Cytokine gene polymorphisms and early pregnancy loss

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Проблема нарушений репродуктивной функции человека остается одной из наиболее актуальных в современной биологии и медицине. Невынашивание беременности как многофакторное состояние является результатом аддитивного действия многих факторов, как средовых, так и генетических. Суммарные репродуктивные потери у человека составляют до 50 % по отношению к числу зачатий (Алипов, Головачев, 1983). Случаи спонтанного прерывания беременности в первом триместре составляют 15-20 % от общего числа зарегистрированных беременностей (Доброхотова и др., 2010). К иммунным факторам, ассоциированным с потерей беременности, относят аллоиммунные реакции, направленные против клеток и тканей плода. Иммунологические нарушения могут быть обусловлены особенностями генотипа, в том числе и по генам цитокинов, которые являются эндогенными медиаторами межклеточных взаимодействий. Цитокины выступают посредниками межклеточных и межсистемных взаимодействий, вызывая каскадные реакции, индуцирующие активность многих генов; регулируют выживаемость клеток, стимулируют или подавляют их рост, дифференцировку, функциональную активность и апоптоз. За счет действия цитокинов обеспечивается согласованное функционирование систем и органов организма. Цитокины участвуют в формировании и регуляции защитных реакций организма при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей. При развитии системного воспаления цитокины проявляют огромный спектр биологической активности и оказывают влияние на работу всех систем организма (Кетлинский, Симбирцев, 2008). Риск потери плода может быть обусловлен изменением функциональной активности цитокинов, играющих важную роль в процессе развития беременности и опосредующих иммунный ответ материнского организма на развивающийся плод (Симбирцев, 2004; Bombell, McGuire, 2008; Kaur, 2011; Agrawal et al., 2012). Согласно современным представлениям, этапы созревания яйцеклетки, адгезии и имплантации бластоцисты, формирования и роста плаценты являются цитокин-зависимыми процессами и контролируются иммунной системой. При нормально протекающей беременности иммунотолерантность материнского организма к зародышу как аллотрансплантанту обеспечивается сложным взаимодействием регуляторных молекул, синтезируемых клетками матери и плода. При инвазии трофобласта происходит активация клеток иммунной системы, что приводит к синтезу целого спектра цитокинов. На мышах Mus musculus линии BALB/c INFγ-/- показано, что продукция Th1 клетками типичных провоспалительных цитокинов необходима для нормального протекания ранних этапов эмбриогенеза и имплантации (Ashkar, Croy, 2001). IL-1ß, являясь типичным провоспалительным цитокином, активирует экспрессию субъединицы интегрина β3, обеспечивающей процессы адгезии; способствует развитию плода, стимулирует пролиферацию клеток, образующих плацентарный барьер. Кроме того, IL-1β активирует экспрессию цитокинов семейства IL-6 в эндометрии, что также способствует имплантации (Чистякова и др., 2005; Dimitriadis et al., 2005; Левкович, 2008; Fitzgerald et al., 2008). IL-6 является типичным ранним индуцибельным цитокином. Цитокины семейства IL-6 регулируют экспрессию генов контроля клеточного цикла и компонентов внеклеточного матрикса, увеличивают адгезию эпителиальных клеток эндометрия к коллагену на поверхности бластоцисты; увеличивают экспрессию эпителиальными клетками эндометрия интегринов (Marwood et al., 2009). Одним из ключевых регуляторов иммунного ответа является семейство цитокина IL-10, который ингибирует секрецию провоспалительных цитокинов лимфоцитами и активированными макрофагами. Уровень данного цитокина постепенно возрастает в первом триместре беременности, индуцируя снижение уровня провоспалительных цитокинов и активируя процессы ангиогенеза (Thaxton, Sharma, 2010). Помимо адгезии и имплантации цитокины обеспечивают образование и рост новых кровеносных