Cytogenetic status in coal-miners with occupational pulmonary diseases and influence the polymorphisms of XpD and XpG genes

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Работа в угольных шахтах, несмотря на все достижения современной науки и техники, остается одной из самых опасных для здоровья. Она сопряжена с длительным контактом с различными вредными профессиональными факторами, которые способствуют повышению не только риска различных хронических профессиональных заболеваний, но и генотоксическому риску. Повреждения ДНК, возникающие в результате генотоксического воздействия, могут быть зарегистрированы на хромосомном уровне с помощью методики учета хромосомных аберраций (ХА) в лимфоцитах периферической крови. Если исследования проблемы увеличения уровня хромосомных аберраций у работников угольных шахт в мировой литературе хоть и в незначительном количестве, но встречаются, то их связь с профессиональной заболеваемостью, и в частности с воспалительными заболеваниями дыхательной системы, мало изучена, а имеющиеся данные достаточно противоречивы (Müller, 2004; Ulker, 2008). В связи с этим представляется актуальным провести цитогенетическое исследование выборок работников угольных шахт Кузбасса, страдающих профессиональными легочными патологиями. Кроме того, известно, что полиморфные варианты генов репарации ДНК могут модифицировать уровень цитогенетических повреждений, в связи с чем была поставлена задача исследовать корреляцию некоторых вариантов генов репарации ДНК с уровнем цитогенетических повреждений в целом у шахтеров и у шахтеров, страдающих отдельными заболеваниями. Для проведения исследования выбраны аллели генов XpGAsp1104His и XpDLys751Gln. XpG - эндонуклеаза, которая осуществляет вырезание поврежденного участка ДНК с 3´-конца цепи. XpG взаимодействует с комплексом TFIIH, обеспечивающим прикрепление хеликаз и правильное расплетание цепей ДНК, делая их доступными для действия эндонуклеаз. Замена XpGAsp1104His располагается вблизи СOOH - концевого домена белка на участке, взаимодействующем с другими белками ЭРН, и может существенно изменить его способность взаимодействовать с ними. XpD - АТФ-независимая хеликаза. В составе TFIIH комплекса XpD раскручивает цепь ДНК, обеспечивая доступ эндонуклеаз к поврежденному участку. Аминокислотная замена Lys751Gln меняет конфигурацию белка и может влиять на взаимодействие с хеликазой p 44. В ряде исследований было показано значение данных нуклеотидных замен при оценке частоты цитогенетических нарушений (Benhamou, 2002; Ito S., 2007). Проведение исследований в этой области позволит выработать профилактический комплекс мер, направленный на сохранение здоровья шахтеров и снижение уровня профессиональной заболеваемости. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалом исследования послужила венозная кровь 116 шахтеров мужского пола, работающих в угольных шахтах Кемеровской области. В экспериментальную группу были включены шахтеры с диагнозами «хронический пылевой бронхит» (ХПБ) - 64 человека и«антракосиликоз» (АС) - 26 человек. Здоровые шахтеры были вынесены во вторую группу контроля - 26 человек. Средний возраст в экспериментальной группе составил 54,98 ± 4,36 года, средний стаж работы в условиях угольных шахт - 28,18 ± 4,55 года. Средний возраст работников угольных шахт, не страдающих профессиональными заболеваниями составил 52,44 ± 6,37 года, при среднем стаже 23,08 ± 10,97 года. В качестве первого контроля были исследованы 124 образца крови здоровых доноров мужского пола, незанятых на предприятиях угольного цикла и не контактирующих с другими генотоксическими веществами в своей профессиональной деятельности (доноры Кемеровского областного центра крови), средний возраст доноров составил 50,92 ± 4,55 года. В исследования включались лица, не проходившие рентгенологическую диагностику в течение трех месяцев до взятия крови, не болеющие инфекционными и онкологическими заболеваниями на момент забора материала. Культивировали лимфоциты периферической крови, полученной из локтевой вены шахтеров. В культуральный флакон помещали 0,5 мл крови, 0,1 мл фитогемагглютинина («ПанЭко», Россия), 6 мл среды RPMI-1640 («ПанЭко», Россия), 1,5 мл эмбриональной телячьей сыворотки. Длительность культивирования составляла 48 часов. Затем в культуры добавлялся колхицин до конечной концентрации 0,5 мкг/мл, флаконы помещали в термостат еще на 2 часа. По окончании цикла культивирования препараты центрифугировали 10 минут на 1000 оборотах, надосадок убирали, осадок ресуспендировали и помещали в гипотонический раствор 0,55 М KCl на 10-15 минут (37 °C). Фиксацию материала проводили в трех сменах охлажденного свежеприготовленного фиксатора Карнуа (метанол и уксусная кислота в соотношении 3 : 1). Клеточную суспензию раскапывали на чистые, охлажденные, смоченные водой предметные стекла. Препараты шифровали и окрашивали 2 % раствором красителя Гимза. Учет ХА проводили под световым микроскопом при увеличении 1000 раз в присутствии масляной иммерсии без кариотипирования. Отбор метафазных пластинок, включаемых в анализ, и критерии для регистрации цитогенетических нарушений соответствовали общепринятым рекомендациям (Hungerford, 1969). Статистическую обработку данных проводили в программе STATISTICA 7.0 при помощи блока непараметрической статистики. Для проверки соответствия распределения данных нормальному использовали тест Колмогорова-Смирнова. Сравнение групп осуществляли с помощью рангового U-теста Манна-Уитни. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Результаты изучения ХА у работников угольных шахт, страдающих профессиональными патологиями, а также контрольных групп, представлены в таблице 1. При оценке уровня цитогенетических нарушений в экспериментальной группе по сравнению с контролем 1 были выявлены некоторые закономерности: количество аберраций на 100 клеток было достоверно выше в выборке работников угольных шахт, страдающих легочной патологией, наблюдалось увеличение общего количества аберраций как хроматидного, так и хромосомного типа у больных шахтеров, а также уровня хромосомных обменов. Аналогичные результаты были получены в работе исследователей из Чехии (Smerhovsky et al., 2001) и Турции (уровень аберраций на 100 клеток у работников угольных шахт был практически равен значению данного показателя в нашем исследовании - 5,82 ± 0,87 %) (Donbak et al., 2005). В работе исследователей из Перу (Santa-Maria et al., 2007) было обнаружено достоверное превышение частоты одиночных и парных фрагментов в группе шахтеров, однако данные показатели были ниже, чем их аналоги, полученные нами для контрольной группы. Это можно объяснить слишком маленькой экспериментальной выборкой (8 человек), изученной в исследовании. Чтобы выявить вклад воспалительного процесса в общий уровень хромосомных повреждений в нашем исследовании, мы сравнили экспериментальную выборку с контролем 2, представленным здоровыми стажированными шахтерами. В экспериментальной группе было обнаружено повышение уровня хромосомных обменов при значимости p < 0,01, а также увеличение количества дицентрических хромосом и аберраций хромосомного типа в общем при уровне значимости p < 0,05. Таким образом, в нашей работе было выявлено влияния воспалительного процесса как на уровень аберраций хромосомного типа в общем, так и на отдельные типы аберраций. В работе Ulker et al. (2008) также были получены данные о влиянии профессиональных воспалительных легочных заболеваний на уровень цитогенетических повреждений. При сравнении уровня сестринских хроматидных обменов и микроядер лимфоцитов периферической крови у лиц, страдающих пневмокониозом (ПК), по сравнению со здоровыми шахтерами найдено достоверное увеличение уровня вышеуказанных цитогенетических маркеров у больных работников шахт. При исследовании спектра хромосомных аберраций у шахтеров в зависимости от генотипов XpGAsp1104His, XpDLys751Gln установлено, что в группе шахтеров частота аберрантных метафаз статистически значимо выше у обладателей генотипов XpGHis/His (6,45 ± 0,52 %) по сравнению с XpGAsp/His (4,9 ± 0,42 %, р = 0,039), а также генотипов XpDGln/Gln (6,32 ± 0,34 %) по сравнению с XpDLys/Lys (4,47 ± 0,45 %, р = 0,005). В исследовании взаимосвязи генов XpG и XpD на наличие профессиональных заболеваний обнаружено, что аллель гена XpGAsp1104His ассоциирован с ХПБ и АС. Частота ХПБ была превышена у гомозигот Asp/Asp (наблюдаемый уровень Asp/Asp был больше ожидаемого на 10,2 %, p = 0,018, df = 2), а у носителей гомозиготного аллеля His/His, напротив, частота ХПБ была понижена (наблюдаемый уровень His/His был меньше ожидаемого на 12,78 %, p = 0,018, df = 2), при этом у гетерозигот наблюдаемые частоты соответствовали ожидаемым. Частота АС была также превышена у гомозигот Asp/Asp (наблюдаемый уровень Asp/Asp был больше ожидаемого на 32,8 %, p = 0,006, df = 2), а у гетерозигот и гомозигот His/His наблюдаемые частоты соответствовали ожидаемым. Данные закономерности можно объяснить тем, что вариантные аллели данных генов кодируют ферменты со сниженной способностью к эксцизионной репарации нуклеотидов, что способно приводить к накоплению хромосомных нарушений. ВЫВОДЫ Частота хромосомных нарушений у шахтеров выше, чем в группе сравнения, что свидетельствует о генотоксическом характере воздействия производственной среды. Получены данные о модифицирующем влиянии профессиональных воспалительных легочных заболеваний работников угольных шахт на уровень некоторых хромосомных аберраций. Выявлена взаимосвязь генов XpG и XpD с цитогенетическим статусом шахтеров, что можно объяснить тем, что вариантные аллели данных генов кодируют ферменты со сниженной способностью к эксцизионной репарации нуклеотидов. Кроме того, была показана ассоциация гена XpGAsp1104His с легочными профессиональными заболеваниями.

About the authors

Valentin P. Volobaev

Kemerovo State University

Author for correspondence.
Email: volobaev.vp@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-7355-9882
SPIN-code: 2805-5700

Junior Researcher

Russian Federation, 6 Krasnaya str., Kemerovo, 650000

Maksim Yur'yevich Sinitskiy

Kemerovo State University

Email: max-sinitsky@rambler.ru
PhD student, biological faculty, departament of Genetics

Yuriy Evgen'yevich Kulemin

Kemerovo State University

Email: jura.kulemin@gmail.com
PhD student, biological faculty, departament of Genetics

References

Supplementary files