Molecular phylogeny study of Xamilenis Raf. recognition as the segregate genus in the tribe Sileneae

Full Text

Введение Род Xamilenis Raf. был впервые описан S. C. Rafinesque (1840) в труде «Autikon botanikon». К этому таксону он отнёс секцию Nanosilene рода Silene L. (cмолёвка), выделенную Otth'ом (1824). Среди отличительных признаков рода Rafinesque отметил своеобразный внешний облик, дерновинную форму роста, одиночные цветки на цветоножке, двудомность. Название Xamilenis Rafinesque объясняет как «карликовая гвоздика». Он включил в состав рода единственный вид Silene acaulis, которому дал название Xamilenis uniflora. Кроме Xamilenis, Rafinesque также выделил ещё несколько родов из смолёвок: Evastoma, Pleconax, Alifolia, Ixoca. Работы Rafinesque подвергались современниками критике, а многие его описания новых таксонов оставались долгое время незамеченными составителями Index Kewensis, и, как следствие, неизвестными для большинства ботаников (Warren, 2004). Только 80 лет спустя F. W. Pennel (1921) опубликовал список «неучтённых» родов из «Autikon botanikon». Причина невнимания к таксономическим предложениям Rafinesque со стороны систематиков состояла в чрезмерной, как полагали его современники, увлеченности автора описанием новых видов (Pennel, 1921). Таким образом, описание нового рода Xamilenis оставалось незамеченным долгое время. Silene acaulis в обработках относили к секции или серии Nanosilene рода Silene без указания в списке синонимов Xamilenis (Rohrbach, 1868; Williams, 1896; Флора СССР, 1936). Кроме S. acaulis в секцию Nanosilene также включали альпийскую S. dinarica Spreng. (Rohrbach, 1868; Williams, 1896). Шишкин во «Флоре СССР» включил в секцию Nanosilene западно-азиатскую S. dianthoides Pers., кавказский эндемик S. marcowizii Schischk. и европейскую S. rupestris L. В настоящее время S. marcowizii рассматривается как синоним S. dianthoides, которая входит в олиготипную секцию Dianthoidea подрода Siphonomorpha (Конспект флоры Кавказа, 2012), а S. rupestris как Minjaevia rupestris (Флора Восточной Европы, 2004). В обработке Sileneae для флоры Восточной Европы Н. Н. Цвелёв (2001) вновь обратился к роду Xamilenis (арктосмолка) и включил в него три вида: X. acaulis (= S. acaulis), X. dinarica (= S. dinarica) и X. exscapa (= S. exscapa = S. acaulis ssp. exscapa). Н. Н. Цвелёв указал на родство Xamilenis не только с Silene s. str., но и с Viscaria Berhn. Монограф рода Silene Г. А. Лазьков (2002) отметил ошибочность перемещения S. dinarica в род Xamilenis, который, по его мнению, близок к Elisanthe. S. dinarica он помещает в секцию Spergulifolia подрода Siphonomorpha. Система Н. Н. Цвелёва легла в основу изложения материала по Sileneae во «Флоре восточной Европы» (2004). В настоящее время ботаники обладают широким спектром современных методов, прежде всего молекулярно-филогенетических, которые активно используются для изучения эволюции растений и построения естественной системы таксонов. С помощью молекулярных маркеров изучаются границы трибы Sileneae (Oxelman, Liden, 1995; Oxelman et al., 1997), выявляются таксоны гибридного происхождения (Frajman et al., 2009a; Petri et al., 2013), уточняется филогения отдельных родов (Atocion, Viscaria - Frajman et al., 2009b; Melanrium - Rautenberg et al., 2010; североамериканские Silene - Burleigh, Holtsford, 2003). В ряде этих работ в поле зрения попадает и S. acaulis (=X. acaulis). Однако европейские систематики не рассматривают проблему выделения рода Xamilenis в связи с более широким пониманием границ рода Silene. В то же время таксон Xamilenis принимается, как уже сказано, в такой фундаментальной работе, как «Флора Восточной Европы». Целью данной работы было определить, есть ли основания с точки зрения молекулярной филогении считать Xamilenis самостоятельным родом. Для этого мы должны ответить на вопрос о монофилетичности рода Xamilenis в современном его понимании. Также необходимо сравнить представителей этого таксона с другими, прежде всего из тех групп Sileneae, которые систематики указывают как родственные - Viscaria, Silene и Elisanthe. Материалы и методы ДНК была выделена из гербарных материалов (табл. 