GENOTYPIC ANALYSIS OF NODULE BACTERIA NODULATING SOYBEAN IN UKRAINE SOILS

Full Text

Известно, что в процессе фиксации молекулярного азота из атмосферы важная роль принадлежит клубеньковым бактериям, которые способны инициировать образование азотфиксирующих клубеньков на корнях бобовых растений. Благодаря этой способности ризобии рассматривают как ценный генетический ресурс для создания микробных препаратов. В последнее время большое внимание уделяется изучению естественных природных популяций клубеньковых бактерий - микросимбионтов как традиционных, так и редких бобовых культур. Исследование генетического разнообразия специфических клубеньковых бактерий является одной из актуальных задач почвенной микробиологии (Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями, 2002). Учитывая важность такой ценной зернобобовой культуры, как соя, наше внимание было направлено на изучение популяций ее микросимбионтов (клубеньковых бактерий) в почвах разных регионов Украины. Известно, что соя может вступать в симбиоз с клубеньковыми бактериями нескольких видов: медленнорастущими Bradyrhizobium japonicum, B. elkanii, B. liaoningense (Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями, 2002; Willems, 2006) и быстрорастущими Sinorhizobium fredii, S. xinjiangensis (Chen et al., 1988) и Mesorhizobium thianshanense (Chen et al., 1995). Следует отметить, что в почвах Украины нет аборигенных клубеньковых бактерий сои, поскольку дикая соя и другие бобовые из группы перекрестно заражаемых растений (вигна, маш) в естественных фитоценозах не встречаются (Толкачев, 1997). Формирование же почвенных популяций специфических для сои ризобий началось сравнительно недавно, с момента интенсивного внедрения этой культуры в севообороты. Согласно литературным данным, типичными микросимбионтами культурной сои в почвах Украины выступают медленнорастущие бактерии вида B. japonicum, которые были интродуцированы в агроценозы в составе коммерческих биопрепаратов (Ризоторфин российского и украинского производства) (Бабич, 1993; Патика та ін., 2003; Толкачев, 1990). Поэтому популяции ризобий сои являются чрезвычайно удобным объектом для изучения процессов микроэволюции, в результате которых может происходить дивергенция микросимбионтов сои, связанная с их адаптацией, как к различным генотипам растений, так и к новым почвенно-климатическим условиям. В течение нескольких лет (2001-2004 гг.) нами изучалось распространение клубеньковых бактерий сои в агроценозах с различной интенсивностью выращивания данной культуры (соя в севообороте 10-30 лет). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в почвах страны сформировались и функционируют разные по численности локальные популяции клубеньковых бактерий сои. Несмотря на однообразие интродуцированных штаммов-инокулянтов, почвенные популяции оказались достаточно гетерогенными. В результате анализа морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств 180 штаммов ризобий сои, выделенных из почв различных регионов Украины, нами впервые обнаружены клубеньковые бактерии (Крутило та ін., 2008), существенно отличающиеся от медленнорастущих симбионтов сои вида B. japonicum, описанных ранее (Jordan, 1982). Известно, что среди бактерий рода Bradyrhizobium выделяют несколько групп штаммов, отличающихся по скорости роста (Jordan, 1982; Keyser, Cregan, 1987; Xu et al., 1995). Выделенные нами штаммы характеризовались повышенной скоростью роста и были условно названы «штаммами с интенсивным ростом». Серологический анализ 45 штаммов клубеньковых бактерий сои показал, что 20 штаммов с интенсивным ростом, независимо от их географического происхождения, относились к одной серогруппе. Медленнорастущие клубеньковые бактерии оказались серологически гетерогенными и были отнесены, как минимум, к 5 серогруппам. Еще одной важной отличительной особенностью ризобий сои с интенсивным ростом является их чувствительность к антибиотикам (штаммы чувствительны к 7-9 из 17 исследованных антибиотических веществ), что не характерно для медленнорастущих клубеньковых бактерий. Следует отметить, что штаммы с интенсивным ростом встречаются не во всех регионах Украины. Соотношение между представителями этих двух групп изменяется в зависимости от почвенно-климатической зоны, а количество выделенных штаммов с интенсивным ростом колеблется в пределах от 33 % до 53 % (Патика та ін., 2010). В связи с тем, что в Украине генетическое разнообразие клубеньковых бактерий сои в популяциях не анализировалось, целью нашей работы было изучить генотипические свойства микросимбионтов сои как медленнорастущих, так и штаммов с интенсивным ростом. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектами исследований были 6 выделенных нами штаммов - типичных представителей клубеньковых бактерий сои с медленным и интенсивным ростом из Коллекции полезных почвенных микроорганизмов Института сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства НААН. В качестве референтного использован типовой штамм B. japonicum USDA 6T = ATCC 10324Т. Ризобии сои выделяли из корневых клубеньков сои сорта Устя, которую выращивали на образцах почвы, отобранных в различных регионах Украины (2001-2006 гг.): Черниговской (Носовская селекционно-опытная станция, чернозем выщелоченный), Винницкой (Институт кормов и сельского хозяйства Подолья НААН, серая лесная почва) и Сумской (Институт сельского хозяйства Северного Востока НААН, чернозем типичный) областях. Выделение ДНК. Для выделения препаратов суммарной клеточной ДНК штаммы клубеньковых бактерий сои культивировали на агаризованной среде TY (Beringer, 1974). Тотальная ДНК штаммов ризобий была выделена из свежих культур (экспоненциальная фаза роста) путём лизиса бактериальных клеток лизоцим-SDS с последующей фенол-хлороформной экстракцией и осаждением изопропанолом (Laguerre et al., 1992). RFLP анализ и секвенирование гена 16S рРНК. Амплификацию нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК для рестрикционного анализа осуществляли с вырожденными бактериальными праймерами fBD1/rBD1: 642f (5'-HAATHYGTGCCAGCAGC-3'), 1445r (5'- GTCRTCCYDCCTCCTC-3') (Коростик и др., 2006). Реакцию проводили на автоматическом амплификаторе HYBAID Omn-E в следующем режиме: начальная денатурация при 94 °C - 3 мин, 35 циклов, 94 °C - 30 с, 55 °C - 30 с, 72 °C - 1 мин, окончательная элонгация при 72 °С - 7 мин. Обработанную рестриктазой MspI («Fermentas», США) ДНК анализировали при помощи электрофореза в 4%-м агарозном геле. Матрицы для секвенирования генов 16S рРНК синтезировали с помощью ПЦР, используя универсальные для большинства эубактерий праймеры fD1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и rP2 (5'- ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3') (Weisburg et al., 1991). ПЦР проводили на амплификаторе GeneAmp PCR System 2720 в следующем режиме: начальная денатурация при 94 °C - 5 мин, 30 циклов, 94 °C - 30 с, 55 °C - 30 с, 72 °C - 30 с, окончательная элонгация при 72 °С - 7 мин. Амплифицированные фрагменты детектировались при помощи электрофореза в 1,5 % агарозном геле. Секвенирование осуществляли на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США). RFLP анализ и секвенирование межгенного спейсера 16S-23S рДНК (ITS). Амплификацию межгенного региона рибосомального кластера (ITS) для последующего рестрикционного анализа проводили с использованием праймеров FGPS1490-72: (5'- TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3') (Normand et al., 1996) и FGPL132-38 (5'-CCGGGTTTCCCCATT-3') (Ponsonnet, Nesme, 1994). Температурно-временной профиль амплификации: денатурация при 94 °С - 30 с, отжиг праймеров при 55 °С - 30 с, синтез комплементарной цепи при 72 °С - 1 мин (30 циклов). Рестрикционный анализ проводился с использованием эндонуклеазы рестрикции MspI согласно инструкциям производителя. Обработанную рестриктазой ДНК анализировали при помощи электрофореза в 4%-м агарозном геле. Секвенирование нуклеотидных последовательностей ITS проводили на секвенаторе Genetic Analyzer 3130xl («Applied Biosystems», США). Анализ нуклеотидных последовательностей. Сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (Altschul et al., 1990). Выравнивание последовательностей осуществляли с помощью программы CLUSTALW 1.75v. (Thompson et al., 1994), их проверку и редактирование проводили в редакторе «BioEdit 7.0.5.3» (Hall, 1999). Филогенетические деревья строили в программе Mega 3.1 (Kumar et al., 2004) с помощью алгоритма Neighbor-Joining NJ (Nei, Kumar, 2000). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Известно, что для молекулярной дифференциации штаммов микроорганизмов широко используется метод риботипирования, который базируется на объединении их в группы по признаку сходства последовательностей гена 16S рРНК. Для первичной молекулярной дифференциации штаммов клубеньковых бактерий сои с разной скоростью роста, выделенных из почв различных регионов Украины, использовали два варианта метода риботипирования: 1) ПЦР-RFLP - анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов 16S рРНК, 2) секвенирование гена 16S рРНК. В результате ПЦР с использованием праймеров 642f и 1445r нами были получены продукты амплификации размером ~800 п. н. С целью обнаружения полиморфизма ДНК у исследованных штаммов клубеньковых бактерий продукты амплификации обрабатывали ферментом - эндонуклеазой рестрикции MspI, которая «узнает» в молекуле ДНК нуклеотидную последовательность 5'-CСGG-3'. В результате расщепления продукта амплификации было выявлено, что, несмотря на высокую фенотипическую гетерогенность данных брадиризобий, по RFLP-профилю гена 16S рРНК штаммы оказались однородны (рис. 1). Анализ секвенированных последовательностей гена 16S рРНК показал 100 % сходство по этому маркеру штаммов с интенсивным ростом (Bradyrhizobium sp. КВ11, Bradyrhizobium sp. КС19, Bradyrhizobium sp. КС22) и штамма B. japonicum USDA 127 (AF208508). Наряду с этим медленнорастущие штаммы B. japonicum 46 и B. japonicum КН10 продемонстрировали 100 % сходство с типовым штаммом B. japonicum USDA 6T (AB231927), а штамм B. japonicum КС23-100 % сходство со штаммом B. japonicum USDA 4 (AF208515) (табл. 1). Нуклеотидный полиморфизм между референтными штаммами USDA 127, USDA 6 и USDA 4 обусловлен 4 нуклеотидными заменами. Для каждого вида клубеньковых бактерий рода Bradyrhizobium в базе данных NCBI были найдены последовательности гена 16S рРНК типовых штаммов, которые также были взяты для анализа. В качестве удаленных контролей были использованы ДНК-последовательности 16S рРНК типовых штаммов родов Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium и построено филогенетическое дерево (рис. 2). Для дифференциации штаммов ризобий сои с разной скоростью роста на внутривидовом уровне мы использовали рестрикционный анализ амплифицированной с использованием праймеров FGPS1490- 72 и FGPL132- 38 последовательности межгенного региона 16S-23S рРНК (ITS). Известно, что у клубеньковых бактерий рода Bradyrhizobium рибосомальный 16S-23S-5S рРНК оперон, в отличие от ризобий других родов, представлен в геноме только одной копией, что исключает вероятность получения продуктов амплификации разной длины и нуклеотидного состава, как например, в случае с бактериями рода Rhizobium (Зотов и др., 2012). Размер целевого фрагмента у всех исследованных штаммов клубеньковых бактерий сои составлял около 1000 п. н. После обработки межгенного спейсера рестриктазой MspI было показано разделение клубеньковых бактерий сои на две группы: к первой группе отнесены штаммы с интенсивным ростом, а во вторую группу объединены медленнорастущие штаммы, имевшие схожий паттерн с типовым штаммом B. japonicum USDA 6Т (рис. 3). Кроме того, нами была определена длина фрагментов рестрикции. Из данных таблицы 2 видно, что у штаммов клубеньковых бактерий сои с медленным и интенсивным ростом совпадают по размеру только два фрагмента - ~220 п. н. и ~150 п. н. Очевидно, у штаммов первой группы в амплифицируемом фрагменте присутствует дополнительный сайт узнавания MspI, отсутствующий у штаммов второй группы, что, вероятнее всего, вызвано единственной нуклеотидной заменой. Таким образом, при изучении структуры межгенного региона 16S-23S рРНК нам впервые удалось выявить два генотипа микросимбионтов сои в почвах Украины, что свидетельствует о генетическом полиморфизме данного региона у клубеньковых бактерий, отличающихся скоростью роста. К первому ITS-типу отнесены штаммы с интенсивным ростом Bradyrhizobium sp. КВ11, Bradyrhizobium sp. КС19, Bradyrhizobium sp. КС22, а ко второму ITS-типу отнесены медленнорастущие штаммы B. japonicum 46, B. japonicum КС23, B. japonicum КН10. Полученные результаты свидетельствуют о том, что данный генетический маркер может быть одним из критериев дифференциации представителей почвенных популяций микросимбионтов сои. Опираясь на полученные результаты, следующим этапом работы было определение нуклеотидных последовательностей межгенного региона 16S-23S рРНК исследуемых микросимбионтов сои, а также проведение их сравнительного анализа. В совокупности с нуклеотидными последовательностями типовых штаммов клубеньковых бактерий различных видов рода Bradyrhizobium из GenBank было построено филогенетическое дерево (рис. 4). Анализ ITS последовательностей исследованных медленнорастущих штаммов показал, что они формируют две достоверно различающихся группы (два кластера). Кластер I образовали штаммы B. japonicum 46, КН10 и типовой штамм B. japonicum USDA 6 Т (группа USDA 6), а кластер II включал штамм B. japonicum КС23 и штамм B. japonicum USDA 4 (группа USDA 4). В отличие от медленнорастущих микросимбионтов сои, штаммы с интенсивным ростом (Bradyrhizobium sp. КВ11, КС19, КС22) разного эколого-географического происхождения объединяются в один кластер и образуют обособленную филогенетическую группу штаммов. Особого внимания заслуживает тот факт, что секвенированные последовательности 16S-23S рДНК этих штаммов имеют высокий уровень сходства с аналогичными последовательностями штаммов B. japonicum USDA 127 (сходство 99,8 %) и B. japonicum USDA 123 (сходство 99,5 %) из GenBank, которые относятся к известной, по литературным данным, серогруппе 123. Отличительной особенностью этих штаммов является повышенная сапрофитная компетентность, то есть способность клубеньковых бактерий выживать в почве вне растения-хозяина. Факт доминирования этих штаммов в клубеньках впервые был установлен рядом исследователей в США в многочисленных полевых опытах на разных почвах. Так, при анализе более 600 клубеньков сои, произраставшей в 75 местах штата Айова, было установлено, что штаммы ризобий сои серогруппы 123 преобладали, образуя на корнях от 52 % до 97 % клубеньков (Ham et al., 1971). При изучении местных популяций ризобий сои в почвах Бразилии и Польши также показано доминирование бактерий серогруппы 123 (Godoy et al., 2008; Madrzak et al., 1995). Важно отметить, что в предыдущих исследованиях с интенсивнорастущими штаммами клубеньковых бактерий сои нами получены аналогичные результаты. С помощью серологического метода была проанализирована популяция ризобий, сформированная 8-10 лет назад при выращивании сои, инокулированной медленнорастущими штаммами и штаммами с интенсивным ростом. В ходе исследований обнаружено, что основная часть клубеньков на корнях культурной сои (60-73 % в среднем за последние три года) была образована интенсивнорастущими ризобиями серогруппы КВ11 (первый ITS-тип). Данный факт послужил доказательством их более высокой приживаемости в почве, по сравнению с медленнорастущими штаммами (Крутило, Волкова, 2012). Исходя из вышесказанного, а также согласно результатам секвенирования гена 16S рРНК и межгенного ITS-региона, интенсивнорастущие штаммы - микросимбионты сои разного эколого-географического происхождения, оказались близки ризобиям группы USDA 123 (сходство 100 % по гену 16S рРНК и 99,5-99,8 % по межгенному ITS-региону) и, следовательно, могут быть отнесены к виду B. japonicum. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, нами впервые проведена оценка генотипических свойств микросимбионтов сои с медленным и интенсивным ростом, распространённых в почвах Украины. На основании фенотипического и генотипического (16S рРНК и 16S-23S рРНК) сходства медленнорастущих штаммов клубеньковых бактерий сои с типовым штаммом B. japonicum USDA 6T подтверждена их принадлежность к виду B. japonicum. Поскольку штаммы с интенсивным ростом по последовательности гена 16S рРНК на 99,7 % сходны с типовым штаммом, а по последовательности межгенного ITS-региона наиболее близки к штамму B. japonicum USDA 127 (сходство 99,8 %) широко известной серогруппы 123, это позволило сделать вывод о принадлежности интенсивнорастущих штаммов также к виду B. japonicum. Основываясь на результатах рестрикционного анализа межгенного региона, исследованные ризобии сои были разделены на два ITS-типа, которые соответствуют распределению штаммов на физиологические группы. Согласно результатам секвенирования нуклеотидных последовательностей ITS ризобии сои с разной скоростью роста образуют 3 достоверно различающихся кластера, два из которых включают медленнорастущие штаммы (группа USDA 6 и USDA 4), а третий формируют интенсивнорастущие микросимбионты сои (группа USDA 123). Полученные нами данные, относительно генетического разнообразия микросимбионтов сои в почвах Украины, согласуются с результатами исследователей других стран, которые также указывают на существование разных ITS- типов клубеньковых бактерий сои в почвах с различной интенсивностью выращивания культурной сои (Madrzak et al., 1995; Saeki et al., 2007; Jaiswal et al., 2012). Следует отметить, что большинство работ по оценке разнообразия и структуры популяций клубеньковых бактерий сои проводились с использованием штаммов, выделенных из местных многочисленных популяций ризобий, которые сформировались в регионах интенсивного выращивания сои (van Berkum and Fuhrmann, 2000; Appunu et al., 2008; Jaiswal et al., 2012). Значительно меньше внимания уделялось изучению биоразнообразия ризобий сои в относительно молодых популяциях, которые формируются в почвах, не содержащих местных специфических бактерий. Вместе с тем обнаружение и часто доминирование клубеньковых бактерий сои группы USDA 123 в почвах стран как традиционного выращивания сои (Китай, Индия, Япония), так и стран, где соя является относительно новой культурой (Украина, Польша), является весьма интересным фактом, требующим особого внимания (Madrzak et al., 1995; Saeki et al., 2007; Jaiswal et al., 2012; Крутило, Волкова, 2012). Вполне вероятно, что в ходе коэволюции симбиотических партнеров некоторые генотипы клубеньковых бактерий могли приобрести способность к повышенному выживанию в почве и преимущественному инфицированию растения-хозяина. Особый интерес представляет вопрос о распространении штаммов с интенсивным ростом (группы USDA 123) в почвах Украины, учитывая то, что на момент выделения данных штаммов в качестве инокулянтов использовалось ограниченное количество биопрепаратов, биоагентами которых были медленнорастущие клубеньковые бактерии сои (Ризоторфин). Даже если предположить, что в определенном регионе страны интенсивнорастущие штаммы были интродуцированы в почву, остается открытым вопрос о распространении этих штаммов в другие регионы. Полученные результаты демонстрируют необходимость дальнейшего детального анализа популяций клубеньковых бактерий сои в агроценозах культурной сои с привлечением новых методов. Изучение ризобий сои с интенсивным ростом позволит расширить наши знания о формировании биоразнообразия и природного потенциала местных популяций микросимбионтов относительно новой для Украины культуры - сои. БЛАГОДАРНОСТИ Коллектив авторов выражает искреннюю благодарность руководителю отделения геномных технологий Центра коллективного пользования научным оборудованием «Геномные технологии и клеточная биология» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии, к. б. н., Андронову Евгению Евгеньевичу за помощь в проведении рестрикционного анализа, обсуждение полученных результатов и ценные советы.

About the authors

Dmitriy Valeriyevich Krutylo

Institute of Agricultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture, National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine

Email: krutilod@mail.ru
Ph.D., senior research scientist, Laboratory of plant-microbial interactions

Vasiliy Sergeyevich Zotov

A. N. Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences

Email: adni83@yandex.ru
junior research scientist, Laboratory of biochemistry of nitrogen fixation and nitrogen metabolism

References

Supplementary files