сосудов. Усиленный выброс цитокинов оказывает активирующее воздействие на эндотелий сосудов, который, в свою очередь, продуцирует ряд факторов роста, необходимых для ангиогенеза (Амчиславский и др., 2003). Активированные эндотелиоциты сами становятся продуцентами провоспалительных цитокинов, что может приводить к нарушению таких эндотелий-зависимых механизмов, как регуляция сосудистого тонуса и сосудистой проницаемости, поддержание баланса между тромбогенным потенциалом сосудистой стенки и ее тромборезистентностью. В результате может нарушаться микроциркуляция, что оказывает негативное влияние на развивающийся эмбрион. Высокое содержание провоспалительных цитокинов приводит к активации процессов тромбообразования в структуре фетоплацентарных тканей; прекращается кровоток в сосудах, питающих развивающийся эмбрион. Это является одной из причин спонтанного аборта. При спонтанном аборте (СА) иммунные события протекают с многократным увеличением уровня маркеров воспаления. Неразвивающаяся беременность (НБ) как несостоявшийся аборт характеризуется угнетением клеточного иммунитета, иммунологической ареактивностью матки, что препятствует отторжению плодного яйца (Доброхотова и др., 2010). Дисрегуляция в функционировании цитокинов, в том числе обусловленная генотипом, может быть негативным фактором для протекания ранних этапов эмбриогенеза человека (Daher et al., 2012). Целью данной работы было исследовать частоту регистрации аллельных вариантов генов цитокинов среди женщин с неразвивающейся беременностью и спонтанным абортом в первом триместре беременности. Материал и методы Для молекулярно-генетического исследования использовали образцы ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови 122 женщин с невынашиванием беременности в первом триместре (средний возраст 29,2 лет). Среди них - 62 женщины с неразвивающейся беременностью и 60 женщин со спонтанным абортом. В контрольную группу вошли 114 женщин (средний возраст 30,3 года) с физиологически протекающей беременностью, у которых в анамнезе отсутствовали спонтанный аборт и/или неразвивающаяся беременность. Все женщины подписали информированное согласие об участии в исследовании. Забор образцов крови, сбор анамнестических данных и формирование исследуемых групп женщин был проведен сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии Ростовского государственного медицинского университета, а также врачами акушерами гинекологами городской больницы № 8 и родильного дома № 5 г. Ростова-на-Дону. Диагноз «неразвивающаяся беременность» был определен на основании динамики уровня хорионического гормона человека в периферической крови женщины и прекращения сердцебиения плода, выявленного при УЗИ. Критериями исключения из исследования были ранее диагностированные артериальная гипертензия, диабет, заболевания щитовидной железы и аутоиммунная патология, а также инфекционные заболевания во время беременности. Кроме того, были исключены женщины с аномалиями матки и синдромом поликистозных яичников (диагностированные трансвагинальной ультрасонографией). В сравниваемых группах отсутствовали женщины с экзогенными факторами риска - злоупотребление алкоголем, контакт с вредными факторами производства (электромагнитное излучение, шум, вибрация, химическое производство). Для сравнительного анализа трех групп женщин определяли доверительный интервал доли (Гланц, 1999). Установлено, что в группе НБ наибольшая доля женщин, не имеющих родов в анамнезе (табл. 1). В то же время число женщин, беременность у которых закончилась рождением живого ребенка, в данной группе меньше по сравнению с двумя другими. Для выделения ДНК использовали набор реагентов DIAtom™ DNA Prep 100 (ООО Центр молекулярной генетики). Аллельные варианты -31 С-Т гена IL-1β (MIM *147720), -174G-C гена IL-6 (MIM *147620), -592 С-A, -819C-T гена IL-10 (MIM *124092), -308G-A гена TNFα (MIM *191160) исследовали с использованием наборов реагентов SNP-экспресс (Литех, Москва). Анализ основан на проведении реакций амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Разделение продуктов амплификации проводили методом горизонтального электрофореза в 3%-м агарозном геле. Анализ электрофореграмм проводили на трансиллюминаторе GelDoc (BioRad). Соответствие распределения частот генотипов равновесию Харди-Вайнберга определяли с использованием Hardy-Weinberg equilibrium calculator в программе www.oege.org/software/Hardy-Weinberg (Rodriguez et al., 2009). Оценку различий в распределении аллельных вариантов генов в обследованных группах осуществляли по критерию χ2 при помощи программы BIOSTAT (Biostatistica…, 1998). О риске развития невынашивания беременности судили по отношению шансов (odds ratio - OR), которое вычисляли в соответствии с OR = (А/B) × (D/C), где А и С - число имеющих «мутантный» генотип женщин с невынашиванием беременности и нормальной беременностью соответственно, В и D - число не имеющих «мутантный» генотип женщин двух групп. OR указан с 95% -м доверительным интервалом (CI) (Petrie et al., 2003). Результаты ИССЛЕДОВАНИЯ В результате исследования установлено, что в контрольной группе гомозиготами по аллели -31C гена IL-1β являлись 36,8 % женщин, гетерозиготы -31 С-Т составили 49,1 % (табл. 2). Распределение частот генотипов по исследуемому полиморфизму среди женщин с неразвивающейся беременностью не отличалось от контрольной группы. Среди женщин со спонтанным абортом преобладали (53,3 %) гомозиготы по аллели -31 С гена IL-1β. Однако данные отличия по сравнению с контрольной группой статистически не значимы. В то же время выявлены статистически значимые отличия в частотах генотипов по полиморфизму -31 С-Т гена IL-1β между двумя группами женщин с патологией беременности в I триместре. Частота аллели -31 Т гена IL-1β в группе НБ оказалась выше по сравнению с таковой в группе женщин со спонтанным абортом (0,419 и 0,283 соответственно) (табл. 2). Характер распределения частот генотипов по полиморфизму -174G-C гена IL-6 среди женщин со спонтанным абортом или неразвивающейся беременностью соответствовал контрольному (табл. 2). Не выявлено статистически значимых различий в частотах генотипов и аллелей и между двумя группами женщин с патологией ранних сроков беременности. В результате исследования установлено, что в контрольной группе гомозиготами по аллели -592 С гена IL-10 являлись 57 % женщин (табл. 3). В группе женщин со спонтанным абортом число гомозигот -592 СС гена IL-10 составило 40 %, а доля гетерозигот по полиморфизму -592 С-Т повышена по сравнению с контролем (56,7 %) (табл. 3). Данные различия статистически значимы. Для гетерозигот -592 С-Т гена IL-10 выявлено повышение риска возможного развития спонтанного аборта (OR = 2,72). Статистически значимые отличия обнаружены и между двумя группами женщин с нарушением ранних сроков эмбрионального развития плода. Среди женщин со СА увеличена частота гетерозигот по данному полиморфизму по сравнению с группой женщин с неразвивающейся беременностью (табл. 3). Подобная ситуация характерна и для полиморфизма -819 С-Т гена IL-10 (табл. 3). В контрольной группе и среди женщин с неразвивающейся беременностью преобладали гомозиготы по аллели -819 С гена IL-10. Число гетерозигот -819 С-Т гена IL-10 в двух данных группах женщин не превышало 32 %. В то же время среди женщин со спонтанным абортом число гомозигот -819 СС и гетерозигот -819 СТ по гену IL-10 было практически одинаково и составило 43-46 %. Распределение частот генотипов при этом статистически значимо не отличалось от такового в контрольной группе. Однако частота аллели -819 Т гена IL-10 среди женщин со спонтанным абортом в первом триместре составила 0,333, что статистически значимо выше по сравнению с таковым показателем в группе контроля. Между двумя группами женщин с патологией беременности первого триместра выявлены значимые различия: при одинаковом числе гомозигот -819 ТТ гена IL-10 среди женщин с неразвивающейся беременностью частота