Influence of DNA repair genes polymorphism on karyology of buccal epithelium cells in humans exposed to radon

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В последние годы существенно возрос интерес к экогенетическим и биомедицинским проблемам, связанным с воздействием на население радона и дочерних продуктов его распада в бытовых условиях. При средней суммарной дозе облучения человека в 3,46 мЗв/год, на долю изотопов радона приходится 2,12 мЗв/год (Онищенко, 2008), что составляет 50-60 % от естественных радиационных источников (Уткин, 2000). Радон - химически инертен, но ионизированные продукты его распада (радионуклиды полония, висмута, свинца) сорбируются пылью и влагой, образуя α-радиоактивные аэрозольные частицы (Рихванов, 2009). Наиболее опасны аэрозоли субмикронных размеров, которые могут оседать в верхних дыхательных путях, ротовой полости, создавая локальные источники α-облучения клеток. По данным Hei et al. (1997), до 80 % клеток эпителия выживают после попадания α-частиц, при этом фракция этих клеток характеризуется повышенной частотой мутаций и может являться источником возникновения злокачественных новообразований. Вклад радона в смертность от рака легких в странах Европы оценивается в 9 % (Darby et al., 2005), а в Канаде данный показатель составляет 10 % (Copes et al., 2007). Основными препятствиями оценки генотоксических эффектов облучения от радона в бытовых условиях являются его низкая концентрация в помещениях, трудности формирования выборки лиц, подвергающихся воздействию одинаковой интенсивности, возможное влияние возраста, хронических патологий, профессиональных факторов, особенностей питания и вредных привычек (Oestreicher et al., 2004). Данная проблема может быть решена при формировании обследованных групп из детей и подростков, проживающих в детских домах и интернатах. Не менее важной задачей при проведении экогенетических исследований является подбор адекватных методов. В настоящее время для оценки мутагенного воздействия факторов внешней среды, в том числе и радиационной природы, широко используются метод учета хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови (Hamza et al., 2009; Голуб и др., 2010; Мельнов и др., 2008), микроядерный тест в культурах лимфоцитов с цитокинетическим блоком (Пелевина и др., 2010), метод флюорисцентной гибридизации in situ (FISH) (Tawn, 2006; Oestreicher et al., 2004; Тимошевский и др., 2010), а также метод комет (Comet-assay) (Hellman et al., 1999). Вышеперечисленные методы характеризуются высокой точностью, но требуют инвазии и являются дорогостоящими. Для скрининговых исследований наиболее подходящим является микроядерный тест в буккальных эпителиоцитах. Использование для биоиндикационных исследований клеток буккального эпителия имеет ряд преимуществ, так как они подвергаются непосредственному воздействию атмосферных аэрозолей, кариологические повреждения и нарушения пролиферации, происходящие в клетках базального слоя, можно наблюдать во внешних слоях клеток, кроме того, их получение не требует инвазии и максимально безопасно. Развернутый микроядерный тест позволяет выявить генотоксические, пролиферативные эффекты, а также определить приоритетные механизмы гибели клеток (некроз/апоптоз) под воздействием факторов внешней среды, в том числе и ионизирующего излучения (Сычева и др., 2013). Прямые и опосредованные последствия воздействия ионизирующей радиации во многом определяются индивидуальными конститутивными особенностями. Одним из факторов дифференциальной радиочувствительности человека является функциональная активность ферментов репарации ДНК, обусловленная полиморфизмом соответствующих генов (Гончарова, 2003). Поэтому для более корректной оценки гено- и цитотоксических эффектов от воздействия ионизирующей радиации следует учитывать индивидуальные генотипические особенности. При проведении генетического и экологического мониторинга на территориях Кемеровской области сотрудниками кафедры генетики КемГУ была выявлена группа детей и подростков, проживающих и обучающихся в школе-интернате г. Таштагол, в воздухе жилых и учебных помещений которого