1) с помощью СТАВ-метода (Doyle, Doyle, 1987) с модификациями (Kim et al., 2009). В связи с обширным ареалом X. acaulis были исследованы растения из нескольких географических точек. Также в работе были использованы образцы ДНК X. acaulis из европейской части ареала, выделенные ранее для филогеографического иследования (Михайлова и др., 2009). Их последовательности ITS представлены в GenBank под номерами KM011926, -31, -32, -39, -55 и -57. Для амплификации и секвенирования фрагментов ITS1-5,8S-ITS2 были использованы праймеры ITS-1P (Righway et al., 2003) и ITS-4 (White et al., 1990), а также в случае необходимости - ITS-2 и ITS-3 (White et al., 1990). Условия ПЦР: 95 °C - 5’, 35 циклов (95 °C - 50’’, 56 °C - 50”, 72 °C - 50”), 72 °C - 10’. Для амплификации фрагмента хлоропластного гена trnL были использованы универсальные праймеры и рекомендуемые для них условия (Taberlet et al., 1991). В состав реакционной среды входили 0,5 мкМ каждого праймера (Бигль, Россия), 2,5 ед. Taq-полимеразы (Синтол, Россия), ПЦР-Буфер-Б для Taq ДНК-полимеразы (Синтол, Россия), 0,2 мМ нуклеотидов (Силекс, Россия), 5-20 нг ДНК и деионизированная вода. Секвенирование осуществляли в Центре коллективного пользования БИН РАН по методу Sanger'а на генетическом анализаторе AbiPrizm с помощью набора «BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit» (Applied Biosystems, США). Для молекулярно-филогенетического анализа были использованы не только полученные нами нуклеотидные последовательности, но и импортированные из базы данных GeneBank (GeneBank, 4.06.2014; Benson et al., 2005). Отбор последовательностей проводился таким образом, чтобы максимально представить разнообразие родов, описанных в трибе согласно системе Цвелёва (2001). Список импортированных последовательностей: Viscaria viscosa HM590313, Viscaria alpina X86878, Polyshemone nivalis X86861, Coccyganthe flos-cuculi HM590312, Coronaria coriacea X86891 и EF674242, Agrostemma githago X86895 и EU221639, Lychnis chalcedonica X86894, Atocion armeria X86880, Sophianthe samojedorum GQ245539, Gastrolychnis pauciflora GQ245531, Elisanthe noctiflora FN821141 и FN821367, E. akinfieviii FN821320, Carpophora viscosa FN821148, Silenanthe zawadskii X86883 и EU221621, Minjaevia rupestris FJ384039, Ebraxis antirrhina DQ908631, Cucubalis baccifer X86889, Pleconax conica FN821100 и EU221624, P. conoidea FN821101 и FN821324, P. subconica HQ334913, P. ammophilla FN821321, P. macrodonta FN821359, Otites cuneifolia EF060233, Silene nutans DQ059406 и DQ061970, Silene viridiflora DQ059414 и DQ061975, S. italica DQ059395 и DQ061956, S. nemoralis EF60230, S. bupleroides X86864, S. littorea EU330445 и EU221619, S. dichotoma X86848, S. gallica X86847, S. pendula FN821142, S. pauciflora GQ245535, S. pygmaea FN821368, S. lydia HQ334975, S. fernandezii DQ061955, S. longica DQ061955, S. rothmaleri DQ061963, Xamilenis acaulis GQ245530, AY116473 и AY116482, Melandrium marizii EF646885, M. latifolium EF647198, M. fedchenkoana FN821336, Oberna behen FN821374. Анализ нуклеотидных последовательностей и построение дерева методом объединения соседей осуществляли в пакете MEGA 5 (Tamura et al., 2011). Выравнивание проводили с помощью алгоритма MAFFT (Katoh, Toh, 2008) на сайте Европейского Института Биоинформатики (EMBL-EBI 4.06.2014; McWilliam et al., 2013). Оптимальную эволюционную модель подбирали в программе ModelGenerator (Keane et al., 2006). Построение дерева с использованием байесовского подхода проводили в программе MrBayes3.1 (Huelsenbeck, Ronquist, 2001). Использовали 10 000 000 генераций для анализа ITS и 2 000 000 генераций для интрона trnL. В качестве внешней группы была выбрана Agrostemma githago (куколь). Результаты и обсуждение Были получены фрагменты ITS для 25 растений из трибы Sileneae, из которых 17 были представителями Xamilenis. Длина фрагментов составила: ITS1-223-245 п. о., ген 5.8S рРНК - 150-155 п. о., ITS2-217-229 п. о. Для реконструкции филогении по ITS кроме полученных нами было использовано 26 последовательностей Sileneae из GenBank. Р-расстояния между нуклеотидными последовательностями ITS варьировали от 0 до 11,9 % (табл. 2). Большие значения межнуклеотидных расстояний (около 11 %) наблюдались при сравнении X. acaulis и Agrostemma githago. Минимальные расстояния были между образцами X. acaulis из Европы (0 %), а также между X. acaulis, Polyshemone nivalis и рядом смолёвок из подрода Siphonomorpha - S. italica, S. nemoralis, S. jenisseensis, S. nutans, S. pauciflora (0,1 %). Внутри группы Xamilenis наибольшее р-расстояние наблюдалось между X. dinarica и X. acaulis/X. exscapa (1-2,2 %), а также между образцом X. аcaulis из востока Канады (Ньюфаундленд) и остальными представителями рода (1-1,9 %). Несмотря на показанное ранее высокое генетическое разнообразие по маркерам AFLP среди представителей X. acaulis из разных частей Европы (Михайлова и др., 2009), значимого полиморфизма в последовательностях ITS не было найдено. В то же время подтвердилась обособленность растений с востока Канады. На филогенетическом дереве последовательностей ITS (рис. 1), построенном с помощью байесовского подхода, крупные клады имеют довольно слабую статистическую поддержку (0,63-0,65). Но можно выделить более мелкие клады с высокими значениями апостериорной вероятности (0,97-1). Самая большая из хорошо поддержанных клад - «силеноидная» (клада 3), кроме неё можно выделить небольшие клады конусовок (Pleconax, клада 1), «смолковую» (клада 4), «лихнисовую» (клада 5) и сборную (клада 2). Отношения между этими кладами, а также между видами Cucubalis baccifer, Melandrium dioca, Elisanthe noctiflora и некоторыми Silene на дереве плохо разрешены. Представители родов Viscaria и Elisanthe оказываются в разных кладах c Xamilenis. Филогенетическое дерево, построенное методом объединения соседей, значительно менее информативно, так как большинство ветвей на нём не разрешено (данные не показаны). Можно выделить только несколько клад с хорошей бутстреп-поддержкой - «лихнисовую», «смолковую» и Pleconax. Эти клады совпадают по составу с таковыми в байесовском дереве. Представители X. acaulis из разных географических областей формируют две субклады. В первую вместе с Polyshemone nivalis попадают все европейские растения этого вида и два американских (из Аляски и Колорадо). Вторую субкладу составляют образцы из Америки и Чукотки вместе с X. exscapa из Канадского Арктического Архипелага. Эти две субклады объединяются вместе с другими смолёвками из подрода Siphonomorpha (секции Siphonomorpha, Italicae, Graminiformes). В нашем исследовании, так же как и в более ранней работе (Oxelman, Liden, 1995), на филогенетическом древе, построенном по последовательностям рДНК, к X. acaulis наиболее близка Polychemone nivalis. Таким образом, род Xamilenis на филогенетических деревьях последовательностей ITS монофилетичной клады не формирует (рис. 1), по р-расстояниям виды этого рода в равной степени близки некоторым видам рода Silene (табл. 2). В последовательностях ITS были найдены специфичные делеция и нуклеотидные замены, характерные для Viscaria, Atocion и Minjaevia, Lychnis и Pleconax. Так, у Viscaria, Atocion и Minjaevia в 62 и 64 положениях ITS1 характерны dG и dA соответственно, тогда как для остальных - dT и dG. Также для этих трёх родов характерна делеция трёх нуклеотидов в положениях 65-67 ITS1. Анализ последовательностей интрона trnL хпДНК проводился по меньшему числу растений. Это связано с техническими трудностями при амплификации и секвенировании данных фрагментов, обусловленными наличием гомополимерных участков. В результате были получены фрагменты, представляющие собой большую часть интрона гена тРНК-Leu (UAA) без участка 48 п. о. на 5'-конце. Кроме полученных нами, было использовано 23 последовательности из GenBank. Интроны trnL отличались низким содержанием нуклеотидов GC (30,6 %) и высоким - АТ (69,4 %). Длина фрагментов составляла 521-600 п. о. Р-расстояния варьировали от 0 до 7,7 %. Минимальные расстояния наблюдались между последовательностями видов рода Melandrium, максимальные - между американским образцом X. acaulis и S. littorea. Хотя отношения между многими ветвями дерева последовательностей интрона trnL (рис. 2) также не полностью разрешены, на нём можно выделить три клады с высокой апостериорной вероятностью. В первую крупную кладу дерева хпДНК (клада 1) попадают те представители, которые на дереве ITS входили в «силеноидную», «смолковую» и «лихнисовую» клады, за исключением Coronaria coriaceae и S. jenisseensis. В этой кладе с хорошей поддержкой выделяются три субклады: Viscaria+Сoccyganthe, X. acaulis, смолёвки секции Siphonomorpha. Вторая большая клада дерева хпДНК (клада 3) содержит виды, образовавшие на дереве ITS кладу конусовок, смешаную, ряд видов с неопределённым положением, а также S. jenisseensis. Эти клады могут маркировать хорошо дивергировавшие группы в трибе, линии сформировавшиеся давно. В одной кладе с Xamilenis оказываются представители Silene и Viscaria, но не Elisanthe. Показано, что появление вставок, делеций и инверсий в межгенных спейсерах и интронах хпДНК у Sileneae происходит быстрее, чем накопление нуклеотидных замен (Ingvarsson et al., 2003). Мы обратили внимание на такие изменения в изученных последовательностях интрона гена trnL. Были выявлены несколько полиморфных участков с инсерциями и делециями, характерными как для групп родов, так и для отдельных родов и даже секции. На рисунке 3 представлена возможная схема изменений двух полиморфных участков в ходе эволюции. Среди вариабельных участков в хпДНК, которые могут рассматриваться как синапоморфные признаки, не выявлено характерных только для Xamilenis состояний. Состав этих фрагментов у Xamilenis соответствовал таковым у основной группы смолёвок. Систематика Sileneae сопряжена с определёнными сложностями, которые могут быть связаны с гибридизационными событиями (Frajman et al., 2009a). Недавно было показано наличие значительного потока генов даже между хорошо дивергировавшими видами (Petri et al., 2013). Этим можно объяснить политомию ветвей филогенетических деревьев. По результатам анализа хпДНК и рДНК мы не видим аргументов в пользу предположения, что род Xamilenis монофилетичен. В тоже время для вида X. acaulis отмечен полиморфизм последовательностей ITS, различия выявлены между между группой американских/чукотских растений и европейских, что согласуется с имеющимися наблюдениями о различиях между европейскими и северо-пацифическими/американским растениями по морфологическим признакам (Арктическая флора, 1971). На филогенетическом дереве, построенном по последовательностям низкокопийного ядерного гена РНК-полимеразы (Petri et al., 2013) Х. acaulis и X. dinarica оказываются в одной кладе, однако на этом дереве только два представителя Х. acaulis, что может не отражать внутривидовой полиморфизм, и нет других близких по ITS и хпДНК видов смолёвок. Наиболее близок к Xamilenis оказывается подрод Siphonomorpha рода Silene. Молекулярные данные поддерживают включение X. acaulis, X. exscapa и X. dinarica в род Silene, как это делает ряд авторов (Oxelman et al., 2013 - для всех, Лазьков, 2002 - для X. dinarica). Наши данные не подтверждают гипотезу о близости Xamilenis к роду Elisanthe. Род Viscaria попадает в одну кладу с Xamilenis по хпДНК, но в разные - по ITS. Это может быть связано с событиями межвидовой отдаленной гибридизации, которые имели место в эволюции Sileneae. Аналогичная ситуация с сибирским видом S. jenisseensis - на деревьях ITS и trnL он располагается в разных кладах, это может говорить о гибридном происхождении. Данные молекулярной филогении по ядерному фрагменту ITS и интрону хлоропластного гена trnL, сравнению содержания GC и анализу синапоморфных инделей/полиморфных участков свидетельствуют в пользу включения представителей Xamilenis в род Silene.

About the authors

Yulia Vladimirovna Mikhaylova

Komarov Botanical Institute, Russian Academy of Sciences

Email: YMikhaylova@binran.ru
junior reseacher, Laboratory of Biosystematics and Cytology

Elena Evgen'yevna Krapivskaya

Komarov Botanical Institute, Russian Academy of Sciences

Email: krapivskaja@rambler.ru
leading engineer, Laboratory of Biosystematics and Cytology

Aleksandr Vikent'yevich Rodionov

Komarov Botanical Institute, Russian Academy of Sciences

Email: avrodionov@mail.ru
head of the laboratory, professor, Doctor of Biological Science, Laboratory of Biosystematics and Cytology

References

Supplementary files