрагменты и межхроматидные обмены) и хромосомного (парные фрагменты, диценрические хромосомы с фрагментами и без, кольцевые хромосомы, атипичные моноцентрики) типов. Ахроматические пробелы в число аберраций не включали. Математическую обработку результатов проводили с помощью программы «STATISTICA for WINDOWS v.8.0». Проверку нормальности распределения выполняли с использованием W-критерия Шапиро- Уилка (Shapiro-Wilk’s W test). Было установлено, что анализируемые распределения отличались от нормального (р < 0,05). Поэтому дальнейший анализ проводили непараметрическими методами. При анализе различий между несколькими независимыми выборками применяли критерий Краскела-Уоллиса (Kruskal-Wallis test). Для оценки различий между двумя независимыми выборками использовали U-критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney U-test). Для изучения взаимосвязей между загрязнением воздуха и ХА использовали корреляционный (рассчитывали коэффициент ранговой корреляции Спирмена) и регрессионный анализ (рассчитывали коэффициенты линейной регрессии) (Гланц, 1999). Для исключения ошибки первого рода при множественных сравнениях применяли критерий Бонферрони (Гржибовский, 2008). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Оценка состояния радиационной обстановки воздуха на территории г. Кемерово осуществлялась по данным станций государственной наблюдательной сети Федеральной службы России по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды. Ежесуточно на 14 метеостанциях проводятся измерения мощности экспозиционной дозы гамма-излучения (МЭД). По результатам мониторинга МЭД во все изученные периоды не превышала естественного фона, а значение находилось в пределах от 9 до 14 мкР/час (в среднем, 12 мкР/час). Существенных изменений радиационной обстановки в г. Кемерово в рассматриваемый период времени (1986-2012 гг.) не происходило. Анализ загрязненности питьевой воды городского водопровода г. Кемерово, а также качества пищевых продуктов (содержание токсических элементов, антибиотиков, нитратов, пестицидов и микотосинов), проведенный ранее (Волков и др., 2001), позволил сделать вывод об отсутствии токсико-генетического риска, связанного с потреблением питьевой воды или недоброкачественной продовольственной продукции. Наиболее значимым в этом аспекте представляется влияние загрязнения атмосферного воздуха. В результате многолетних наблюдений, проводившихся Федеральной службой России по гидрометеорологии и мониторингу окружающей среды, уровень загрязнения атмосферного воздуха в г. Кемерово был признан высоким (Доклад о состоянии …, 2013). Однако если рассмотреть динамику валовых выбросов в атмосферный воздух от стационарных источников (рис. 1) можно отчетливо наблюдать снижение количества валовых выбросов в период с 1986 по 2012 г. Вероятно, причина наблюдаемых процессов связана с изменением социально-экономической ситуации в Кузбассе, сокращением объемов производства, внедрением новых технологий и ужесточением экологического контроля за выбросами предприятий. На стационарных постах г. Кемерово регулярно отслеживается содержание в воздухе таких соединений, как аммиак, бензо(а)пирен (БП), формальдегид, сажа, взвешенные вещества, диоксид серы, диоксид азота, оксид азота, оксид углерода, анилин, диметиламин, водород цианистый, фенол, водород хлористый, металлы. Наибольший вклад в загрязнение атмосферного воздуха г. Кемерово (наиболее значительное превышение ПДК) вносят БП, формальдегид, диоксид азота, аммиак, сажа. Загрязнение атмосферы хлором, серной кислотой, метиловым спиртом, толуолом, хлористым водородом, диметиламином, изопропиловым спиртом, анилином, нафталином, ксилолом и цианистым водородом, металлами не достигает ПДК ни по средним, ни по максимальным концентрациям. Изменение вклада ведущих загрязнителей атмосферного воздуха (превышающих ПДК) в периоды 1986-2000 гг. и 2001-2012 гг. представлено на рисунке 2. Выраженные, статистически значимые изменения наблюдаются в отношение БП. Если в период 1986- 2000 гг. его среднегодовая концентрация составляла в среднем 5,2 нг/м3, то в 2001-2012 гг. - 3,4 нг/м3 (различия статистически значимы U = 46,0; р = 0,0177), во всех замерах значимо превышая ПДК 1 нг/м3. Согласно данным литературы, БП относится к веществам с несомненным мутагенным и канцерогенным эффектом, поэтому его можно рассматривать в качестве одного из ведущих факторов формирования ХА у горожан. Значимым показателем загрязнения атмосферного воздуха городов является присутствие сажи и пыли. Средняя за год концентрация данных поллютантов в атмосфере Кемерово