стабильно регистрируется сверхнормативные концентрации радона; показатель эквивалентной равновесной объемной активности радона составляет 314,4 Бк/м3 при допустимом значении 200 Бк/м3 (Нормы радиационной безопасности, 2009). Для данной когорты установлены кластогенные эффекты воздействия радона, выражающиеся в повышенной частоте хромосомных аберраций относительно групп, проживающих в районах с нормальной по радиационным параметрам обстановкой (Дружинин и др., 2010). Целью настоящей работы является оценка воздействия повышенных доз радона в бытовых условиях на гено-, цитотоксические и пролиферативные показатели буккальных эпителиоцитов с учетом носительства различных вариантов генов репарации ДНК. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Исследовано две группы детей и подростков из различных по радиационной обстановке районов Кемеровской области. Экспонированная радоном группа сформирована из 318 воспитанников школы-интерната № 3 г. Таштагол, обследование которых проводилось в течение 4 лет. Контрольная выборка включила 65 детей и подростков, проживающих в сельских населенных пунктах в условиях отсутствия выраженного загрязнения окружающей среды по радиационным и химическим показателям: с. Красное Ленинск-Кузнецкого района и с. Пача Яшкинского района. Все экспидиционные выезды осуществлялись в зимний период. Половозрастная структура обследованных выборок представлена в таблице 1. Сбор анамнестических данных проводили путем устного анкетирования и анализа медицинских карт (форма 025/у-87). Учитывали наличие хронических и инфекционных заболеваний, курения, прием лекарственных препаратов, рентгенодиагностические процедуры за 3 месяца до сбора материала. На момент обследования все индивиды были практически здоровы. Материалом для исследования послужили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови, и препараты буккального эпителия. Забор биологического материала производился после подписания родителями либо лицами, осуществляющими опеку несовершеннолетних, формы информированного согласия. Цитогенетический анализ Приготовление цитогенетических препаратов осуществляли с учетом рекомендаций Thomas et al. (2009). Перед взятием образцов буккального эпителия обследуемые тщательно ополаскивали рот очищенной питьевой водой. Сбор материала проводили смоченным в буферном растворе (Tris HCl, EDTA, NaCl, pH = 7) шпателем. После трехкратной промывки клетки раскапывали на предварительно отмытые и подогретые предметные стекла. Препараты фиксировали фиксатором Кларка, окрашивание проводили 2,5%-м раствором ацетоорсеина и 1%-м спиртовым раствором светлого зеленого. Анализ препаратов проводили на микроскопе Nikon E200 при увеличении 100 × 1,5 × 10. На препаратах учитывали 12 кариологических показателей (рис. 1). Идентификацию микроядер (МЯ) проводили с помощью классических критериев (Tolbert et al., 1992). Регистрацию таких ядерных аномалий, как двуядерность, конденсированный хроматин, пикноз, кариорексис, кариолизис, протрузии типа «пузырек», «разбитое яйцо», «язык», ядра с центральной круговой насечкой, ядра с перинуклеарными и ядерными вакуолями, ядра атипичной формы и клетки с апоптозными телами осуществляли с учетом рекомендаций Сычевой Л. П. (Сычева, 2007). Частоту клеток с МЯ, протрузиями ядра, ядром атипичной формы, с двумя ядрами, с круговой насечкой, перинуклеарными и ядерными вакуолями выражали в промилле ( ‰). Клетки с конденсацией хроматина в ядре, кариорексисом, кариопикнозом, кариолизисом и апоптозными телами являются не подходящими для учета МЯ, поэтому их частоту выражали как число клеток, найденных сверх 1000. Молекулярно-генетический анализ Для анализа полиморфизма генов NBS1 Glu185Gln, ATM Asp1853Asn и ADPRT Val762Ala ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови методом «ДНК- экспресс». Типирование аллельных вариантов генов репарации ДНК осуществляли с использованием аллель-специфической ПЦР и набора реагентов «SNP-экспресс», разработанного НПФ «Литех» (г. Москва) (Руководство по применению диагностических наборов…, 2012). Продукты амплификации выявляли электрофоретическим методом в 3%-м агарозном геле, визуализацию и документирование полученных результатов проводили с использованием трансиллюминатора Vilber Lourmat ECX-15.M и видеосистемы Gel Imager 2 производства ООО «Компания Хеликон». Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Statsoft Statistica 6.0. Достоверность отличий количественных показателей микроядерного теста между группами оценивали с использованием U-критерия Манна-Уитни (Закс, 1976, С. 270), различия считали значимыми при p < 0,05. Соответствие частот распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга определяли с помощью критерия χ2 (Вейр, 1995, С. 87). Сравнение характеристик распределения частот генотипов в опытной и контрольной группах проводили с использованием критерия χ2 Пирсона (Лакин, 1980, С. 126). При расчете с помощью U-теста Манна-Уитни ассоциаций различных генотипов генов репарации ДНК и их сочетаний с кариологическими показателями буккального эпителия использовалась FDR поправка уровня значимости (р) для множественных сравнений (Benjamini, Yekutieli, 2001, P. 1165). РЕЗУЛЬТАТЫ Результаты проведенного анализа кариологических показателей буккального эпителия в обследованных группах представлены в табл. 2. Цитогенетические показатели Микроядерный тест является чувствительным к воздействию веществ различной природы, в том числе и радиационной (Беляева и др., 2007). Отмечено двукратное превышение частоты встречаемости микроядер в экспонированной группе относительно контрольной выборки (p = 0,003). Дифференцированный анализ встречаемости протрузий показал достоверное превышение доли клеток с протрузией типа «язык» в 2 раза (p = 0,048), типа «пузырек» в 2,5 раза (p < 0,001). Интегральные показатели цитогенетических нарушений (суммарная частота протрузий и цитогенетических нарушений) в экспонированной группе в 2,5 раза превысили соответствующие значения относительно группы сравнения (p < 0,001 и p < 0,001 соответственно). Для контрольной выборки отмечено превышение по частоте встречаемости клеток с протрузией типа «разбитое яйцо» (p = 0,039) и с атипичной формой ядра (p < 0,001) (табл. 2). Показатели нарушения пролиферации Для группы экспонированной радоном установлено статистически достоверное двукратное увеличение средней частоты выявления двуядерных клеток (p < 0,001), клеток со сдвоенными ядрами в 1,5 раза (p < 0,001) и интегрального показателя пролиферации в 1,5 раза (p < 0,001) (табл. 2). Показатели деструкции ядра Анализ показателей деструкции ядра у обследованных экспонированной группы показал 5-кратное превышение по частоте клеток с вакуолизацией ядра (p < 0,001), 4-кратное по частоте выявления апоптозных тел (p = 0,001) и почти 3-кратное по встречаемости клеток с кариопикнозом (p < 0,001) в опытной группе в сравнении с контрольной. Для контрольной группы установлено значимое превышение по частоте встречаемости клеток с конденсацией хроматина (p < 0,001) и лизисом ядра (p = 0,008) относительно экспонированной группы (табл. 2). Проведено молекулярно-генетическое типирование полиморфных вариантов кандидатных генов радиочувствительности: NBS1 (rs1805794), ATM (rs1801516), ADPRT (rs1136410). Частоты генотипов и аллелей изученных генов в обследованных группах представлены в таблице 3. Между опытной и контрольной группами установлены отличия характеристик распределения генотипов по гену ADPRT (X2 = 7,314, p = 0,0258). Модифицирующее влияние полиморфизма изученных генов установлено для цитогенетических показателей и показателей деструкции ядра. Значимые ассоциации полиморфизма изученных генов с частотами кариологических нарушений буккальных эпителиоцитов представлены в таблице 4. Проведено исследование ассоциаций между различными вариантами парных сочетаний изученных генов и кариологическими показателями. Выявлены значимые отличия по суммарной частоте встречаемости протрузий у носителей различных аллельных вариантов сочетаний NBS1&ATM (рис. 3). ОБСУЖДЕНИЕ Современный протокол микроядерного теста включает учет микроядер как основного показателя генотоксичности, так как их образование связывают с ацентрическими фрагментами хромосом, почкованием ядер или