гетерозигот -819 СТ составила 24,2 %, тогда как в группе женщин со СА - 46,7 % (табл. 3). В контрольной группе и группе женщин с неразвивающейся беременностью гомозигот по аллели -308G гена TNFα несколько меньше (63,2 % и 58,1 % соответственно), чем в группе женщин с СА - 81,7 % (табл. 3). Гетерозиготы -308G-A гена TNFα реже всего встречались среди женщин со спонтанным абортом. Интересно отметить, что число гомозигот по полиморфизму -308 А в двух группах (контрольной и в группе женщин с НБ) было примерно одинаково, а в группе женщин с СА они отсутствовали (табл. 3). Распределение частот генотипов по исследуемому полиморфизму среди женщин с НБ не отличалось от контрольной группы. Однако в группе СА выявлено увеличение числа гомозигот по аллели -308G при одновременном снижении доли гетерозигот -308GА по сравнению с контрольной группой. Также выявлены статистически значимые отличия между двумя группами женщин с патологией беременности в I триместре (НБ и СА). В группе женщин с самопроизвольным абортом частота аллели -308A составила 0,092, что является наименьшим значением для трех групп. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Причины ранних эмбриональных потерь многочисленны и разнообразны. Аномалии кариотипа плода выявляются в большинстве случаев остановки развития как при естественно наступивших беременностях, так и в случае вспомогательных репродуктивных технологий (Simon et al., 1998; Liunger et al., 2005; Кириллова и др., 2006; Баранов, Кузнецова, 2007; Morales et al., 2008; Чиряева и др., 2012). Существенный вклад в патогенез ранних эмбриональных потерь вносят иммунные и аутоиммунные факторы. Если в общепопуляционных выборках антитела к фосфолипидам выявляются у 2 % женщин, то среди женщин с привычным невынашиванием беременности данный показатель значительно выше (Rai et al., 1995; Керчелаева, 2003). Антифосфолипидный синдром сопровождается тромбофилическими осложнениями, которые наблюдаются и при наследственных формах тромбофилии (Younis et al., 2000; Макацария, Бицадзе, 2001). Среди эндокринных причин невынашивания беременности рассматривают изменение уровня секреции гонадотропинов, нарушение функционирования их рецепторов, гиперпролактинемию, гиперандрогению, заболевания щитовидной железы (Li et al., 2000; Bellver et al., 2008; Prakash et al., 2006; 2008). Обсуждается роль инфекционных агентов в невынашивании беременности (Summers, 1994; Ralph et al., 1999; Подзолкова и др., 2003). Исследуемые нами группы включали женщин без аутоиммунных, эндокринных и инфекционных заболеваний. Однако анализ кариотипа погибших эмбрионов проведен не был. Практически все из перечисленных этиологических факторов невынашивания беременности оказывают влияние на морфологические и функциональные свойства формирующейся плаценты, уровень пролиферации и апоптоза клеток (Qumsiyeh et al., 2000). Обязательным компонентом процессов имплантации и формирования плаценты являются межклеточные взаимодействия с участием нескольких семейств цитокинов. Особенности генотипа по генам цитокинов могут обусловливать повышенную продукцию провоспалительных цитокинов или нарушение баланса между уровнем про- и противовоспалительных цитокинов, что может стать одной из причин нарушения ранних этапов эмбрионального развития человека. Исследуемые нами аллельные варианты генов IL-1β и TNFα характеризуются повышенным уровнем экспрессии, в то время как аллельные варианты генов IL-6 и IL-10 обусловливают снижение уровня соответствующих мРНК (Huizinga et al., 1997; Grimaldi et al., 2000; Bennermo et al., 2004). Данные литературы о возможной связи между наличием исследуемых аллельных вариантов генов цитокинов и риском нарушения ранних этапов эмбриогенеза человека противоречивы (Hefler et al., 2001; Wang et al., 2002; Prigoshin et al., 2004; Costeas et al., 2004; Kamali-Sarvestani et al., 2005; Bombell, McGuire, 2008; Zammiti et al., 2009; Liu et al., 2010; Kaur, 2011; Agrawal et al., 2012; Ma et al., 2012). В нашем исследовании показано, что группы женщин с неразвивающейся беременностью и спонтанным абортом отличаются друг от друга особенностями генотипа по генам цитокинов. Так, среди женщин с неразвивающейся беременностью статистически значимо выше частота аллели -31 Т гена IL-1β по сравнению с группой женщин со спонтанным абортом. В то же время установлено, что гетерозиготы -592 СА гена IL-10 имеют повышенный риск спонтанного прерывания беременности. Известно, что IL-10 принимает активное участие в обеспечении иммунотолерантности материнского организма к развивающемуся зародышу. Кроме того, IL-10 обеспечивает снижение уровня экспрессии децидуальными клетками ряда молекул - активаторов коагуляции (Cochery-Nouvellon et al., 2009). Наличие в генотипе аллелей -31 Т гена IL-1β или -592 А гена IL-10 предполагает повышение уровня провоспалительных цитокинов в тканях-мишенях. Провоспалительные цитокины синтезируются на ранних сроках беременности в незначительном количестве, обеспечивая динамическое равновесие между процессами инвазии и отторжения трофобласта. Однако продукция провоспалительных цитокинов выше оптимального уровня может приводить к тромбозам и ишемическим некрозам в структуре фетоплацентарных тканей. Провоспалительные цитокины способны оказывать прямой эмбриотоксический эффект, ограничивать инвазию трофобласта, нарушая его нормальное формирование, что приводит к задержке или остановке внутриутробного развития. Например, сверхпродукция IL-1β может индуцировать сверхострый воспалительный ответ и при присоединении внутриматочной инфекции, в конечном итоге привести к отторжению эмбриона (Громова, Симбирцев, 2005). Имплантация эмбриона в течение физиологической беременности ассоциирована со сдвигом цитокинового баланса в сторону преобладания факторов с иммуносупрессорной активностью. В течение беременности в зоне матки угнетается продукция цитокинов Th1 при одновременном усилении синтеза Th2 цитокинов. Нарушение баланса Th1/Th2 является одной из причин развития патологии беременности. С другой стороны показано, что при остановке развития эмбриона концентрация и соотношение про- и противовоспалительных цитокинов (в частности, TNFα и IL-10) в периферической крови женщин и в ворсинах хориона зависит от кариотипа абортуса (Calleja-Agius et al., 2012). Авторы высказывают мнение о существовании различных механизмов элиминации эмбрионов с нормальным и аномальным кариотипом. Потеря беременности при нормальном кариотипе эмбриона, по мнению авторов, связана с системными воспалительными процессами в организме матери. В то время как при аномальном кариотипе абортуса имеют значение местные (в зоне плаценты) реакции. Роль цитокинов в этом несомненна. Выявленные нами отличия в частотах генотипов и аллелей по генам цитокинов между группами женщин СА и НБ предполагают изменение различных звеньев цитокиновой системы. Первичным звеном в нарушении баланса цитокинов может выступать обусловленное генотипом повышение уровня экспрессии провоспалителтьных цитокинов (в частности IL-1β). Последующие нарушения функционирования плаценты могут приводить к остановке развития эмбриона и, как следствие, неразвивающейся беременности. Если же в качестве первичного нарушения цитокинового баланса выступает снижение концентрации противовоспалительных цитокинов (в частности IL-10), то возможно отторжение эмбриона как генетически чужеродного для материнского организма.

About the authors

Yelena Vladimirovna Mashkina

Southern federal university

Email: lenmash@mail.ru
candidate of biology science, associate professor

Konstantin Alekseyevich Kovalenko

Southern federal university

Email: konst_ak@mail.ru
scientist reasercher

Nadezhda Vladimirovna Fomina

Southern federal university

Email: fomina2806@mail.ru
student

Tatyana Pavlovna Shkurat

Southern federal university

Email: tshkurat@yandex.ru
doctor of biology science, associate professor, director of Biology Institute

References

Supplementary files