не превышала ПДК ни в одном из периодов наблюдений. Однако во время разовых замеров на отдельных постах наблюдали превышение ПДК (т. е. имело место эпизодическое повышение). Доля проб выше ПДК варьировала от 1,4 до 14,4 %. Максимальные разовые концентрации сажи достигали 3,8 ПДК. Известно, что присутствие в атмосфере пыли, сажи, взвешенных частиц может способствовать реализации генотоксических эффектов мутагенов окружающей среды. ПАУ легко аккумулируются на поверхности сажистых и других взвешенных частиц. Таким образом, в атмосфере г. Кемерово существуют все условия для проявления мутагенных свойств ПАУ и, в частности, бензо(а)пирена. Помимо значительного снижения концентрации БП в двухтысячные годы наблюдалось статистически значимое уменьшение содержания в атмосфере г. Кемерово формальдегида, аммиака и фенола и повышение концентрации диоксида азота (рис. 2). Формальдегид и фенол, как известно, обладают выраженным канцерогенным и мутагенным действием на клетки животных и человека (IARC, 2006; Schmid, Speit, 2007). Кластогенные эффекты этих веществ проявляются в повышении частоты ХА в клетках крови при длительном контакте с ними в производственной среде (Santovito et al., 2011; Ladeira et al., 2013). Наблюдаемое в Кемерово в двухтысячные годы снижение уровня формальдегида и фенола, а также аммиака (который нередко рассматривается, как слабый мутаген) в атмосфере потенциально способно влиять на уровень ХА у горожан. Вопрос о мутагенной активности диоксида азота остается спорным. Мутагенный эффект вещества установлен в бактериальном тесте Эймса, в тестах по выявлению разрывов ДНК и ХА в клетках легких крыс (WHO, 1997), при исследовании цитогенетических повреждений в лимфоцитах периферической крови людей при высокой концентрации вещества в воздухе рабочей зоны (Jodinger et al., 1998). В то же время мутагенный эффект воздействия диоксида азота не был подтвержден в полиорганном микроядерном тесте на крысах (Сычева и др., 2006). Первые цитогенетические исследования населения г. Кемерово были начаты сотрудниками Кемеровского государственного университета в 1986 г. Динамика спонтанного уровня хромосомных аберраций в этот и последующие годы представлены в таблицах 2 и 3. При первом обследовании взрослых (1986 г., студенты и сотрудники КемГУ) была зарегистрирована довольно высокая частота клеток с ХА - медиана - 3,0; максимум -13 % (табл. 2). Валовые выбросы загрязняющих веществ в атмосферу города в этот год были самыми высокими (рис. 1). Последующие исследования генотоксических эффектов воздействия факторов окружающей среды г. Кемерово демонстрировали снижение спонтанного уровня хромосомных нарушений у взрослых (статистически значимыми были отличия с данными 2005-2012 гг.). Уровень хромосомных нарушений, регистрировавшийся у кемеровчан в период 2005-2012 гг. (медиана=1,0), был статистически значимо ниже регионального фонового уровня ХА у взрослого населения Кемеровской области (медиана = 3,0), рассчитанного на основе результатов цитогенетического анализа у жителей деревень и поселков, не испытывающих генотоксического давления окружающей среды (Дружинин, 2003; Минина, 2013). Таким образом, в 2000-х годах было установлено новое значение фонового уровня хромосомных нарушений у жителей г. Кемерово, не контактирующих профессионально с промышленными генотоксикантами, которое может использоваться в дальнейшем в генетико-экологических исследованиях (табл. 2). У детей г. Кемерово в период 1992-1996 гг. уровень ХА (медиана - 3,0 %) был значимо выше регионального фонового уровня у детей Кемеровской области (медиана - 2,5 %) (табл. 3). Наиболее высокие значения уровня аберраций хромосом были выявлены в апреле 1996 г., когда были обследованы 40 подростков, проживающих в г. Кемерово. Причины подобного резкого повышения не вполне ясны. Частота метафаз с ХА у них составила в среднем 4,25 ± 0,43 %, медиана - 4,0. Такая высокая частота нарушений не регистрировалась более ни в одной из групп детей или взрослых. Самая низкая частота ХА у детей была зарегистрирована в 1992 г. (медиана - 1,0 %). В последующие годы аберраций хромосом было уже статистически значимо больше: медиана в 1993 г. - 3,3 %.; в 1994 г. - 4,0 %; в 1995 г. - 3,0 %, в 1996 г. - 4,0 %. Связать низкую частоту ХА в 1992 г. и высокую в 1996 г. с изменением выброса изученных загрязняющих веществ не представляется возможным (рис. 1). Вероятно, в эти года существовали некие неучтенные факторы, сопутствующие проявлению мутагенных эффектов в условиях крупного промышленного города, которые требуют дальнейшего изучения. Не исключено, что