нарушениями расхождения целых хромосом на стадиях анафазы митоза, а также с незавершенностью телофазы (Беляева и др., 2007). Ядерные протрузии типа «язык», «разбитое яйцо» также являются маркерами нерепарируемых цитогенетических нарушений, так как их формирование обусловлено образованием ацентрических терминальных фрагментов хромосом, разрывом межъядерных мостов во время клеточного деления, почкованием ядер (Кузоватов, 2000). Образование же ядерных пузырьков связывают с удалением из клетки амплифицированной ДНК, элиминацией из ядра ДНК-репарационных комплексов (Sharma, 2005). Полученные данные (табл. 2) свидетельствуют о том, что по всем изученным цитогенетическим показателям, за исключением протрузий «разбитое яйцо» и ядер атипичной формы средние значения в опытной группе статистически достоверно выше, чем в контрольной выборке. Анализ показателей нарушения пролиферации также установил превышение средних значений в экспонированной группе в сравнении с контрольной. В литературных источниках имеются данные о повышении частоты встречаемости двуядерных клеток в ответ на облучение (Koss, 1979), что подтверждается полученными нами результатами. Среди показателей, отражающих деструктивные изменения ядер, наиболее изучены кариопикноз и кариорексис, повышение частоты встречаемости которых свидетельствует о генотоксическом воздействии различных факторов (Daniel, Olson, Stober, 1991). Кроме того, для некоторых агентов установлена более высокая чувствительность данных ядерных аномалий по сравнению с микроядрами (Tolbert et al., 1991; Torres-Bugarin et al., 1998). В нашем исследовании значимое превышение установлено по частоте выявления пикнотических ядер в опытной группе относительно контрольной (p = 0,00005). С высокой степенью значимости показано превышение частот выявления клеток с вакуолизацией ядра (p < 0,001) и апоптозными телами (p = 0,001) в опытной группе в сравнении с контрольной. Полученные результаты относительно таких показателей как конденсация хроматина и кариолизис свидетельствуют о значимом превышении средних значений для контрольной группы (p = 0,008 и р < 0,001 соответственно) (табл. 2). Важно отметить, что снижение интенсивности деструктивных изменений (конденсация хроматина, кариолизис) в клеточной популяции, характеризующейся повышенным уровнем цитогенетических повреждений, является наиболее неблагоприятным процессом, приводящим к накоплению генетически поврежденных клеток (Сычева, 2007). Пределы варьирования и средние значения выявления цитогенетических нарушений, показателей пролиферации буккальных эпителиоцитов в контрольной выборке практически совпадают с данными других авторов для детей и подростков, проживающих в относительно благоприятных экологических условиях (Юрченко и др., 2007; Бяхова и др., 2010; Сычева и др., 2010), что позволяет рассматривать полученные характеристики как фоновые для Кемеровской области. Необходимо отметить, что сравнительный анализ средних значений цитогенетических, пролиферативных и показателей деструкции ядра за отдельные годы с данными для группы контроля выявил наличие статистически значимых отличий (p < 0,005) аналогичных для объединенной группы за четырехлетний период. С целью оценки влияния возрастных особенностей на кариологические показатели реактивности буккальных эпителиоцитов в условиях экспозиции радоном исследуюмую выборку подразделили на возрастные группы согласно возрастной периодизации (Хрисанова, 2002): «второй детский возраст» (n = 151), «подростки» (n = 128), «юноши» (n = 39). При сопоставлении средних значений анализируемых показателей статистически значимых отличий между возрастными группами не установлено (p > 0,05). Аналогичный результат получен при сравнении групп курящих (n = 47) и некурящих (n = 271) обследованных. В когорте экспонированной радоном гендерные отличия установлены при сопоставлении средних значений частот выявления ядерных пузырьков, соответствующие значения в группах девочек и мальчиков составили 4,01 ± 0,31 ‰ и 2,91 ± 0,80 ‰ (р = 0,012). В контрольной группе зависимости частоты данного показателя от пола не выявлено, а при сопоставлении