Influence of phytoecdysteroids and plants steroidal glycosides on the lifespan and stress resistance of drosophila melanogaster

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В настоящее время большое внимание уделяется созданию новых лекарственных препаратов, биологически активных добавок к пище и продуктов функционального питания, повышающих устойчивость организма к действию неблагоприятных факторов окружающей среды и обладающих свойством увеличивать продолжительность жизни. В этой связи большой теоретический и практический интерес представляют вещества природного происхождения, такие как полифенольные соединения, стероидные и тритерпеновые гликозиды, фитоэкдистероиды, большинство из которых, являясь продуктами специализированного обмена, играют роль защитных факторов для самих растений при действии различных повреждающих факторов биотической и абитической природы (Володин, Матаев, 2011; Panossian et al., 1999). Несмотря на то, что растения, обладающие адаптогенным и геропротекторным действием, уже имеют свою историю применения в народной и научной медицине, изучение клеточных и молекулярных механизмов действия входящих в их состав активных субстанций остается актуальным направлением исследований. Предполагается, что присутствие вторичных метаболитов растений адаптогенной природы в качестве минорных компонентов пищи может индуцировать гормезис и вести к увеличению продолжительности жизни (Анисимов, 2003). Ранее нами было показано, что геропротекторые и адаптогенные свойства веществ растительного происхождения, таких как лигнины и пектины, могут быть обусловлены не только их антиоксидантной активностью, но и способностью индуцировать гены стресс-ответа клетки (Белый с соавт., 2010; Shaposhnikov et al., 2014). Мы установили, что активация механизмов стрессоустойчивости клетки с помощью фармакологических препаратов, специфически ингибирующих PI3K, TOR, iNOS и NF-κB, также приводит к увеличению продолжительности жизни D. melanogaster (Danilov et al., 2013; Moskalev, Shaposhnikov, 2011; Moskalev, Shaposhnikov, 2010). Цель настоящей работы заключалась в изучении механизмов действия растительных адаптогенов - экдистероидов и стероидных гликозидов, выделенных из некоторых видов растений, на продолжительность жизни и стрессоустойчивость Drosophila melanogaster. Предполагалось изучить влияние малых концентраций фитопрепаратов, содержащих фитоэкдистероиды (субстанция серпистен, представляющая собой смесь индивидуальных экдистероидов 20-гидроксиэкдизона и инокостерона из листьев растения Serratula coronata L.) и стероидные гликозиды растений (экстракт семян растения Trigonella foenum-graecum L., содержащий диосцин и протодиосцин), на экспрессию генов стресс-ответа клетки (гены белков теплового шока, репарации ДНК, антиоксидантной защиты, апоптоза, ответа на повреждение ДНК); оценить влияние фитопрепаратов, содержащих фитоэкдистероиды и гликозиды на стрессоустойчивость (паракват, голодание, гипертермия) и продолжительность жизни D. melanogaster. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Объект исследований В работе использовали лабораторную линию D. melanogaster дикого типа Canton-S, полученную из коллекции дрозофилиного Центра в Блумингтоне, Университета штата Индиана (Блумингтон, США). Обработка фитопрепаратами Фитопрепараты добавляли в состав стандартной сахарно-дрожжевой питательной среды (Ashburner, 1989). Концентрация серпистена составляла 0,2 и 1,0 мкМ. Содержание экстракта пажитника соответствовало концентрации протодиосцина - 0,9 и 4,6 мкг/мл и диосцина - 0,5 и 2,6 мкг/мл. Контрольных мух содержали на питательной среде без добавления фитопрепаратов. Анализ продолжительности жизни Контрольных и опытных мух содержали при температуре 25 ± 0,5 °C и искусственном режиме освещения 12 ч день: 12 ч ночь. В баночки объемом 120 мл, содержащие 20 мл среды рассаживали по 30 особей одного пола и возраста. Мух пересаживали на свежую среду 2 раза в неделю. Продолжительность жизни анализировали ежедневно, раздельно у самцов и самок. Функции дожития оценивали с помощью процедуры Каплана-Мейера и представляли в виде кривых дожития. Рассчитывали медианную и максимальную (как возраст гибели 90 % особей) продолжительность жизни. При статистической обработке результатов применяли непараметрические методы. Для сравнения функций дожития использовали модифицированный критерий Колмогорова-Смирнова. Критерий Мантеля-Кокса применяли при оценке достоверности различий по медианной продолжительности жизни. Для оценки статистической значимости различий максимальной продолжительности жизни использовали тест Ванг-Аллисона (Wang et al., 2004). Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Statistica, версия 6.1 и (StatSoft, USA) и статистической среды R, версия 2.15.1 (RCoreTeam, 2014). Оценка стрессоустойчивости Перед оценкой стрессоустойчивости (окислительный стресс, гипертермия, голодание) мух в течение 20 суток содержали на питательной среде с добавлением фитопрепаратов. При окислительном стрессе мух содержали на фильтровальной бумаге, смоченной 5 % раствором сахарозы с добавлением параквата в концентрации 20 мМ. При голодании - на фильтровальной бумаге, смоченной дистиллированной водой. При гипертермии мух содержали при T = 35 °C. Мух подвергали воздействию стрессовых условий до полной гибели выборки. Количество выживших особей учитывали через каждые 12 часов. Оценивали процентную долю мух, выживших по истечении 24 ч (гипертермия) или 48 ч (окислительный стресс и голодание) стрессового воздействия. Каждый эксперимент проводили в двух независимых повторностях с использованием 100-120 особей. Для оценки статистической достоверности различий использовали φ-критерий Фишера. Количественный анализ ПЦР «в реальном времени» Для определения уровня экспрессии генов стресс-ответа дрозофил линии дикого типа Canton-S в течение 20 суток содержали на питательной среде с добавлением растворов серпистена и экстракта пажитника в различных концентрациях. По 10 имаго на вариант эксперимента помещали в раствор TRIzol Reagent (Invitrogen, USA) и гомогенизировали с использованием гомогенизатора SilentCrusher S (Heidolph, Germany). РНК выделяли с помощью TRIzol Reagent (Invitrogen, USA) по инструкции изготовителя. Для контроля отсутствия примеси ДНК в полученных образцах РНК ставили ПЦР с праймерами гена β-Tubulin без проведения обратной транскрипции. Обратную транскрипцию для синтеза кДНК из полученной РНК проводили с помощью Oligo (dT)20 праймера (Invitrogen, USA) и обратной транскриптазы SuperScript III (Invitrogen) по инструкции изготовителя. Для ПЦР «в реальном времени» использовали реакционную смесь с красителем SYBR Green PCR Master Mix (Applied Byosystems, USA) и праймеров (табл. 1). Реакцию проводили в амплификаторе CFX-96 (BioRad, USA), используя следующую программу: 1) денатурация при 95 °C в течение 10 мин, 2) денатурация при 95 °C в течение 15 с, 3) отжиг при 60 °C в течение 30 с, 4) элонгация при 60 °C в течение 30 с, 5) этапы 2-4 повторяли 50 раз. Экспрессию исследуемых генов нормализовали по гену «домашнего хозяйства» β-Tubulin, ПЦР для каждого гена-мишени и β-Tubulin проводили в отдельных пробирках. Для каждого варианта эксперимента делали по 4 измерения. По значениям пороговых циклов рассчитывали относительную экспрессию генов стресс-ответа с использованием метода 2-ΔΔСt (Livak, Schmittgen, 2001), где ΔΔCt = ΔCt (опыт) - ΔCt (контроль), и каждое значение ΔCt = Ct (ген-мишень) - Ct (β-Tubulin). На основании анализа результатов 3 повторностей эксперимента рассчитывали средние значения уровней экспрессии. Статистическую значимость отличий оценивали с помощью критерия Манна-Уитни. Тест на уровень потребления пищи Оценку влияния фитопрепаратов на уровень потребления пищи проводили с использованием в качестве трейсера флуоресцентного красителя флуоресцеина (Sigma-Aldrich, USA). Для проведения теста мух в возрасте 5-7 суток помещали на питательную среду, содержащую 50 мкМ флуоресцеина с добавлением фитопрепаратов или без. После кормления в течение 1 часа мух анестезировали и замораживали в жидком азоте на 10 мин. Замороженных мух встряхивали на вортексе для отделения голов. Тела мух гомогенизировали в гомогенизаторе Silent Crusher-S (Heidolph, Germany) в дистилляте, из расчета 5 особей на 1 мл пробы. Далее гомогенизат центрифугировали 2 минуты при 15 000 g, переносили 0,8 мл супернатанта в новый эппендорф, доводили объем до 1,5 мл и снова центрифугировали. Уровень флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре ФЛЮОРАТ-02 ПАНОРАМА (Люмэкс, Россия) при длине волны возбуждения - 494 нм, регистрации - 521 нм. Для каждого варианта эксперимента проводили измерения в 6 независимых повторностях. Уровень потребления пищи оценивали по средним значениям интенсивности флуоресценции. Для оценки статистической значимости отличий использовали t-критерий Стьюдента. Анализ массы тела После обработки фитопрепаратами в течение 20 суток самцов и самок взвешивали на аналитических лабораторных весах Mettler Toledo XP-A (Mettler Toledo, Switzerland). На основании измерения массы тела 10 мух рассчитывали среднюю массу тела одной особи. Эксперимент проводили в 3 повторностях. Статистическую значимость различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Анализ плодовитости Перед оценкой плодовитости мух содержали на питательной среде с добавлением фитопрепаратов в течение 20 суток. Далее мух