такими факторами были спонтанные залповые выбросы загрязняющих веществ, не включенные в официальные отчеты. Поскольку в период 1986-1998 гг. проводились обследования как взрослых, так и детей, появилась возможность провести сравнения между ними. Установлено, что показатели хромосомного мутагенеза (как общая частота аберраций, так и их отдельных типов) у взрослых и детей, проживающих в г. Кемерово, статистически значимо не различались. Так, например, медиана частоты клеток с ХА у детей (суммарно за период до 2000 г.) составила 3,00 % (n = 237), у взрослых (суммарно за тот же период) медиана - 3,0 % (n = 96) (рис. 3). Корреляционный анализ также не показал существования зависимости между возрастом и ХА. Таким образом, можно заключить, что возраст в исследованной выборке не модифицировал частоту мутаций хромосом. Гендерные особенности выборки также не оказывали значимого влияния на ХА. Не было отличий между лицами мужского и женского пола как в период в 1986-1998 г., так и в 2005-2012 гг. (рис. 4). Однако наблюдались четкие отличия между лицами одного пола, но в разные периоды: как у мужчин, так и у женщин в 2005-2012 гг. частота ХА была статистически значимо ниже, чем в 1986-1998 гг. Это снижение хорошо согласуется с динамикой валового выброса загрязняющих веществ (рис. 1) и изменением после 2000 г. среднегодовой концентрации таких поллютантов как бензо(а)пирен, формальдегид, фенол (рис. 2). Учитывая отсутствие значимого влияния пола и возраста на показатели ХА в данной выборке, в дальнейшем, группы детей и взрослых, мужчин и женщин объединили и анализировали совместно. Анализ качественного спектра аберраций показал, что ведущим типом хромосомных нарушений у жителей г. Кемерово являются одиночные и парные фрагменты. В целом преобладали аберрации хроматидного типа (одиночные фрагменты). Было установлено, что в двухтысячные годы произошло значительное снижение частот встречаемости одиночных, парных фрагментов, обменов хроматидного типа и небольшое повышение частоты дицентрических хромосом (табл. 4). Была проведена оценка значимости влияния фактора курения на изученные цитогенетические показатели. Установлено отсутствие статистически значимых отличий между курящими и некурящими как в период до 2000 г., так и после. Например, доля аберрантных метафаз до 2000 г.: у курящих медиана - 3,0 % (n = 62), у некурящих - медиана - 3,0 % (n = 271) и после 2000 г: у курящих медиана - 1,0 % (n = 118), у некурящих медиана - 1,0 % (n = 217). При анализе зависимостей между загрязнением атмосферного воздуха и уровнем ХА у жителей г. Кемерово было отмечено наличие статистически значимой положительной корреляции между валовым выбросом загрязняющих веществ в атмосферу Кемерово и уровнем ХА у населения (коэффициент корреляции Спирмена rs = 0,68, р = 0,000001) (рис. 5 а). При анализе вклада отдельных загрязнителей статистически значимые положительные коэффициенты корреляции выявлены при сопоставлении динамики ХА и концентрации в воздухе бензо(а)пирена (rS = 0,88; p = 0,000001) (рис. 5 б) и формальдегида (rS = 0,68; p = 0,000001) (рис. 5 в). Эти взаимосвязи не удивительны и подтверждают кластогенный эффект воздействия данных соединений на организм человека. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Значимая роль состояния окружающей среды в формировании популяционного уровня цитогенетической нестабильности у жителей промышленных городов не вызывает сомнений. В данной работе удалось проследить изменение уровня ХА у жителей г. Кемерово на протяжении более 20 лет в зависимости от динамики концентрации ведущих загрязнителей, выявлены прямые корреляции между содержанием бензо(а)пирена, формальдегида и частотой клеток крови, несущих повреждения хромосом. Установлено значительное снижение уровня ХА у жителей крупного промышленного центра Сибири в двухтысячные годы по сравнению с предыдущим периодом, согласующееся с уменьшением выбросов загрязняющих веществ в атмосферный воздух. Получено новое значение средней частоты ХА у жителей г. Кемерово - 1,48 ± 0,08 %, так и частот отдельных видов аберраций (табл. 4). Необходимо отметить, что снижение уровня ХА в период после 2000 г. совпадает со снижением показателей онкологической заболеваемости населения г. Кемерово. Ранее было отмечено статистически значимое снижение показателей онкозаболеваемости в период 2000-2009 гг. по сравнению с 1990-1999 гг. (Мун и др., 2013). Этот факт может служить дополнительным подтверждением согласованности процессов загрязнения окружающей среды, мутагенеза и канцерогенеза у населения промышленных городов.

