Population genetic structure of HLA-G gene in North-west Region of Russian Federation

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Система HLA (Human Leukocyte Antigen) - высокополиморфный локус, содержащий гены, продукты которых осуществляют контроль взаимодействия всех иммунокомпетентных клеток организма, распознавание своих и чужеродных (в том числе измененных собственных) клеток, запуск и реализацию иммунного ответа. HLA-G является неклассическим HLA геном, в отличие от классических генов (HLA-A, HLA-B, HLA-C) HLA-G экспрессируется тканеспецифично клетками трофобласта, клетками тимуса и стволовыми клетками (Loustau et al., 2013). Экспериментальные данные свидетельствуют о способности растворимых белковых продуктов гена HLA-G локально подавлять иммунную систему, однако конкретный молекулярный механизм данного воздействия до сих пор не изучен. Показана способность белка HLA-G модулировать пролиферацию клеток иммунной системы, а также силу и специфичность иммунного ответа. HLA-G отличается от классических HLA генов меньшим количеством полиморфных аллелей, так например HLA-B имеет 1431 аллель, HLA-C - 569 аллелей, тогда как HLA-G лишь - 46 аллелей. (Donadi et al., 2011). Полиморфные изменения гена затрагивают как кодирующие, так и некодирующие области гена. Полиморфизм-725 С/G в промоторной области гена, и 3741*ins/del 14 п.н в 3’ нетранслируемой области гена влияют на уровень экспрессии гена и стабильность мРНК, тогда как аллели G*0101, G*0102 G*0103, G*0104, G*0105N, G*0106, G*0107 кодируют продукты, имеющие разный на аминокислотный состав. Для некоторых из аллелей выявлена достоверная ассоциация с повышением риска развития патологий, связанных с нарушением иммунного ответа. Можно выделить неблагоприятные генотипы, которые, по-видимому, вносят весомый вклад в развитие мультифакторных заболеваний. Аллели G*0101-G0107 представляют собой следующие сочетания однонуклеотидных замен в белок-кодирующей области гена: HLA-G*0101 (31A, 54A, 110C, 130CC, 2 П58C), HLA G*0102 (31A, 54G, 110C, 130CC, 258C), HLA G*0103 (31T, 54A, 110C, 130CC, 258C), HLA G*0104 (31A, 54A, 110A, 130CC, 258C), HLA G*0105N (31A, 54A, 110C, 130CA, 258C), HLA G*0106 (31A, 54A, 110C, 130CC, 258T), HLA G*0107 (31A, 54A, 110A, 130CC, 258T). Аллель G*0101 рассматривается как один из наиболее древних аллелей данного гена, так как аллель G*0101 обнаружен еще у обезьян и шимпанзе (Castro et al.,1996), появление других аллелей (G*0102- 0107) сводится непосредственно к видовой эволюции человека. Одной из наиболее активно изучаемых однонуклеотидных замен в промоторной области гена является замена C на G (-725* C>G-rs1233334), находящаяся на расстоянии 19 п.н от активного ISRE сайта, и в 10 п.н от нефункционального гамма-интерферон-активируемого сайта (Rousseau et al., 2003). Аллель-725*G ассоциирован с увеличением риска невынашивания беременности (Ober et al.,2003). При анализе экспрессии гена на культуре клеток трофобласта выяснилось, что уровень транскрипции HLA-G гена несущий -725*G аллель повышен (Ober at al., 2006). Популяционные исследования -725C>G полиморфизма HLA-G гена немногочисленны: в настоящее время существуют данные о частотах аллелей в польской популяции (Щецин) (Sipak-Szmigiel et al., 2009). Еще один аллельный вариант в некодирующей части гена HLA - инсерция/делеция 14 п. н. в положении 3741 (rs66554220) достаточно активно изучается. Аллель с инсерцией 14-пар нуклеотидов ассоциирован с пониженным количеством мРНК HLA-G, и к более низким концентрациям растворимых и мембран-ассоциированных форм HLA-G (Rousseau et al., 2003). В настоящее время установлена ассоциация аллеля 3741*ins с развитием осложнений после трансплантации органов и тканей, болезнью Крона и язвенного колита, артрита, гестоза и привычного невынашивания беременности (Glas et al., 2007; Donadi et al., 2011). Анализ гена HLA-G, как одного из возможных генов-кандидатов, вносящих вклад в мультифакторные заболевания, крайне важен для медицинской генетики. Детальное изучение генов-кандидатов позволяет приблизиться к пониманию патогенеза мультифакторных заболеваний, ассоциированных с иммунной системой. В настоящее время нет данных об особенностях распределения аллелей гена HLA-G у жителей Северо-Западного региона России, что обусловливает необходимость проведения данного исследования в этой популяционной группе. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В группу вошли 118 человек (65 мужчин и 53 женщин) в возрасте от 20 до 40 лет, без хронических заболеваний, на момент забора крови на станции переливания крови ИАГ им.Отта и проживающих в Северо-Западном регионе РФ. Выделение ДНК проводили стандартным фенол-хлороформным методом с некоторыми модификациями. Олигонуклеотидные праймеры, необходимые для проведения ПЦР, подбирали с использованием программы «Oligo v.6.31» (Molecular Biology Insights Inc., США). Последовательности фрагментов гена HLA-G получены из интернет-баз «HLA Informatic Group, Anthony Nolan Research Institute» (США). Для идентификации основных классов аллелей (G*0101, G*0102, G*0103, G*0104, G*0105N, G*0106 и G*0107) была разработана собственная система праймеров (за основу брали последовательности олигонуклеотидов французских исследователей (Moreau et al., 2008). Эти праймеры позволяли амплифицировать фрагменты анализируемых аллелей в моноплексной реакции и практически не отличались друг от друга по размерам, что не позволяло в дальнейшем использовать их для проведения мультиплексной ПЦР. Для проведения мультиаллельспецифичной ПЦР праймеры подбирали таким образом, чтобы концевой 3’ нуклеотид праймера соответствовал анализируемой однонуклеотидной замене и ПЦР-реакция шла только при полной комплиментации праймера с анализируемой ДНК, что позволяет судить о присутствии изучаемой аллели. Структура олигопраймеров и идентифицируемые аллели представлены в таблице 1. Для идентификации полиморфизма 3741*ins/del 14 п. н. использованы последовательности праймеров, приведенные в работе Veit et al., 2008. Анализ полиморфизма -725 С/G проводили с использованием олигопраймеров, позволяющих создать искусственный сайт рестрикции для фермента Pce I (F: 5’-TGA ACC AGC CCT CCT AAT AA-3’, R: 5-’ACC GAT TAG ATT CCT GA TCA TTC AGG GGT TAC CAA-3’). Для анализа замены -725 С > G проводили гидролиз ПЦР-продукта эндонуклеазой Pce I согласно рекомендациям фирмы-изготовителя («Cибэнзим», Новосибирск). Для амплификации использовали программируемые термоциклеры фирм «ДНК-технология» (Москва). После окончания ПЦР специфичность амплификации и количество ДНК проверяли методом электрофореза в 7,5 %-м полиакриламидном геле (ПААГ). ПААГ окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе «Macrovue» («Pharmacia LKB», Великобритания) и фотографировали с использованием системы видео-гель-документации («Vilber Lourmat»). Расчет частот аллелей производился исходя из закона Харди-Вайнберга. Так как закон Харди-Вайнберга подразумевает биномиальное/полиномиальное распределение частот аллелей, то доверительный интервал для частот аллелей рассчитывался по методу Клоппера-Пирсона, учитывающему ассиметричность интервалов и возможность расчета при частоте аллели = 0. Расчет проводился с помощью интернет-калькулятора Statistics Calculators (http://www.danielsoper.com/ default.aspx). Срвнение частот генотипов в популяциях проводили методом χ2 по формуле: χ2 = (N1N3 - 1 ∕ 4N22)2N ∕ (n12n22), где N1, N2 и N3 - численности генотипов XX, Xx и xx, N - общий объем выборки, n1 и n2 - число аллелей исследуемых генов в выборке (Животовский, 1991). При выявлении статистических различий между популяциями для каждого значения P рассчитывалось значение prep, показывающее вероятность получить различие с тем же знаком при повторном сравнении (Killeen 2005). , где prep = искомое значение В качестве пост-теста для Р, использовался расчет значения Фс по Крамеру, , где N - размер выборки, К - наименьшее из количества строк/столбцов. Значение Крамера варьирует от 0 до 1 и показывает силу взаимодействия двух групп. Значение близкое к 0 означает слабую связь, значение близкое к 1, соответственно, указывает на сильную связь. Определение достоверности различий между сравниваемыми группами или подгруппами по частотам генотипов и аллелей исследуемого гена производили с помощью критерия Фишера (F) или хи-квадрат (χ2) по стандартной формуле с учетом поправки Йетса для парных сравнений. При выявлении популяционных различий рассчитывалось стандартное генетическое расстояние по Нею. Где I - коэфицент родственности, D - генетическое расстояние, ai и bi - частоты аллелей i в популяциях a и b. Кластеризация популяций производилась по методу Уарда (Ward) с использованием меры расстояния Эвклида с помощью программы StatSoft Statistica 7. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ В настоящей работе проанализированы основные аллельные варианты гена HLA-G: -725*С/G, 3741*ins/del 14 п.н и группы аллелей G*0101, G*0102 G*0103, G*0104, G*0105N, G*0106, полиморфизм которых уже изучен в популяционных выборках разных стран, причем большая часть исследуемых аллелей встречается в популяциях относительно часто (табл. 2, 3). В таблице 4 представлены частоты аллелей в популяционной выборке Северо-Запада РФ. Нами определены частоты аллелей G*0101-0107 у 65 мужчин и 53 женщин (табл. 4). Частота генотипа G0101/G0101 составила 73 %, частота генотипа G0101/G0104 - 17 %. Генотипы G0101/G0103 и G0101/G0105 встречались с частотами 4 % и 6 % соответственно. При анализе основных аллелей как в кодирующих областях гена HLA-G (G*0101-0107), так и в некодирующих участках (-725 C >G и 3741ins14/del14), статистически значимых различий по частотам генотипов и аллелей между группами мужчин и женщин популяции Северо-Запада РФ не выявлено (p > 0,05). Распределение соответствующих генотипов в исследуемой группе соответствовало распределению Харди-Вайнберга (р > 0,05). При сравнении частот аллелей и генотипов полиморфизма 3741ins14/del14 гена HLA-G в популяционной выборке Северо-Запада РФ с данными, полученными для популяций Бразилии (Сан-паулу), Индии (Лакхнау), Китая (Цзянсу), Дании (Копенгаген), Польши (Щецин) и Германии (Мюнхен), статистически значимых различий не выявлено. Не установлено достоверных различий для популяций Северо-Западного региона РФ и Польши при сравнительном анализе частот аллелей и генотипов полиморфизма 725*C>G гена HLA-G (Sipak-Szmigiel et al., 2009). Определены статистически значимые различия при сравнительном анализе распределений частот аллелей HLA-G*0101-*0107 между популяцией Северо-Запада РФ и популяциями Испании, Африканских Шона, Бразилии, Китая, Японии, Польши, Хаттеритов и Северной Индии. Отличий с популяцией Дании и Германии выявлено не было (табл. 5). Таким образом, в результате проведенной работы установлены статистически значимые различия в частотах аллелей G*0101-0107 между популяцией северо-западного региона России в сравнении с рядом других популяций. Можно предполагать, что это связано с этническими различиями сравниваемых выборок. Известно, что сходства или различия в отношении типа, количества и характера межпопуляционной генетической изменчивости могут быть результатом многих факторов. Так, сходство двух популяций может быть обусловлено тем, что они недавно дивергировали, между ними существует поток генов, они представляли собой крупные популяции с небольшим генетическим дрейфом или сходный тип отбора действовал на сходные локусы обеих популяций. Различия между популяциями могут быть связаны с долговременной изоляцией и отсутствием потока генов между популяциями, или на популяции действует отбор разной силы. Частота аллели G*0101 в популяции Северо-Запада РФ составила 86,5 %. Аллель G*0101 рассматривается как наиболее широко распространенная среди европеоидов (в популяции Хаттеритов частота составляет 72,5 %, в популяции Дании - 87 %, Германии - 86 %, Японии - 55 %, Индии - 39 %). По частоте встречаемости аллель G*0104 находится на втором месте после аллеля G0101, причем, согласно данным литературы, ее частота в Европейских популяциях не превышает 10 %. Для Востока и Юго-Востока Евразии частота данной аллели высока и составляет 25 % в Китае, 24 % в Индии (45 % в Африке). Частота аллеля G*0104 в нашей популяции составляет 8,5 %, что примерно сопоставимо со значениями для популяции Дании (Копенгаген) и Германии (Бонн). Частота аллеля G*0105N в популяции Северо-Западного региона РФ составляет 3 %. Аллель G*0105N относительно широко распространенн в Бразильской и Африканской популяциях с частотами 11 % и 15 % соответственно. Меньшая частота наблюдается в популяции Испании - 6 %, Дании - 1 %, Германии - 2 %, Польши - 2 %. Можно предположить, что поток данного аллеля в Европейские популяции связан с агрессивной политикой арабов в Средние века при завоевании Испании. Аллель G*0103 присутствует в популяции Индии с частотой 24 %, в Бразилии - 9 %. В европейских популяциях самая высокая частота зарегистрирована в Германии и Дании, около 4 %. Для популяционной выборки Северо-Запада РФ частота аллеля G0103 составляет 2 %. В популяции Северо-Запада РФ аллель G0106 не идентифицирован, как и в популяции Польши (Щецин) и