рассаживали по 3 пары и подсчитывали число яиц, отложенных в течение суток. Данные представляли в виде среднего числа яиц за сутки на самку. Каждый эксперимент проводили в 3 повторностях с использованием 30 самок. Статистическую значимость различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ Экспрессия генов стресс-ответа Исследовано влияние фитопрепаратов, содержащих фитоэкдистероиды и гликозиды, на уровень экспрессии генов обезвреживания свободных радикалов Sod1, ответа на тепловой шок Hsp70Aa, ответа на повреждение ДНК (GADD45, PARP-1), контроля эксцизионной репарации ДНК (mei-9), гомологичной рекомбинации (Rad51) и апоптоза (Hid). Результаты представлены на рисунке 1. Показано, что обработка дрозофил серпистеном и экстрактом пажитника при двух изученных концентрациях привела к увеличению уровня экспрессии гена детоксикации свободных радикалов Sod1 (в 1,2-2,5 раза) и снижению уровня экспрессии генов апоптоза Hid (в 1,4-8,7 раза) и эксцизионной репарации ДНК у самцов и самок, соответственно (p < 0,05). Активность гена PARP-1 у самцов и самок изменилась в разных направлениях - у самцов происходила активация данного гена, а у самок - снижение экспрессии в 1,5-14,5 раз, (p < 0,05). Активность генов Rad51, Hsp70 и D-GADD45 в большинстве случаев статистически значимо не изменилась. Таким образом, исследуемые фитопрепараты активируют механизмы антиоксидантной защиты, что может вести к уменьшению частоты возникновения повреждений ДНК и снижению уровня индукции систем репарации ДНК и клеточной гибели. В этой связи представляет интерес влияние серпистена и пажитника на стрессоустойчивость мух. Стрессоустойчивость Обработка серпистеном в концентрации 1 мкМ вызывает статистически значимое снижение адаптационных возможностей самцов дрозофил к гипертермии (p < 0,05) (рис. 2, A). Экстракт пажитника в наименьшей концентрации (протодиосцин - 0,9 мкг/мл, диосцин - 0,5 мкг/мл) повышает адаптационные возможности самцов дрозофил к тепловому шоку, что выражается в снижении смертности самцов через 24 ч стрессового воздействия (p < 0,05) (рис. 2, A). У самок обработка серпистеном в концентрациях 0,2 и 1 мкМ вызывает снижение адаптационных возможностей самок дрозофил к гипертермии (рис. 2, D). Обработка пажитником не влияет на устойчивость самок к гипертермии. Обработка серпистеном в концентрации 0,2 и 1 мкМ повышает устойчивость к окислительному стрессу у самцов и самок дрозофил, соответственно (рис. 2, B и E). Пажитник не влияет на устойчивость самцов и самок дрозофил к окислительному стрессу. Обработка серпистеном в концентрации 0,2 мкМ и экстрактом пажитника в наибольшей концентрации вызывает статистически значимое (p<0,05) снижение устойчивости самцов к голоданию (рис. 2, C). Экстракт пажитника в наибольшей исследованной концентрации (протодиосцин - 4,6 мкг/мл, диосцин - 2,6 мкг/мл) повышает адаптационные возможности самок дрозофил к голоданию (рис. 2, F). Таким образом, нами установлено, что серпистен снижает устойчивость самцов и самок дрозофил к тепловому шоку, устойчивость самок к окислительному стрессу и устойчивость самцов к голоду. В то же время серпистен повышает устойчивость самцов к окислительному стрессу. Экстракт пажитника снижает устойчивость самцов дрозофил к голоданию, однако повышает устойчивость самцов к гипертермии и устойчивость самок к голоданию. Продолжительность жизни Показано, что в первой повторности эксперимента серпистен в концентрациях 0,2 и 1 мкМ приводит к статистически значимому (p < 0,05) увеличению максимальной продолжительности жизни самцов на 6 %. У самок в первой повторности серпистен в концентрации 0,2 мкМ приводит к увеличению максимальной продолжительности жизни на 4 % (p < 0,05). Однако во второй повторности эксперимента геропротекторный эффект серпистена не наблюдается ни у самцов, ни у самок (табл. 2, рис. 3). Экстракт пажитника в первой повторности эксперимента, в обеих исследованных концентрациях, вызывает увеличение максимальной продолжительности жизни самцов на 4-6 % (p < 0,05) (табл. 2, рис. 4). Во второй повторности эксперимента эффект пажитника на продолжительность жизни самцов не выражен. У самок в первой повторности эксперимента экстракт пажитника в наименьшей из исследованных концентраций вызывает увеличение медианной продолжительности жизни на 6 % (p < 0,05), а в наибольшей концентрации ведет к увеличению максимальной продолжительности жизни на 5 % (p < 0,05). Во второй повторности эксперимента, в обеих исследованных концентрациях, экстракт пажитника вызывает увеличение медианной продолжительности жизни у самок на 7-12 % (p < 0,01). Таким образом, настойка пажитника обладает большим геропротекторным потенциалом в сравнении с серпистеном, при