средних значений анализируемого показателя в опыте и контроле с учетом пола, они в обоих случаях статистически достоверно выше оказались в группе экспонированной радоном (рис. 2), что свидетельствует о доминирующей роли влияния радона в формировании ядерных протрузий типа «пузырек». Полученные в ходе кариологического анализа результаты, позволяют охарактеризовать экспонированную группу как группу повышенного цитогенетического риска, в связи с чем представляется актуальным изучение полиморфизма генов репарации ДНК и их влияния на показатели цитогенетической нестабильности с использованием микроядерного теста. Исследованию ассоциаций кариологических показателей с носительством различных вариантов генотипов предшествовало изучение характеристик распределения аллельных вариантов генов репарации ДНК в представленных группах (табл. 3). В исследуемых выборках отклонений частот распределения от равновесия Харди-Вайнберга по изученным генам не выявлено. При сопоставлении характеристик распределения генотипов опытной и контрольной группы с использованием критерия Х2 показано, что в контрольной группе выше частоты носителей гомозиготного варианта по мажорному аллелю ADPRT Val762Val и ниже по минорному аллелю. Продукт гена ADPRT является ключевым белком эксцизионной репарации оснований (BER), который специфически связывается с поврежденной цепью ДНК, обеспечивая присоединение XRCC1 и Lig3α комплекса. Данный фермент также запускает реакции полимеризации АДФ-рибозы (Caldecott, 2003). Воздействие ионизирующей радиации индуцирует образование свободных радикалов и развитие энергодефицита в клетках оксидативного стресса (Зайчик, 2008). Установлено, что в таких условиях более высокую активность проявляет фермент ADPRT, имеющий Val в 762 положении, активность фермента снижается при замене валина на аланин (Lockett et al., 2004). При участии поли-АДФ-рибозилполимераз происходит превращение НАД в поли-АДФ-рибозу и повышенная активность фермента усугубляет оксидативный стресс, приводящий к энергодефициту. В условиях энергодефицита клетки вступают на путь апоптоза или некроза. В нашем исследовании установлено, что у гомозигот по мажорному аллелю статистически достоверно чаще выявляются клетки с вакуолизацией ядра, чем у гетерозигот (p = 0,004) и гомозигот по минорному аллелю (p = 0,001) (табл. 4). При этом следует отметить, что у носителей ADPRT Val/Val среднее значение характеризуемого показателя (34,42 ± 30,21 ‰) относится к наиболее высоким в группе экспонированной радоном. Для носителей гомозиготного варианта по мажорному аллелю ADPRT показана также более высокая частота выявления клеток с пикнотическими ядрами по сравнению с гетерозиготами (p = 0,004) (табл. 4). Начальным этапом распознавания повреждений в процессах репарации путем гомологичной рекомбинации и негомологичного слияния концов, служит MRN-комплекс (включающий белки MRE11, RAD50, нибрин), причем нибрин является ключевым регулятором этого комплекса (Kracker et al., 2005). Ген NBS1 (Nijmegen breakage syndrome gene 1), локализованый на хромосоме 8q21, имеет протяженность около 50 тыс. п. н. и включает 16 экзонов. Анализируя влияние полиморфизма гена NBS1 Glu185Gln на цитогенетические и кариологические показатели эксфолиативного эпителия в экспонированной группе установлено, что у гетерозигот NBS1 185 Glu/Gln статистически достоверно выше средние значения выявления клеток с ядерной протрузией типа «разбитое яйцо», которое относится к нерепарирумым повреждениям, в сравнении с гомозиготами по мажорному аллелю (p = 0,006), а у гомозигот по минорному аллелю более чем в 2 раза чаще обнаруживаются клетки с апоптозными телами, чем у гомозигот по мажорному аллелю (p = 0,006) (табл. 4). В работе Zheng et al. (2011) установлено, что данный полиморфизм ассоциирован с риском развития назофарингеального рака, что подтверждает более высокую подверженность цитогенетическим повреждениям эксфолиативного эпителия у носителей минорных аллелей. Ген АТМ (серин/треониновая протеинкиназа) протяженностью 150 т. п. н., локализован в хромосоме 11q22-q23 и кодирует состоящую из 66 экзонов протеинкиназу, которая