Reducing of LXRβ and PPARγ mRNA in M-CSF stimulated macrophages in patients with levels atherosclerosis

Cover Page

Abstract


Nuclear receptors LXRα/β and PPARγ play an important role in lipid metabolism and reverse cholesterol transport. However, the influence of LXRα/β and PPARγ mRNA levels in macrophages on atherosclerosis remains unexplored. Using real time PCR, we determined LXRα mRNA, LXRβ mRNA and PPARγ mRNA levels in macrophages cultured for 5 days with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). Levels of LXRβ mRNA and PPARγ mRNA in patients with arterial stenosis were reduced when compared with the control group, p < 0.001. LXRa gene mRNA level in macrophages was not changed in the study groups, (p = 0.17). Thus, our study shows that the LXRβ and PPARγ genes expression levels in macrophages may be significant factors associated with the development of atherosclerosis.

Принятые сокращения: ОТХ - обратный транспорт холестерина, LXR - печеночный Х рецептор, M-CSF - колониестимулирующий фактор макрофагов, PPAR - рецептор активации пролиферации пероксисом. ВВЕДЕНИЕ В понимании механизмов развития атеросклероза важное значение имеют печеночные Х рецепторы (LXR), LXRα и LXRβ относящиеся к семейству ядерных рецепторов, которые регулируют гомеостаз и обратный транспорт холестерина (ОТХ), усиливают экспрессию аполипопротеина Е и транспортеров ABCA1 и ABCG1 (Bensinger et al., 2008; Oosterveer et al., 2010). Значительный интерес в атерогенезе представляет и рецептор активации пролиферации пероксисом (PPAR) γ, который также относится к семейству ядерных рецепторов и играет ключевую роль в регуляции энергообмена и липидного обмена (Wahli et al., 2012). Было показано, что PPARγ экспрессируется в макрофагах и в пенистых клетках в местах атеросклеротических поражений (Apostoli et al., 2012), и его экспрессия может критически влиять на функции макрофагов, включая их активацию, продукцию цитокинов и их преобразование в пенистые клетки, что, в свою очередь, влияет на развитие атеросклероза. Таким образом, можно предположить, что изменение уровня экспрессии ядерных рецепторов LXRα, LXRβ и PPARγ может оказывать влияние на эффективность ОТХ и, как следствие, на предрасположенность к развитию атеросклероза у человека. Цель данной работы заключалась в оценке уровня мРНК генов LXRα, LXRβ и PPARγ в макрофагах у пациентов с атеросклерозом и у лиц без сердечно-сосудистой патологии. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Проведение данной работы одобрено этическим комитетом Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова. Группу пациентов составили 11 человек с атеросклерозом, подтвержденным при ангиографическом исследовании. Ангиографическая диагностика атеросклероза проводилась на кафедре госпитальной хирургии № 2 ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. Группа больных была гетерогенной по степени локального (% окклюзии артерии атерогенной бляшкой) и диффузного (общее количество артерий, пораженных атеросклерозом) атеросклероза. Однако у всех больных, в как минимум, в одной артерии коронарного бассейна выявлен стеноз более 50 %. Пациенты, вошедшие в выборку, не принимали ни статинов, ни каких-либо иных гиполипидемических средств. Контрольная группа состояла из 11 человек без сердечно-сосудистых заболеваний в анамнезе. Группа соответствовала группе пациентов по полу и возрасту. Характеристики исследованных групп представлены в таблице 1. При постановке диагноза у всех пациентов и представителей контрольной группы измеряли энзиматическим колориметрическим методом с использованием наборов ByoSystems (Испания) концентрацию общего холестерина и холестерина в составе липопротеинов высокой плотности в плазме крови. Для получения макрофагов свежесобранную кровь смешивали в равном соотношении с фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Смесь наслаивали на фиколл-верографин, центрифугировали (1500 об/мин, 30 мин), мононуклеары промывали в PBS, центрифугировали (1500 об/мин, 15 мин). Затем клетки ресуспендировали в культуральной среде (альфаMEM, 10 % эмбриональная сыворотка, 5 мкг/мл антибиотиков (пенициллин G, стрептомицин), 15 нг/мл M-CSF) и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 2 ч. После чего прикрепившиеся к чашкам Петри моноциты культивировали в присутствии фактора макрофагов M-CSF 15 нг/мл (R&D Systems, США) в течение 5 суток с ежедневной заменой питательной среды. Клетки отмывали в PBS, центрифугировали, хранили при температуре -86 ºС. Для выделения тотальной мРНК и проведения реакции обратной транскрипции были использованы наборы RNeasy Minikit (Qiagen, Германия) и cDNA synthesis kit (Fermentas, Литва). Чистоту РНК оценивали по отношению поглощения при длинах волн 260 и 280 нм (критерий чистоты 1.8). Уровень мРНК генов LXRα, LXRß, PPARγ определяли методом ПЦР в реальном времени на приборе CFX96 (BioRad, США). Последовательности праймеров и зондов, использованные в данной работе (Бигль, Санкт-Петербург), представлены в таблице 2. После денатурации при 95 ºС в течение 10 