этом геропротекторный эффект пажитника более выражен при низких концентрациях у самок. Влияние фитопрепаратов на уровень потребления пищи Показано, что добавление 0,2 мкМ серпистена в состав питательной среды приводит к статистически значимому (p < 0,005) снижению уровня потребления пищи у самцов и самок на 50 % (рис. 5). При добавлении в питательную среду 0,2 и 1 мкМ экстракта пажитника потребление пищи самцами снижается на 27 и 21 % соответственно (рис. 5). В целом самцы характеризуются большей требовательностью к составу среды, а самки большим уровнем потребления пищи как с фитопрепаратами, так и без них. Мы предположили, что мухи не успели адаптироваться к новому составу среды за время проведения теста (1 ч) вследствие чего наблюдалось снижение уровня потребления пищи. Поэтому мы провели оценку долгосрочных эффектов возможного ограничения потребления пищи на массу тела имаго и плодовитость. Масса тела При оценке эффекта серпистена и экстракта пажитника на массу тела имаго статистически значимых изменений не обнаружено ни у самцов ни у самок (рис. 6). Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии признаков хронического ограничения потребления пищи у мух, содержащихся на питательной среде с добавлением фитопрепаратов. Плодовитость Обнаружено, что обработка серпистеном привела к статистически значимому увеличению яйцепродукции самок на 57-59 % относительно контроля (p < 0,05) (рис. 7). После обработки пажитником наблюдали увеличение яйцепродукции на 60-88 % (p < 0,05) (рис. 7). ОБСУЖДЕНИЕ Различные факторы окружающей среды как химической, так и физической природы способны существенно влиять на транскрипционный профиль клетки и изменять уровень активности генов клеточного стресс-ответа, что находится в основе стресс-реакций на уровне целого организма (Moskalev et al., 2014). Все больше экспериментальных подтверждений получает точка зрения, согласно которой геропротекторные эффекты связаны со стимуляцией веществом-адаптогеном активности собственных систем защиты клетки от различного вида стрессов (Calabrese et al., 2008). Гормезис как следствие умеренного стресса, вызванного различными факторами, принимается как один из вероятных механизмов продления жизни (Le Bourg, 2009; Minois, 2000; Rattan, 2008). Гормезис обычно связывают с активацией белков теплового шока, ферментов антиоксидантной защиты, механизмов репарации ДНК, иммунного ответа и селекцией неустойчивых клеток (Amrit et al., 2010; Arking et al., 2000; Moskalev, 2007; Moskalev et al., 2009; Moskalev et al., 2011; Mylnikov et al., 2005; Tatar et al., 1997; Yang et al., 2007; Zhao et al., 2005). Проведенный нами анализ уровня транскрипции генов стресс-ответа продемонстрировал, что исследуемые фитопрепараты активируют механизмы антиоксидантной защиты (Sod1). По видимому активация Sod1 ведет к снижению уровня свободных радикалов, уменьшению частоты возникновения повреждений ДНК и снижению уровня индукции систем репарации ДНК (XPF и Rad51). Снижение уровня свободнорадикальных повреждений также уменьшает частоту программируемой клеточной гибели (Hid). О высокой антиоксидантной активности растительных препаратов свидетельствуют исследования и других авторов (Mylnikov et al., 2005). Кроме того, у дрозофил, обработанных разными концентрациями серпистена и экстракта пажитника, наблюдается увеличение стрессоустойчивости и продолжительности жизни. Однако эффект, обнаруженный нами на уровне целого организма (стрессоустойчивость и продолжительность жизни), выражен меньше, чем на молекулярном уровне (изменение уровня экспрессии генов). Также мы установили, что умеренный адаптогенный и геропротекторный эффекты фитопрепаратов не связаны с ухудшением приспособленности (плодовитости) и не являются следствием снижения потребления пищи. Ранее нами были выявлены антиоксидантные и геропротекторные свойства у лигнинов, выделенных из серпухи венценосной и родиолы розовой (Белый с соавт., 2010). Кроме того, нами было показано, что обработка имаго дрозофил пектинами приводит к активации экспрессии генов, вовлеченных в контроль репарации ДНК (D-GADD45, mei-9, spn-B), апоптоз (hid), ответ на тепловой шок (hsp70Aa), а также генов иммунного ответа (Defensin, Drosomycin и Metchnikowin) (Shaposhnikov et al., 2014). Все это подтверждает предположение, что продление жизни и повышении стрессоустойчивости фитопрепаратами происходит по механизму гормезиса. Таким образом, полученные нами результаты демонстрируют, что фитопрепараты, содержащие фитоэкдистероиды и гликозиды, изменяют уровень экспрессии генов стресс-ответа клетки и активируют механизмы гормезиса. В тоже время изученные фитопрепараты обладают умеренным геропротекторным и адаптогенным эффектом.

About the authors

Mikhail Vyacheslavovich Shaposhnikov

Institute of Biology of the Komi Science Centre of the Ural Division RAS

Email: mshaposhnikov@mail.ru
Leading Researcher, PhD, Associate Professor, Laboratory of Molecular Radiobiology and Gerontology

Lyubov' Alekseevna Shilova

Institute of Biology of the Komi Science Centre of the Ural Division RAS

Email: lyubov.schilova@yandex.ru
assistant, Laboratory of Molecular Radiobiology and Gerontology

Ekaterina Nikolaevna Plyusnina

Institute of Biology of the Komi Science Centre of the Ural Division RAS

Email: kateplus@mail.ru
Researcher, PhD, Laboratory of Molecular Radiobiology and Gerontology

Svetlana Olegovna Volodina

Institute of Biology of the Komi Science Centre of the Ural Division RAS

Email: volodina@ib.komisc.ru
Head of Laboratory, Doctor of Biological Sciences, Professor, Laboratory of Biotechnology

Vladimir Vital'yevich Volodin

Institute of Biology of the Komi Science Centre of the Ural Division RAS

Email: volodin@presidium.komisc.ru
Head of Laboratory, Doctor of Biological Sciences, Professor, Laboratory of Biotechnology

Aleksey Aleksandrovich Moskalev

Institute of Biology of the Komi Science Centre of the Ural Division RAS

Email: amoskalev@list.ru
Head. Laboratory, Doctor of Biological Sciences, Associate Professor, Laboratory of Molecular Radiobiology and Gerontology

References

Supplementary files