About the authors

Varvara Ivanovna Minina

Institute of Human Ecology of the Siberian Branch of the RAS

Email: vminina@mail.ru

Vladimir Gennadyevich Druzhinin

Kemerovo State University

Email: druzhinin_vladim@mail.ru

Tatyana Aleksandrovna Golovina

Kemerovo State University

Email: genetics.golovina@gmail.com

Tatyana Andreyevna Tolochko

Kemerovo State University

Email: totat@list.ru

Alina Viktorovna Meyer

Kemerovo State University

Email: shapo-alina@yandex.ru

Aleksey Nikolayevich Volkov

Kemerovo State University

Email: volkov_alex@rambler.ru

Marina Leonidovna Bakanova

Institute of Human Ecology of the Siberian Branch of the RAS

Email: mari-bakano@yandex.ru

Yana Aleksandrovna Savchenko

Institute of Human Ecology of the Siberian Branch of the RAS

Email: yasavchenko@ya.ru

Anastasiya Vladimirovna Ryzhkova

Institute of Human Ecology of the Siberian Branch of the RAS

Email: kotia@mail.ru

Ruslan Aleksandrovich Titov

Institute of Human Ecology of the Siberian Branch of the RAS

Email: Ruslan-tito00@rambler.ru

Sergey Anatolyevich Larin

Institute of Human Ecology of the Siberian Branch of the RAS

Email: Larin57@list.ru

Yuriy Yevgenyevich Kulemin

Institute of Human Ecology of the Siberian Branch of the RAS

Email: Ruslan-tito00@rambler.ru

References

Supplementary files