мин проводили 45 циклов амплификации в следующем температурно-временном режиме: плавление 95 ºС - 30 с, отжиг-синтез 60 ºС - 30 с. Измерения для каждой пробы повторяли в трех экземплярах. Относительное содержание мРНК LXRa, мРНК LXRß, мРНК PPARγ рассчитывали методом стандартных кривых. Количество мРНК LXRa, мРНК LXRß, мРНК PPARγ нормировали по отношению к мРНК эндогенного гена ACTB, т. е. делили количество мРНК LXRa, мРНК LXRß, мРНК PPARγ, рассчитанное с использованием CFX96 (BioRad, США), на количество мРНК ACTB с последующим усреднением данных, расчетом отклонений и вычислением погрешности. Статистическую обработку данных провели при помощи пакета программ Statistica 6.0. Показатели, полученные в различных группах, сравнивали с помощью непараметрического метода U-теста Манна-Уитни (p < 0,05 принимали за значимый уровень достоверности). Для анализа корреляции между количественными характеристиками использовался метод корреляции по Спирмену (Zar J. H. (1998) Biostatistical Analysis). РЕЗУЛЬТАТЫ Наши эксперименты продемонстрировали достоверное снижение содержания мРНК LXRß (p < 0,001) и мРНК PPARγ (p < 0,001) в макрофагах, стимулированных колониестимулирующим фактором М-CSF, после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой (рис. 1-2). Уровень мРНК LXRa в макрофагах в исследуемых группах не отличался (p = 0,17) (рис. 3). Корреляции уровня экспрессии генов LXRa, LXRß, PPARγ с показателями липидного спектра крови и со степенью атеросклеротических повреждений не выявлено (данные не приведены). ОБСУЖДЕНИЕ Изучение молекулярных механизмов атеросклероза артерий и возможности его коррекции в настоящее время приобрели особую значимость в связи с ростом заболевания практически во всех исследуемых популяциях. При этом особое внимание в исследованиях уделяется макрофагам артериальной стенки, представляющих собой основной тип клеток, участвующих в метаболизме липидов при атеросклерозе (Rader et al., 2005). ОТХ является основным процессом в снижении содержания холестерина в макрофагах и регресса атеросклеротической бляшки (Meurs et al., 2010). Несмотря на наличие большого количества информации о роли LXRα, LXRβ и PPARγ как противовоспалительных и антиатерогенных медиаторах, в настоящее время практически нет данных о роли экспрессии данных генов в развитии атеросклероза. Именно определение уровня экспрессии этих транскрипционных факторов в макрофагах, стимулированных колониестимулирующим фактором М-CSF, предпринято в настоящем исследовании. Наше исследование продемонстрировало отсутствие корреляции уровня экспрессии генов LXRa, LXRß, PPARγ с показателями липидного спектра крови. Логично предположить, что только уровень мРНК генов ядерных рецепторов не определяет концентрацию липидов плазмы крови. Полученные данные свидетельствуют, что в липидный обмен вовлечены многие факторы, и нет прямой связи между показателями липидного спектра крови с уровнем транскрипционных факторов. Было показано статистически значимое снижение содержания PPARγ мРНК в макрофагах после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой. Полученные пилотные данные могут свидетельствовать о том, что уменьшение уровня PPARγ мРНК может быть ассоциировано с развитием атеросклероза. В литературе существуют значительные противоречия относительно роли PPARγ в развитии атеросклероза. Наши данные согласуются с результатами, в которых было отмечено снижение уровня экспрессии PPARγ в атеросклеротических бляшках (Soumian et al., 2005) и в макрофагах, коррелировавшее с прогрессией атеросклероза (Giaginis et al., 2011). С другой стороны, было показано значительное повышение содержания PPARγ в макрофагах человека при атеросклерозе (Amoruso et al., 2009). В работе Sueyoshi и др. (Sueyoshi et al., 2010) также было показано, что уровень PPARγ мРНК в атероматозных бляшках был достоверно выше, чем содержание PPARγ мРНК в интиме сосуда. Эти данные дают возможность предположить, что экспрессия PPARγ может быть связана с формированием атеросклеротических бляшек и PPARγ участвует в ранних стадиях развития атеросклероза у человека. LXR играют ключевую роль в патогенезе атеросклероза, регулируя экспрессию важных генов, вовлеченных в липидный гомеостаз и воспалительную реакцию в макрофагах (Bensinger et al., 2008; Oosterveer et al., 2010). Более того установлено, что LXR-ингибируют атеросклероз in vitro и in vivo (Calkin et al., 2012). При этом было продемонстрировано, что LXR агонисты увеличивают ОТХ за счет усиления экспрессии транспортеров ABCA1 и ABCG1 в макрофагах, что является основным моментом механизма LXR-зависимой защиты от атеросклероза (Calkin et al., 2012). В нашем исследовании установлено сниженное содержания LXRβ мРНК в макрофагах после 5 суток культивирования у пациентов с атеросклерозом по сравнению с контрольной группой, в то время как в содержании LXRα мРНК разница не показана. Таким образом, наше пилотное исследование показало, что уровни экспрессии генов LXRß и PPARγ в макрофагах могут быть значимыми факторами, ассоциированными с развитием атеросклероза.

Yekaterina Petrovna Demina

B. P. Konstantinov Nuclear Physics Institute in Saint-Petersburg

Email: citritt@gmail.com
Molecular and Radiation Biophysics Department

Valentina Vadimovna Miroshnikova

B. P. Konstantinov Nuclear Physics Institute in Saint-Petersburg

Email: mutantropol@mail.ru
Molecular and Radiation Biophysics Department

Nikolay Vladimirovich Mayorov

Pavlov First Saint-Petersburg State Medical University

Email: nikolaj-majorov@yandex.ru
Hospital Surgery Department N 2

Vladimir Valentinovich Davydenko

Pavlov First Saint-Petersburg State Medical University

Email: kuzet@mail.ru
Hospital Surgery Department N 2

Alexander L`vovich Schwarzman

B. P. Konstantinov Nuclear Physics Institute in Saint-Petersburg

Email: aschwart1@yandex.ru
Molecular and Radiation Biophysics Department

  1. Amoruso A., Bardelli C., Fresu L. G. et al. (2009) Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Expression in Monocyte/Macrophages from Coronary Artery Disease Patients and Possible Gender Differences. J. Pharmacol. Exp Ther. V. 331 (2): P. 531-538.
  2. Apostoli A. J., Nicol C. J. (2012) PPAR Medicines and Human Disease: The ABCs of It All. PPAR Res. 2012:504918.
  3. Bensinger S. J., Tontonoz P. (2008) Integration of metabolism and inflammation by lipid-activated nuclear receptors. Nature. V. 454: P. 470-477.
  4. Calkin A. C., Tontonoz P. (2012) Transcriptional integration of metabolism by the nuclear sterol-activated receptors LXR and FXR. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. V. 13 (4): P. 213-24.
  5. Giaginis C., Klonaris C., Katsargyris A. et al. (2011) Correlation of Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-gamma (PPAR-gamma) and Retinoid X Receptor-alpha (RXR-alpha) expression with clinical risk factors in patients with advanced carotid atherosclerosis. Med. Sci. Monit. V. 17 (7): P. 381-391.
  6. Li A. C., Binder C. J., Gutierrez A. et al. (2004) Differential inhibition of macrophage foam-cell formation and atherosclerosis in mice by PPARalpha, beta/delta, and gamma. J Clin. Invest. V. 114 (11): P. 1564-1576.
  7. Meurs I., Van Eck M., Van Berkel T. J. (2010) High-density lipoprotein: key molecule in cholesterol efflux and the prevention of atherosclerosis. Curr. Pharm. Des. V. 16: P. 1445-1467.
  8. Oosterveer M. H., Grefhorst A., Groen A. K. et al. (2010) The liver X receptor: control of cellular lipid homeostasis and beyond: implications for drug design. Prog. Lipid. Res. V. 49: P. 343-352.
  9. Rader D. J., Pure E. (2005) Lipoproteins, macrophage function, and atherosclerosis: beyond the foam cell? Cell metabolism. V. 1: P. 223-230.
  10. Soumian S., Gibbs R., Davies A. et al. (2005) mRNA expression of genes involved in lipid efflux and matrix degradation in occlusive and ectatic atherosclerotic disease. J. Clin. Pathol. V. 58: P. 1255-1260.
  11. Sueyoshi S., Mitsumata M., Kusumi Y. et al. (2010) Increased expression of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha and PPAR-gamma in human atherosclerosis. Pathol. Res. Pract. V. 206 (7): P. 429-438.
  12. Wahli W., Michalik L. (2012) PPARs at the crossroads of lipid signaling and inflammation. Trends Endocrinol. Metab. V. 23 (7): P. 351-363.
  13. Zar J. H. (1998) Biostatistical Analysis. 4th edition. Prentice Hall.

Views

Abstract - 308

PDF (Russian) - 224

Cited-By


PlumX


Copyright (c) 2014 Demina Y.P., Miroshnikova V.V., Mayorov N.V., Davydenko V.V., Schwarzman A.L.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies