Роль генетической коллекции дрозофилы в формировании направлений исследований и в образовательном процессе на кафедре генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета

Полный текст

Крупнейшие генетические коллекции существуют для одного из ведущих модельных объектов генетики — Drosophila melanogaster. Первоначально создание коллекций дрозофилы было связано с рядом университетов США, где были организованы специальные центры поддержания генетического материала, насчитывающие сотни линий дрозофилы. В дальнейшем появились аналогичные европейские центры, в частности, в Швеции, а также и у нас в стране. Современная генетическая коллекция Drosophila melanogaster кафедры генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета формировалась с конца 50-х годов прошлого века, когда появилась возможность реанимировать генетику в нашей стране после периода расцвета лысенковщины. Первые линии привез в апреле 1957 г. на кафедру генетики и селекции Ленинградского государственного университета Илья Артемьевич Захаров благодаря содействию сотрудника Института биофизики АН СССР в Москве Марка Леонидовича Бельговского. В первую очередь появившаяся коллекция линий дрозофилы играла роль учебного материала для проведения практических занятий в рамках читаемого на кафедре курса «Общей генетики», а также служила научным материалом для выполнения студенческих курсовых и дипломных работ. Одновременно линии мух дрозофилы были использованы для проведения широкого круга научных исследований, во многом связанных с одним из направлений научной тематики кафедры, посвященной изучению механизмов мутационного процесса. В этих исследованиях, инициированных заведующим кафедрой генетики и селекции М.Е. Лобашевым, дрозофила служила моделью для доказательства роли физиологического состояния организма в протекании мутационного процесса. Большой вклад в развитие этих исследований внесли ученики М.Е. Лобашева — К.В. Ватти и М.М. Тихомирова. Эти ученые совместно со своими учениками наглядно продемонстрировали влияние пола особи, стадии развития организма и стадии дифференцировки половых клеток на частоту возникновения разного рода мутационных событий. Одним из важнейших результатов данных исследований на дрозофиле стала демонстрация существования предмутационных повреждений, которые могли быть выявлены с помощью оригинального подхода — совместного действия мутагенного и модифицирующего его результат немутагенного факторов. Данные исследования стали возможными благодаря существованию в коллекции линий мух, позволяющих выявлять и оценивать частоту таких мутационных событий, как нерасхождение и потери половых хромосом, сцепленные с полом рецессивные летальные мутации, транслокации и другие типы мутаций, а также линий мух с дефектами в работе различных систем репарации повреждений [1, 2].

Следует отметить, что генетические коллекции дрозофилы являются не статическим поддерживаемым материалом, а постоянно пополняются вновь выявляемыми мутациями и синтетически создаваемыми генетическими линиями, а также материалом, получаемым в результате длительной селекции. Цели селекции чрезвычайно разнообразны и определяются теми направлениями исследований, которые представляются наиболее актуальными в конкретный период времени. Остановимся на двух примерах, которые наглядно демонстрируют значение генетической коллекции дрозофилы в формировании новых направлений исследований на кафедре генетики и селекции, ныне кафедре генетики и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного университета.

В далеком 1966 г. по рекомендации М.Е. Лобашева был начат уникальный по масштабам селекционно-генетический эксперимент, направленный на изучение последствий отбора по адаптивно-важным признакам у дрозофилы. Возглавил эту работу Л.З. Кайданов, под руководством которого студенты, аспиранты и сотрудники кафедры на протяжении более пяти десятилетий вели отбор дрозофилы по признаку низкой половой активности самцов [3]. В результате кропотливой работы удалось получить свыше полутора тысяч поколений линии мух с низкой половой активностью самцов и родственных ей линий инбредного разведения. Таким образом, были созданы многочисленные линии, различающиеся по одному и тому же неадаптивному признаку. Полученный материал далее позволил сделать весьма важные выводы в отношении последствий отбора по данному признаку.

Среди наиболее значимых результатов данной работы следует отметить факт сохранения наследственной гетерогенности в низкоактивной линии, несмотря на десятки поколений инбредного разведения. Оказалось, что искусственный отбор по адаптивно важному признаку в минус-направлении ведет к повышению мутабильности линии, на что указывает накопление понижающих жизнеспособность рецессивных мутаций, причем преимущественно в хромосоме 2 дрозофилы [4]. Возвратный отбор на повышение половой активности (высокоактивная линия) приводил к снижению груза вредных мутаций и, напротив, накоплению супервитальных мутаций.

С целью выявления источника повышенной скорости мутирования в селектируемых линиях был осуществлен анализ содержания мобильных генетических элементов в геномах низкоактивной линии и родственных ей линий [5]. Показано, что геномы этих линий несут разнообразные ретротранспозоны, распределение которых в пределах отдельных хромосом не меняется на протяжении сотен поколений поддержания линий в коллекции. Последующий анализ коллекции линий, родственных низкоактивной и различающихся по уровню приспособленности, выявил определенные закономерности в перемещениях мобильных генетических элементов по геному, которые были связаны с результатами отбора в разных направлениях. Для уточнения роли мобильных генетических элементов в отборе по адаптивному признаку был проанализирован мобильный генетический элемент hobo. Оказалось, что высокоактивные и низкоактивные линии дрозофилы различаются по качественному и количественному составу копий hobo-элемента [6].

Таким образом, созданная Л.З. Кайдановым на кафедре генетики и биотехнологии коллекция высокоинбредных родственных линий дрозофилы, различающихся по репродуктивной функции, стала основой для развития нового направления не только в стенах кафедры генетики и селекции, но и в целом в генетике, связанного с изучением генетических последствий тесного инбридинга и отбора. Дрозофила, в свою очередь, предоставила уникальную модель для практики селекционной работы в силу всеобщности организации и функционирования генетического материала живых организмов.

Вторым уникальным примером создания коллекции генетических линий дрозофилы, послужившими становлению еще одной научной тематики кафедры, является работа М.М. Тихомировой по селекции мух на термоустойчивость. Продолжением ранее проводимых исследований в области мутагенеза стало изучение роли адаптации к высокой температуре в мутационном процессе. С этой целью в 1980 г. была выведена теплоустойчивая линия Т, способная жить и размножаться при температуре 32°C, что выше пороговой температуры для вида Drosophila melanogaster. Использование линии Т давало возможность оценить влияние генотипической и онтогенетической адаптации к повышенной температуре в процессе возникновения мутаций. Генотипическая и онтогенетическая адаптации были смоделированы путем стрессового температурного воздействия 37°C на мух линии Т и мух линии дикого типа, развитие которых проходило в разных температурных режимах. В итоге, было показано, что температура 37°C становится шоковой для мух, развивающихся как при 25°C, так и при 32°C. Для термоустойчивых мух более слабое температурное воздействие (33 или 35°C) не являлось стрессовым [7]. Полученные данные по реакции термоустойчивых мух на стрессовое воздействие определили дальнейшее направление исследований в плане изучения роли белков теплого шока в защите организма от повышенной температуры. Для этого была выбрана еще одна линия дрозофилы, характеризующаяся наличием теплочувствительной мутации l(1)ts403 с нарушением синтеза белков теплового шока [8]. Ранее было показано, что у данного мутанта блок в синтезе белков теплового шока происходит на посттранскрипционном уровне. Теплочувствительная мутация l(1)ts403 оказалась аллелью гена sbr (small bristles). Ген sbr, в свою очередь, является ортологом эволюционно-консервативного гена Nxf1, который отвечает за ядерный экспорт мРНК. На этом основании стало понятным, что нарушение синтеза белков теплового шока связано с дефектом экспорта мРНК генов теплового шока [9]. В настоящее время в коллекции кафедры генетики и биотехнологии имеется восемь линий, несущих мутации разной молекулярной природы в гене sbr дрозофилы (DmNxf1). Среди них мутантная аллель sbr¹² представляет собой делецию протяженностью 30 нуклеотидов [10], что приводит к летальности в гомозиготе и поддержанию мутации с помощью балансерной хромосомы FM6. Аллель sbr⁵ также представляет собой делецию размером в 494 п. о., которая удаляет конец экзона 8, начало экзона 9 и интрон между ними [11]. Она, как и аллель sbr¹², летальна в гомозиготе и поддерживается на балансере FM6. Делеция Df(1)v^L4 удаляет ген sbr и в гомозиготе ее эффект связан с летальностью. Аллель sbr¹⁰ является теплочувствительной мутацией l(1)ts403 и характеризуется серией точковых замен. В частности, замена С на Т в положении 416 нуклеотидной последовательности приводит к замене пролина на лейцин в положении 139 аминокислотной последовательности в РНК-связывающем домене [12]. Эту мутацию можно охарактеризовать как условную теплочувствительную леталь. При секвенировании аллели sbr¹ не было выявлено изменений в кодирующей части гена, ее фенотипический эффект проявляется в нарушении структуры скутеллярных щетинок вплоть до их отсутствия. Характеристика мутантных аллелей гена sbr дрозофилы (DmNxf1) продемонстрировала широкий плейотропный эффект, который проявляется в нарушении расхождения хромосом в мейозе у самок [13], нарушении формы веретена в мейозе [11], цитокинезе, индукции мужской стерильности [14], аномалиях поведения мух [15]. Обнаруженные эффекты свидетельствуют о полифункциональности продуктов данного гена и их участии в фундаментальных клеточных процессах. Далее выяснилось, что экспорт мРНК из ядра в цитоплазму — не единственная функция белка DmNxf1. Применение современных молекулярно-цитогенетических методов позволило использовать мутантные по гену sbr (DmNxf1) линии в качестве модели для изучения роли белка DmNxf1 не только в ядерно-цитоплазматическом экспорте мРНК, но и в эмбриогенезе, нейрогенезе, контроле расхождения хромосом.

Одно из направлений исследования функций гена sbr (DmNxf1) касается изучения его влияния на продолжительность жизни имаго. На одном из этапов работы были использованы самки разных генотипов: sbr¹²/FM6, sbr⁵/FM6, sbr^del/FM6 (с делецией гена sbr), sbr¹, стандартные лабораторные линии дикого типа Oregon-R и Cаnton-S, а также гибридные самки C-S/FM6 (+/FM6) и sbr^del/C-S (sbr^del/+) (см. рис. 1).

 

Рис. 1. Максимальная продолжительность жизни самок Drosophila melanogaster разных генотипов. *p <0,05 — статистически значимые различия между показателями максимальной продолжительности жизни мух сравниваемых генотипов.

Fig. 1. Maximum lifespan of Drosophila melanogaster females of different genotypes. *p <0.05, statistically significant differences between the maximum lifespan indices of flies of the compared genotypes.

 

У самок генотипа sbr⁵/FM6 отмечена тенденция к снижению максимальной продолжительности жизни. Выявлено различие в максимальной продолжительности жизни самок генотипов sbr⁵/FM6 и sbr¹²/FM6. Известно, что эти мутации влияют на структуру белка (SBR⁵ — делеция 57 аминокислот, SBR¹² — делеция 10 аминокислот), повреждая NTF2-связывающий домен и влияя на взаимодействия с белками-партнерами. Скорее всего, эффект мутации sbr⁵ вызван протяженной делецией, которая значительно изменяет структуру белка и ведет к изменению его функций. Следует отметить значительный эффект аллели sbr¹, присутствие которой в гомозиготе приводит к двукратному снижению продолжительности жизни у самок. По-видимому, эта мутация затрагивает регуляторные области гена sbr (DmNxf1), что может обусловливать изменение экспрессии гена и, в свою очередь, нарушать транспорт мРНК. Очевидно, что нарушение транспорта мРНК сказывается на всех клеточных процессах и может приводить к снижению жизнеспособности.