Германии (Бонн). В Бразильской (5 %) и Индийской популяциях (3 %) ее частота оставляет 5 % и 3 % соответственно. Единственная европейская популяция, где зарегистрирован аллель G0106 - популяция Дании (4 %). Аллели G*0102 и G*0107, обнаруженные в единственном случае при исследовании различных популяций, при анализе популяции Северо-Запада РФ, не были детектированы, что дает дополнительные факты считать эти аллели крайне редкими. Полученные нами данные указывают на существование популяционных различий в распределении аллелей гена HLA-G среди индивидуумов Северо-Западного региона РФ по сравнению с другими популяциями, и свидетельствует о важности исследования генетической структуры каждой конкретной популяции. В ходе работы нами были определены генетические расстояния между популяциями Испании (Мадрид), Китая (Шанхай), Японии (Токио), Дании (Копенгаген), Индии (Лакхнау), Африканских Шона, Бразилии (Сан-Паулу), Германии (Бонн), Польши (Щецин) и популяцией Северо-Запада РФ (табл. 5). Согласно полученным данным, наименьшее генетическое расстояние определено между популяцией Северо-западного региона РФ и популяциями Дании, Германии и Польши. Любопытно, что несмотря на то что Польша территориально ближе к Северо-Западному региону РФ, результаты анализа показали, что Дания и Германия генетически оказались ближе к нашему региону. Наибольшее генетическое расстояние выявлено с популяцией Индии (Лакхнау) - 0,22 и Японии (Токио) - 0,18. Интересным фактом является отсутствие большого генетического расстояния с популяцией Бразилии (0,01), хотя она находится на другом континенте. Исходя из кластерного анализа (рис. 1), проведенного для аллелей G0101-0107 в различных популяциях, можно выделить два четко выраженных кластера: «Европейский» (Дания, Северо-Запад РФ, Германия и Польша), «Азиатский» (Япония, Северная Индия). Особый статус имеют популяция Африканских Шона, так как это единственная Африканская популяция в исследовании, и Хаттериты, малочисленная и изолированная популяция. Интересно отметить сходство между популяцией Бразилии (Сан-Паулу) и Хаттеритами, которое можно объяснить их тесным взаимодействием с европейскими популяциями. Религиозная община Хаттеритов появилась в Средние века в центральной Европе. К настоящему времени большая часть общин находится на территории США и Канады. Однако это крайне изолированная группа, в которой «эффект основателя» может быть сильно выражен. Бразилия всегда тесно взаимодействовала в культурно-историческом плане с Европой, и хорошо известно, что белое население Бразилии состоит на 50 % из выходцев Португалии и Испании. Следует отметить, что в результате проведенного анализа полиморфизма -725*C>G нами не было обнаружено генотипа -725*G/G. Существуют данные, свидетельствующие о «функциональной неполноценности» генотипа -725*G/G, связанной с нарушением экспрессии гена, приводящей в конечном итоге к измененным концентрациям белковых продуктов. Возможно, особи с генотипом -725*G/G по гену HLA-G имеют пониженную выживаемость в виду невозможности функционирования системы иммунной толерантности в полной мере. Таким образом, если рассматривать частоты аллелей с позиции синтетической теории эволюции, где вклад аллелей влияет на относительную приспособленность популяции, можно предположить, что действие определенного аллеля тонко регулирует иммунную реакцию путем модуляции на уровне связывания с рецепторами и влиянием на стабильность иРНК, то распределение частот аллелей эволюционно подбиралось для оптимальной работы гена HLA-G в популяции.

About the authors

Arseniy Pavlovich Alenichev

Saint Petersburg State University

Email: senyaa@list.ru
Student, Department of genetics and biotechnology

Yuliya Almazovna Nasykhova

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: yulnasa@gmail.com
Scientist (PhD), laboratory of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases

Tatyana Eduardovna Ivashchenko

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: tivashchenko2011@mail.ru
leading researcher (PhD, professor), laboratory of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases

Vladislav Sergeyevich Baranov

D. O. Ott Research Institute of Obstetrics and Gynecology, RAMS

Email: baranov@vb2475.spb.edu
head of the laboratory (MD, professor), laboratory of prenatal diagnosis of congenital and inherited diseases

References

Supplementary files