относится к семейству фосфатидилинозитол-3-киназ и экспрессируется во многих тканях (Savitsky et al., 1995). АТМ фосфорилирует ферменты большинства путей репарации ДНК (Shiloh, 2003). Белок в основном располагается в ядре в неактивной димерной форме, которая диссоциируется с образованием активных мономеров при возникновении двойных разрывов нитей ДНК (Bakkenist, 2003). Статистически значимых ассоциаций генотипов с частотой кариологических показателей буккального эпителия в экспонированной группе по данному гену обнаружено не было (табл. 4), что возможно связано с недостаточным количеством носителей минорных аллелей. Учитывая взаимодействие продуктов генов ATM и NBS1 в процессах репарации ДНК (Banin et al., 1998), проведен анализ модифицирующего влияния парных сочетаний данных генов на кариологические показатели эксфолиативного эпителия, который позволил установить, что дифференцировка когорты экспонированной радоном по частотам выявления ядерных протрузий в буккальных эпителиоцитах обусловлена генетическим полиморфизмом не только гена NBS1 в отдельности, но и в его сочетаниях с геном ATM (рис. 3). Так, у гомозигот по мажорному варианту аллелей NBS1 185 Glu/Glu в сочетании с гетерозиготностью по ATM 1853 Asp/Asn средние показатели суммарной частоты выявления ядерных протрузий ниже по сравнению с гетерозиготными вариантами NBS1 185 Glu/Gln и гомозиготами по мажорному аллелю ATM (p = 0,004). Сочетание гомозиготности по мажорному аллелю гена NBS1 и гетерозиготности по локусу ATM можно рассматривать как протективный признак, так как в условиях воздействия ионизирующей радиации для выборки носителей данного генотипа установлено самое низкое значение суммарной частоты протрузий (1,85 ± 0,44 ‰) (рис. 3), которое приближено к соответствующему значению в группе контроля (табл. 2). По остальным парным сочетаниям изученных SNP статистически значимых отличий не выявлено. Необходимо отметить, что анализ модифицирующего влияния полиморфизма изученных генов в контрольной группе не выявил статистически значимых отличий ни по одному из показателей микроядерного теста. Такой результат, вероятно, свидетельствует о том, что в условиях отсутствия воздействия мутагенных факторов носительство инвариантных аллелей изученных генов не оказывает влияния на цитологический статус буккального эпителия. Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что экспонированная радоном группа характеризуется значимым повышением уровня цитогенетических нарушений суммарно, а также отдельных показателей цитогенетической нестабильности в сравнении с контрольной выборкой. Увеличение частоты выявления двуядерных клеток и клеток со сдвоенными ядрами в условиях экспозиции радоном следует рассматривать как нарушение веретена деления и цитокинеза в стволовых клетках буккального эпителия. Полученные результаты свидетельствуют об адекватности использования микроядерного теста для оценки экогенетических последствий длительного воздействия излучения от радона. Повышение частот выявления клеток с ранней и поздней деструкцией ядра связано с носительством мажорных аллелей гена ADPRT Val762Ala. Показано, что полиморфизм NBS1 Glu185Gln в условиях воздействия ионизирующей радиации ассоциирован с повышением частот выявления протрузий типа «разбитое яйцо» и апоптозных тел. Цитогенетическим повреждениям клеток буккальных эпителиоцитов наиболее подвержены индивиды с генотипом NBS1 185Glu/Gln & ATM 1853Asp/Asp, а носителей аллельного варианта NBS1 185Glu/Glu & ATM 1853Asp/Asn можно отнести к резистентной когорте.

About the authors

Alina Viktorovna Meyer

Kemerovo State University

Email: shapo-alina@yandex.ru
PhD, assistant. Department of Genetics

Tatyana Andreyevna Tolochko

Kemerovo State University

Email: totat@list.ru
Teacher. Faculty of Biology, Department of Genetics

Varvara Ivanovna Minina

Institute of Human Ecology SB RAS

Email: vminina@mail.ru
Head of the Laboratory. Laboratory of Сytogenetics

Anna Aleksandrovna Timofeyeva

Institute of Human Ecology SB RAS

Email: coldunica@mail.ru
Engineer. Laboratory of Сytogenetics

References

Supplementary files