Таким образом, использование линий, несущих мутации разной молекулярной природы в гене sbr дрозофилы (DmNxf1), позволяет изучать специализированные цитоплазматические функции белка DmNxf1, по-видимому, связанные с транспортом и сохранением в нетранслируемом состоянии особых мРНК или их деградацией. Одна из ближайших целей наших исследований в этой области — изучение влияния мутаций гена DmNxf1 на формирование рибонуклеопротеиновых комплексов, а также выявление белков-партнеров и РНК-мишеней, необходимых для правильного протекания нейрогенеза.

Неразрывная цель университетского образования — активное привлечение студентов в научно-исследовательскую работу преподавателей. Данный подход направлен на подготовку будущего ученого, что требует навыков развития у учащихся логики постановки эксперимента, формирования способности к анализу, критическому оцениванию результатов эксперимента. На протяжении долгого времени базовым в генетическом образовании студентов кафедры был курс «Генетический анализ», при этом обязательным условием его проведения наряду с чтением лекций служило логическое дополнение практической частью обучения. Величайшей заслугой в создании курса «Генетический анализ» на кафедре генетики и селекции является неоценимый вклад доцента Василия Сергеевича Федорова во всю систему генетического образования у нас в стране. Он стал первым разработчиком и лектором этого курса, который впервые был прочитан на кафедре генетики и селекции ЛГУ в трудные времена гонения на генетику в нашей стране. В последующем эстафета была подхвачена талантливыми преподавателями кафедры К.В. Ватти, М.М. Тихомировой, В.С. Михеевым, Л.А. Мамон.

На начальных этапах становления курса его практическая часть включала знакомство с методами генетического анализа с привлечением объектов из разных систематических групп. Ставилась задача продемонстрировать универсальность генетических закономерностей с учетом биологических особенностей экспериментальных объектов и в связи с этим специальных методов проведения анализа. Среди биологических объектов были представлены рожь, томаты, арабидопсис, дрожжи. Таким образом закладывалась база для последующей успешной работы выпускников в самых разных областях генетики.

В связи с бурным развитием генетики в последние десятилетия, особенно ее молекулярно-методического арсенала, значительным образом реформировался и учебный план кафедры. Многие аспекты, обсуждаемые в рамках теоретической и практической составляющих курса генетического анализа, трансформировались в самостоятельные учебные дисциплины. Неизменной осталась та практическая часть курса, которая посвящена дрозофиле.

Данный практикум, наряду с подробным описанием биологии объекта — Drosophila melanogaster, характеристиками разнообразия ее мутантных форм, описанием различных методических аспектов, ставит перед обучающимися задачу постановки и проведения экспериментов, иллюстрирующих отдельные разделы генетического анализа. Богатство мутантных линий дрозофилы, которые поддерживаются на кафедре генетики и биотехнологии, позволяет разнообразить учебный материал практикума в соответствии с изменением постановки задач для студентов. В первую очередь студенты на практике осваивают классические методы выявления разного рода мутационных событий: летальных мутаций в половой Х-хромосоме и больших аутосомах дрозофилы, нерасхождение и потери половых хромосом, транслокации между аутосомами. Среди разнообразия экспериментальных задач предлагаются задания по взаимной локализации нескольких летальных мутаций в половой Х-хромосоме, а также определение характера наследования нескольких мутаций одновременно в случае их взаимодействия и локализации в половой хромосоме и аутосоме. Решение задач заканчивается оформлением отчета — по сути первой цензовой работы в процессе обучения, которая подготавливает к дальнейшим этапам защиты выпускных квалификационных работ. Оценивая важную роль дрозофилы как объекта в обязательной подготовке специалистов-генетиков в 2019 г. в помощь студентам было выпущено специальное пособие «Генетический анализ у дрозофилы».

В последние годы еще один общий курс базового генетического образования на кафедре претерпел свои изменения. Речь идет о курсе «Цитогенетика». Если первоначально данный предмет рассматривался как исключительно лекционный курс, то в настоящее время он расширился за счет практической части. И в этом случае немаловажную роль сыграла дрозофила, демонстрируя свои первоклассные качества как цитогенетический объект. На примере дрозофилы студенты имеют возможность познакомиться с разными типами хромосом (митотическими, мейотическими, политенными), самостоятельно приготовить прижизненные препараты, проанализировать их на современной микроскопной базе, зафиксировать материал для последующего анализа.

Большая роль коллекции дрозофилы, которую она играет в учебном процессе кафедры, не ограничивается только курсами «Генетический анализ» и «Цитогенетика». Общий курс генетики является базовым в подготовке биологов университета независимо от специализации. В этой связи традиционно в рамках этого курса несколько практических занятий отводится темам классической генетики в рамках разделов «Менделизм» и «Морганизм». В частности, с большим интересом студенты воспринимают занятия, посвященные темам сцепленного с полом наследования и кроссинговера, которые им предлагают на примере наследования у дрозофилы. Генетическая коллекция предоставляет материал для подготовки этих тем, который может меняться в зависимости от потребностей времени.

Реформирование генетического образования поставило задачу создания новых курсов, демонстрирующих прикладные аспекты генетики. На кафедре среди таких новых дисциплин можно назвать курс «Генетическая токсикология», который направлен на ознакомление с подходами по выявлению факторов окружающей среды, обладающих генетической активностью. В данном курсе, так же как и в упомянутых выше, теоретическую часть дополняют и иллюстрируют практические занятия. В рамках знакомства с различными тест-системами, применяемыми в генетической токсикологии, обязательным тест-объектом выступает дрозофила. Благодаря генетической коллекции кафедры студенты имеют возможность наглядно ознакомиться с рядом гостированных тестов, утвержденных Госпрограммами по тестированию факторов среды. Студенты самостоятельно проводят оценку генотоксического действия предлагаемых факторов, среди которых выступают широко применяемые лекарственные препараты, косметические средства, пищевые компоненты и т. д.

Любое научное исследование на дрозофиле всегда осуществлялось с привлечением студентов и аспирантов кафедры генетики. По материалам данных исследований было защищено 5 докторских диссертаций, 22 кандидатских диссертации, 14 магистерских, 17 бакалаврских выпускных квалификационных работ и более 30 дипломов специалистов. Генетическая коллекция дрозофилы, поддерживаемая на кафедре генетики и биотехнологии СПбГУ, была и остается бесценным материалом для продолжения традиционных и создания новых, современных направлений исследований. Созданная научная база позволяет осуществлять связь между образовательным процессом и исследовательской деятельностью, что является неотъемлемой чертой научной школы кафедры генетики СПбГУ. Материал, созданный и сохраняемый классическими методами генетики, открывает широкие возможности для применения самых современных молекулярно-генетических методов для выяснения тонких механизмов протекания генетических процессов. В свою очередь, столь популярные в последнее время биоинформатические подходы при сравнительной характеристике мутационных нарушений дрозофилы и подобных им у других организмов, включая человека, позволяют открывать пути эволюционных преобразований генетического материала, что имеет большое общебиологическое значение.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Личный вклад каждого автора: Л.В. Барабанова — написание и редактирование основного текста статьи, обсуждение результатов; Д.М. Грудкова — сбор и обработка материалов, анализ полученных данных, обсуждение результатов; Е.В. Голубкова — общее руководство, обсуждение результатов, написание и редактирование основного текста статьи.

Источник финансирования. Исследование поддержано грантом СПбГУ «Изучение генетических основ внутривидовой изменчивости, надорганизменных взаимодействий и таксономического разнообразия с использованием биоресурсных коллекций» (ID Pure 115624290).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии потенциального конфликта интересов, требующего раскрытия в данной статье.

Об авторах

Лариса Владимировна Барабанова

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: l.barabanova@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0001-9790-031X
SPIN-код: 3251-2823

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург

Дарья Максимовна Грудкова

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: st101672@student.spbu.ru
ORCID iD: 0009-0001-0070-0897
SPIN-код: 8220-9716
Россия, Санкт-Петербург

Елена Валерьевна Голубкова

Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: e.golubkova@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0002-9528-5760
SPIN-код: 7386-1230

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы