Analysis of the role of tonoplast H⁺-ATPase in elongation growth of coleoptile cells of rice seedlings with different growth rates under normoxia and submergence

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Способность к интенсивному росту можно рассматривать в качестве альтернативы изменению поведения животных, направленному на избегание повреждающего действия внешних стрессовых факторов. У растительных организмов, ведущих прикрепленный образ жизни, именно под синдромом «избегания» (low-oxygen escape syndrome, LOES) понимают одну из стратегий адаптации к затоплению [1]. Этот тип ответной ростовой реакции можно наблюдать у разных видов гидрофитных растений [2]. К их числу относят и широко востребованную сельскохозяйственную культуру — рис посевной (Oryza sativa L.), который обладает способностью прорастать и быстро расти в условиях затопления, преодолевая таким образом недостаток кислорода. При прорастании наблюдается ускорение роста такого ювенильного органа, как колеоптиль [3–5]. Этот видоизмененный лист злаков, замкнутый в трубку, имеет достаточно широкий спектр защитных реакций при подземном прорастании [6]. Наличие более длинного колеоптиля снижает или даже предотвращает повреждающее действие таких стрессовых факторов, как недостаток влаги, резкое понижение температур (заморозки), гербициды и даже грызуны [7–9]. У проростков риса эта защитная реакция приобретает совершенно особую форму. Гипотеза, которая была предложена еще в 1970-е годы, предполагает, что колеоптиль за счет интенсификации роста и быстрого достижения поверхности воды выполняет роль дыхательной трубки для плавания — «шноркеля» [10]. Эта гипотеза до сих пор сохранила свою актуальность [6, 11].

Рост колеоптилей осуществляется преимущественно за счет уникального для растительных клеток роста растяжением — многократного полярного (вертикального) удлинения. Этот процесс является кратковременным, и его интенсивность обеспечивается вектором осмотического давления при резком повышении эластичности клеточных стенок. Механизмы реализации и регуляции роста растяжением легли в основу теории кислого роста, до сих пор актуальной, несмотря на то что была сформулирована почти полвека назад [12, 13]. В условиях нормоксии считается доказанным роль ауксина в активации Н⁺-АТФазы плазмалеммы, что приводит к закислению клеточных стенок и, тем самым, активирует ряд механизмов, обеспечивающих удлинение клетки.

В то же время рост растяжением сопровождается интенсивной вакуолизацией. Однако представления о механизмах этого процесса еще во многом отрывочны. Не вызывает сомнения резкое усиление транспорта воды и осмотически активных соединений через тонопласт — вакуолярную мембрану. Определяющая роль в генерации мембранного потенциала на тонопласте принадлежит Н⁺-АТФазе вакуолярного типа (V-типа; КФ 3.6.1.3), широко распространенной в эукариотических клетках [14, 15]. Этот протон-транспортирующий мультисубъединичный фермент хорошо известен участием в адаптации растений к различным стрессорным воздействиям и даже получил название «эко-фермент» [16]. Показано, что состав изоформ, входящих в структуру вакуолярной Н⁺-АТФазы, имеет тканеспецифичность [16, 17]. Однако участие этой помпы в процессах роста, особенно в условиях недостатка кислорода, еще во многом неизвестны. Изменения могут быть связаны с регуляцией как на транскрипционном, так и на пост-трансляционном уровнях.

Цель исследования — сравнительный анализ интенсивности роста, экспрессии генов, кодирующих субъединицы B и E, а также их представленность в мембранах клеток колеоптилей проростков риса двух сортов, различающихся по интенсивности роста в условиях нормальной аэрации и при затоплении.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследований

Эксперименты проводили на колеоптилях 3-, 5- и 7-суточных проростков риса (Oryza sativa L.). Данные временные точки соответствуют началу, интенсификации и завершению роста колеоптилей соответственно. Эти сроки были отобраны на предварительном этапе исследования. В работе использовали семена двух сортов риса отечественной селекции, отобранные ранее: медленно растущий Аметист и быстро растущая Кубань 3 [5]. Семена поверхностно стерилизовали 50% раствором гипохлорита натрия в течение 15 мин, 10 раз промывали стерильной водой и замачивали в горячей воде (55°C) на 1 ч. Далее по 50 семян проращивали в гидропонных условиях на стеклянных мостках (контрольные растения) или создавали условия затопления в банках объемом 750 мл, как описано ранее [5]. Использовали 4% питательный раствор Кнопа [18]. Уровень измеряли с помощью анализатора растворенного кислорода «Эксперт-009» (Эконикс-Эксперт, Россия). Содержание кислорода в гипоксическом растворе не превышало 0,5–0,6 мг/л. Посуду и растворы для работы с растениями предварительно стерилизовали.

Для измерения длины колеоптилей проростки раскладывали в чашки Петри, сканировали с помощью HP ScanJet G2710 и оцифровывали изображения в программе ImageJ (версия 1.8.0_172) [5]. Для анализа использовали все проросшие растения из 50 посеянных.

Получение общей микросомальной фракции клеток колеоптилей риса

Общую микросомальную фракцию получали из клеток колеоптилей проростков сортов Аметист и Кубань 3 при температуре 4°C. Навеску растительного материала (около 1 г) гомогенизировали в среде, состоящей из 330 М сахарозы, 50 мМ Tris-HCl, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 5 мМ аскорбиновой кислоты и 5 мМ дитиотреитола (pH 7.8) [19]. Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин при 100 g на центрифуге (MPW-350R, Польша), после чего последовательно увеличивали скорость и центрифугировали 5 мин при 3000 g для отделения тяжелых клеточных элементов (ядра, фрагменты клеточных стенок), затем в течение 15 мин при 17 000 g для осаждения митохондрий. Полученный осадок гомогенизировали в среде, содержащей 300 мМ раствор сахарозы на 10 мМ буфере Tris–Mes (pH 7,2). Супернатант центрифугировали при 100 000 g на центрифуге Beckman Avanti J-30I (США) в течение 60 мин. Осадок (общая микросомальная фракция) гомогенизировали в среде, содержащей 300 мМ раствор сахарозы на 10 мМ буфере Tris–Mes (pH 7,2).

Денатурирующий электрофорез белков в полиакриламидном геле

Разделение белков проводили методом денатурирующего электрофореза в 10% полиакриламидном геле [20]. Перед нанесением проб на электрофорезные гели пробы выравнивали по содержанию белка, которое определяли методом Брэдфорда [21]. Белок из общей микросомальной фракции клеточных мембран осаждали 20% трихлоруксусной кислотой и растворяли в загрузочном буфере. На дорожку геля наносили 20 мкг белка. Для контроля разделения белков на геле использовали маркеры молекулярной массы PageRuler™ Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific, США). Электрофоретическое разделение белков проводили в буфере Tris–глицин (25 мМ Tris, 192 мМ глицин, 0,1% додецилсульфат натрия, pH 8,3) в системе Mini-PROTEAN (Bio-RAD, США) при 4°C.

Оценка содержания субъединиц В и E Н⁺-АТФазы тонопласта в составе общей микросомальной фракции клеток колеоптилей риса с помощью иммуноблот-анализа

После завершения электрофореза гели промывали трансфер-буфером. Далее проводили блот-перенос на нитроцеллюлозную мембрану (Bio-RAD, 0,45 мкм) системы Mini-PROTEAN (Bio-RAD) в течении 1 ч при 100 В и 250 мА по протоколу производителя. После переноса мембрану помещали в блокировочный буфер на 1 ч. Далее в течение ночи мембрану инкубировали в блокировочном буфере, содержащем первичные кроличьи антитела, специфичные для субъединиц В (AS09 503) и E (AS07 213) Н⁺-АТФазы тонопласта (Agrisera, Швеция). После этого проводили отмывку мембраны 5 раз по 5 мин в 25 мл блокировочного буфера. Вторичные поликлональные козлиные противокроличьи антитела, меченые пероксидазой хрена (AS09 602, Agrisera), растворяли в 25 мл блокирующего буфера с молоком. Мембрану, помещенную в раствор со вторичными антителами, держали при 37°C 1 ч на качалке. После промывки мембраны, пятна субъединиц Н⁺-АТФазы тонопласта на нитроцеллюлозной мембране проявляли с помощью 3,3-диаминбензидина, растворенного в фосфатно-солевом буфере (pH 5,8). После окрашивания мембрану сканировали. С помощью компьютерной программы PhotoM измеряли оптическую плотность и площадь пятен, отражающую интенсивность взаимодействия субъединиц Н⁺-АТФазы тонопласта с антителами. После чего эти параметры перемножали и выравнивали относительно контрольных (нормоксических) значений на 3-и сутки прорастания, принимая их за единицу.

Дизайн праймеров и проведение количественной ПЦР с детекцией в реальном времени

Для подбора праймеров использовали базы данных аннотированного генома риса (The Rice Annotation Project, RAP, https://rapdb.dna.affrc.go.jp/) и программное обеспечение VectorNTI Advanced v.11. Праймеры подбирали в соответствии с условиями проведения ПЦР в реальном времени с интеркалирующим красителем SYBR Green I (Евроген, Россия). Параметры праймеров: температура плавления 58–65°C; длина 20–30 нуклеотидов; образование шпилечных структур и димеров в паре праймеров с dG >–1 ккал/моль; GC-состав 40–60%. Для всех последовательностей интереса были подобраны специфичные праймеры. Специфичность праймеров проверяли при помощи алгоритма BLASTn NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Последовательности праймеров приведены в таблице 1. Праймеры синтезировали в компании BioBeagle (Россия, https://biobeagle.com/).

 

Таблица 1. Праймеры к генам интереса и сравнения

Table 1. Primers for genes of interest and comparison

Ген	Локус	Праймеры (5'–3')	Длина продукта, п. н.
OsVHA-B1	Os06t0568200	GTGAGGTATCAGCAGCCCGAGAA CCCGTAAGATCAGGAGTTGGATGTG	187
OsVHA-B2	Os01t0711000	CAATCCCAGTGAACGAACATACCCT TCTGAGCAGCAATTTCATTGTGTGG	143
OsVHA-E1	Os01t0659200	CCAAGCAGATCCAGCAGATGGTG TTGAACTCCTCCTCGGCGGA	91
OsVHA-E2	Os05t0480700	AGCAGATCCAGCAGATGGTCAGG TGATCCTCCGCTTCTCCGACTC	132
OsTUB4	Os01g0805900	GAACCATTTGATTTCTGCCACCA CGGTACTGCTGGGAGCCACG	171

 

Получение кДНК

РНК выделяли из колеоптилей проростков риса (в контрольном варианте удаляли листья, при гипоксии листья внутри колеоптиля не растут) на соответствующие сроки прорастания (3, 5 и 7 дней) с помощью реагента ExtractRNA (Евроген, Россия) в соответствии с протоколом производителя. ДНКазную обработку проводили с помощью ДНКазы (Thermo Fisher Scientific, США, 5 ед./образец) по протоколу производителя. Очищенную РНК растворяли в стерильной воде и хранили при температуре –80°C до анализа.

Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора MMLV RT kit (Евроген, Россия) в соответствии с протоколом производителя. Для синтеза кДНК брали 2 мкг РНК. Полученную кДНК разливали на аликвоты и хранили при температуре –80°C до анализа.

Анализ экспрессии генов, кодирующих субъединицы B и E Н⁺-АТФазы тонопласта

Для проведения количественной ПЦР с детекцией в реальном времени использовали Bio-Rad CFX96 REAL-TIME System (США, в ресурсном центре «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ) и набор детекции для ПЦР 5X qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия). Амплификацию проводили по следующей программе: 95°C — 5 мин; 95°C — 15 с; 60°C — 30 с; 72°C — 30 с; всего было 45 циклов. Регистрацию флуоресценции интеркалирующего красителя SYBR Green проводили в конце каждого цикла. Для получения относительного количества транскриптов из пороговых циклов амплификации (Ct) использовали метод 2^–ΔCt, а для получения степени изменения относительного количества транскриптов каждого гена — метод 2^–ΔΔCt [22]. Данные по количественной оценке анализируемого гена представлены в относительных единицах, рассчитанных при сравнении с уровнем экспрессии гена β-тубулина 4 (OsTub4). Изменение уровня экспрессии генов интереса рассчитывали относительно контрольных (нормоксических) значений на 3-и сутки прорастания, принимая их за единицу.

Статистическая обработка

Все эксперименты проводили в 4–8-кратной биологической и 3-кратной аналитической повторности за исключением иммуноблота, который повторяли в 3-кратной биологической повторности. Статистическую обработку данных проводили с помощью GraphPad Prism 8.0.1 для Windows. На рис. 1–3 приведены средние значения величин и их стандартные ошибки. Значения с разными буквами достоверно различаются при p <0,05 (взвешенное среднее Тьюки).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Колеоптили проростков риса сорта Кубань 3 в условиях нормоксии отличались интенсивным началом роста (на 3-и сутки достигали 10 мм), двукратным увеличением длины к 5-м суткам и дальнейшим прекращением удлинения на 7-е сутки (рис. 1). Колеоптили риса второго исследуемого сорта — Аметист — характеризовались гораздо меньшим удлинением, которое составило в среднем около 50% от такового у сорта Кубань 3 как на 3-и, так и на 5-е сутки. Позднее рост не компенсировался большей продолжительностью, а также заканчивался к 7-м суткам. Тем самым у обоих сортов характер роста был идентичен, но амплитуда такового у Аметиста была практически в 2 раза меньшей. Прорастание в условиях затопления приводило к изменению динамики роста. Следует отметить значительное ингибирование ростовых процессов на самом начальном этапе прорастания (к 3-м суткам) колеоптилей сорта Кубань 3. Еще более интересен факт последующей интенсификации удлинения, в результате которой на 5-е сутки прорастания в гипоксии длина сравнялась с детектированной в контроле. Отметим также продолжение, хоть и незначительное, роста на 7-е сутки при недостатке кислорода. Для колеоптилей проростков сорта Аметист также отмечено более чем двукратное торможение роста по сравнению с нормоксией. В дальнейший период с 3-х до 5-х суток рост усиливался и продолжался до 7-х суток. Тем не менее финальная длина колеоптилей Аметиста в конечной временной точке эксперимента была почти на 40% меньше.

 

Рис 1. Рост колеоптилей проростков риса двух сортов (быстро растущий сорт Кубань 3; медленно растущий сорт Аметист) в условиях нормоксии и гипоксии. Значения с разными буквами (a–d) достоверно различаются (взвешенное среднее Тьюки, p <0,05).

Fig 1. The growth of rice seedlings coleoptiles of two varieties (fast-growing variety Kuban 3; slow-growing variety Amethyst) under normoxia and hypoxia. Values with different letters (a–d) are significantly different (Tukey’s test, p <0.05).

 

Для последующего анализа представленности двух субъединиц вакуолярной Н⁺-АТФазы из клеток колеоптилей проростков риса получали общую микросомальную фракцию мембран, в которую входит тонопласт. Для данной серии экспериментов за единицу принимали количество белка изоформ интереса, анализируемых по интенсивности взаимодействия со специфичными антителами, на 3-и сутки развития в условиях нормоксии. Выявленные закономерности представлены на рис. 2. В колеоптилях обоих сортов риса была детектирована субъединица B V-Н⁺-АТФазы с молекуляной массой 55 кДа и субъединица E с молекулярной массой около 31 кДа (рис. 2, a). В условиях нормальной аэрации содержание субъединицы B резко возрастало (более чем в 2,5 раза) к 5-м суткам выращивания проростков сорта Кубань 3 (рис. 2, b). В ходе последующего развития (на 7-е сутки) оно возвращалось к исходному значению. Для колеоптилей проростков сорта Аметист детектирована близкая динамика содержания субъединицы B, но ее амплитуда была значительно слабее, а к 7-м суткам — ниже исходной точки (меньше единицы). Совершенно иными были изменения при проращивании проростков в условиях затопления. В мембранах клеток колеоптилей риса сорта Кубань 3 на 3-и сутки содержание субъединицы B было существенно меньше контрольного варианта. Далее была отмечена слабая тенденция к повышению, но значение так и не достигало единицы. Низкий уровень белка субъединицы B в составе эндомембран был детектирован и для колеоптилей сорта Аметист, причем на всех протестированных сроках они были близки к единице.

 

Рис 2. Изменение содержания белков субъединиц B и E Н⁺-АТФазы в составе микросомальной фракции клеток колеоптилей проростков риса двух сортов (быстро растущий сорт Кубань 3; медленно растущий сорт Аметист) в условиях нормоксии и гипоксии: а — вестерн-блот гибридизация проб белка микросомальной фракции с антителами против субъединиц B и E. 35 и 55 кДа — маркеры молекулярного веса; нор. — нормоксия, гип. — гипоксия. Отсканированные изображения характерных блотов; b — относительное изменение содержания белков. Значения с разными буквами (a–d) достоверно различаются (взвешенное среднее Тьюки, p <0,05).

Fig 2. Alteration in the content of proteins of B and E subunits of H⁺-ATPase tonoplast in the microsomal fraction of coleoptile cells of rice seedlings of two varieties (fast-growing variety Kuban 3; slow-growing variety Amethyst) under normoxia and hypoxia: a, western blot hybridization of microsomal fraction protein samples with antibodies against B and E subunits. 35 and 55 kDa, molecular weight markers; nor., normoxia, hyp., hypoxia; Scanned images of typical blots; b, relative change in protein content. Values with different letters (a–d) are significantly different (Tukey’s test, p <0.05).

 

В целом сходная тенденция была выявлена и для субъединицы E (рис. 2). В условиях достаточного снабжения кислородом в мембранах колеоптилей риса сорта Кубань 3 максимальное содержание белков интереса было выявлено на 5-е сутки развития, которое потом снижалось, но все равно шестикратно превышало таковое на 3-и сутки. Для сорта Аметист также была отмечена сходная нелинейная динамика содержания, но гораздо менее выраженная. Однако при затоплении изменение содержания субъединицы E было отличным от такового под действием нормоксии, а также от данных, полученных для субъединицы B. Отметим, что на 3-и сутки развития недостаток кислорода повышал содержание изоформы E в мембранах клеток колеоптилей проростков сорта Кубань 3. При этом на 5-и сутки содержание не изменялось и даже немного снижалось на заключительном временном интервале. Близкая тенденция была показана и для клеток колеоптилей проростков риса сорта Аметист. Таким образом, полученные данные об изменении изоферментного состава вакуолярной Н⁺-АТФазы соответствовали динамике роста колептилей в условиях нормоксии, однако значительно отличались от выявленной в условиях затопления.

В завершении проведенного нами исследования была проанализирована экспрессия генов, кодирующих субъединицы B и E в аналогичных условиях прорастания: нормоксии и гипоксии (рис. 3). Можно видеть, что накопление транскриптов гена OsVHA-B1 у сорта Кубань 3 имело нелинейную динамику с достижением максимума на 5-е сутки, причем при затоплении увеличение было наиболее значимым при переходе от 3-х к 5-м суткам развития. В клетках колеоптилей сорта Аметист характер изменений был совершенно иным: транскрипты накапливались постепенно и их уровень достигал максимума на 7-е сутки независимо от снабжения кислородом. Однако величина этих изменений также была выше при затоплении. Значительные отличия были выявлены при анализе транскрипции гена OsVHA-B2. Накопление транскриптов снижалось с возрастом проростков сорта Кубань 3, причем оно было более выраженным в условиях недостатка кислорода. А у проростков сорта Аметист динамика была прямо противоположной и достигала максимума на 7-е сутки и в условиях нормоксии.

 

Рис 3. Изменение относительного уровня накопления транскриптов генов OsVHA-B1, OsVHA-В2 и OsVHA-Е1, OsVHA-Е2 в колеоптилях проростков риса двух сортов (быстро растущий сорт Кубань 3; медленно растущий сорт Аметист) в условиях нормоксии и гипоксии. Значения с разными буквами (a–d) достоверно различаются (взвешенное среднее Тьюки, p <0,05).

Fig 3. Changes in the relative level of accumulation of OsVHA-B1, OsVHA-B2, OsVHA-E1, and OsVHA-E2 gene transcripts in coleoptiles of rice seedlings of two varieties (fast-growing variety Kuban 3; slow-growing variety Amethyst) under normoxia and hypoxia conditions. Values with different letters (a–d) are significantly different (Tukey’s test, p <0.05).

 

Обратимся теперь к гену OsVHA-Е1. Отметим, что существенных изменений при нормальной аэрации не наблюдалось у обоих протестированных сортов. Однако в условиях гипоксии в клетках колеоптилей наибольшее накопление транскриптов фиксировали на 5-е сутки у проростков сорта Кубань 3 и на 7-е сутки у проростков сорта Аметист. Особенно следует отметить динамику экспрессии гена OsVHA-Е2. Отсутствие изменения транскриптов в ходе развития проростков сорта Кубань 3 в контроле менялось кардинальным образом при затоплении: максимум отмечен на 3-и сутки, причем он почти в 9 раз превосходил таковой при нормоксии. У проростков сорта Аметист было зарегистрировано небольшое нелинейное изменение (максимум на 5-е сутки) накопления транскриптов в нормальных условиях, а в случае затопления содержание таковых постепенно увеличивалось с длительностью эксперимента и достигало 70-кратного повышения у 7-суточных проростков. Полученные данные указывают на то, что выявленные изменения экспрессии генов, кодирующих изоформы субъединиц B и E вакуолярной Н⁺-АТФазы имели динамику отличную от результатов, полученных в ходе бот-анализа.

ОБСУЖДЕНИЕ

Вакуолярная Н⁺-АТФаза представляет собой наиболее распространенный протон-транспортирующий фермент внутриклеточных мембран растительной клетки [23, 24]. Ее идентифицировали на мембранах эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, эндовезикулярной сети, но основная доля локализации Н⁺-АТФазы — тонопласт. Перечисленные компартменты отличаются более кислым рН, что делает незаменимой роль данного протонного насоса в обеспечении их функциональной активности. К числу важнейших процессов растительной клетки, в реализации которых принимает участие V-Н⁺-АТФаза тонопласта, можно отнести генерацию электрохимического потенциала ионов водорода на вакуолярной мембране и поддержание цитоплазматического рН-гомеостаза [17, 24].

Хорошо известно, что действие эндогенных и экзогенных факторов на растительные организмы начинается с понижения рН. Данная реакция столь часто детектируется у разных видов растений, в разных тканях и специализированных клетках, что позволяет рассматривать изменение цитоплазматического уровня Н⁺ и в качестве сигнала, и в качестве вторичного посредника в трансдукции разнообразных сигнальных каскадов [25]. Этот феномен неоднократно был продемонстрирован и в условиях недостатка кислорода [26, 27]. Закисление цитозоля при гипо- и аноксии происходит по нескольким причинам. Основная причина — низкая концентрация АТФ, снижающая активность протонных насосов плазматической мембраны и тонопласта [27]. Уровень АТФ в клетке истощается в течение 1–2 мин после переключения на анаэробный метаболизм [28]. Другим важным источником H⁺ является гидролиз АТФ и других нуклеозидтрифосфатов (НТФ) [27, 28], поскольку фосфат, пирофосфат и нуклеозидмонофосфат обладают большей ацидофицирующей активностью, чем НТФ. Возможные источники протонов — утечка из вакуоли, а также накопление интермедиатов и продуктов анаэробного метаболизма, преимущественно лактата [27, 29]. В тканях устойчивых растений ацидоз развивается медленнее и менее интенсивен [30, 31], что может быть связано с большей стимуляцией спиртового брожения вместо молочного [29] и с наличием альтернативных метаболических путей, обеспечивающих реокисление НАД(Ф)Н без аккумуляции токсичных анаэробных метаболитов [1, 29]. В результате гликолиз, переходящий в анаплеротические пути, обеспечивает производство АТФ, которая используется для поддержания активности протонных насосов плазматической мембраны и тонопласта. Биохимический pH-стат, состоящий из челнока карбоксилирующих/декарбоксилирующих ферментов, также участвует в регуляции pH [30]. Закисление цитоплазмы при действии аноксии было свойственно и клеткам колеоптилей риса [32]. Этот ювенильный орган, у способного к прорастанию при затоплении риса, резко увеличивается в длину, чтобы обеспечить «доставку» кислорода к затопленным тканям проростка. Тем самым поддерживается жизнеспособность растения риса, которое при восстановлении нормальной аэрации продолжает свое развитие [33]. При затоплении рост колеоптиля сквозь толщу воды более продолжителен, чем на воздухе, а следовательно, происходит его большее удлинение [34], что согласуется с нашими данными (рис. 1). Показано, что величина колеоптиля может указывать на большую жизнеспособность растений риса и обеспечивается на генетическом уровне [5, 35].

В нашем исследовании был выполнен сравнительный анализ двух сортов риса Кубань 3 (быстро растущий) и Аметист (медленно растущий) отечественной селекции, различающихся исходной интенсивностью роста колеоптилей при нормоксии. Максимальная длина у обоих сортов зафиксирована на 5-е сутки и далее рост останавливался (рис. 1). Полученные в дальнейшем результаты указывают на то, что даже при индуцированном гипоксией изменении динамики роста (продолжении роста до 7 сут), исходные различия по интенсивности удлинения между сортами сохранялись. Возникает вопрос, будут ли сохранены и все механизмы, обеспечивающие рост в столь кардинально различающихся по содержанию кислорода условиях. Рост растяжением сопровождается интенсивной вакуолизацией. Следовательно, можно ожидать, что и роль маркерного для вакуолярной системы протон-траспортирующего фермента может динамично меняться.

По своей субъединичной организации и по принципу ротационного катализа V Н⁺-АТФаза тонопласта эволюционно родственна АТФ-синтазам F типа [36]. В ее состав входят 13 субъединиц, организованных в два домена: V₀ и V₁ [24, 37]. В настоящее время накоплены сведения о функциональном значении различных субъединиц и о возможных механизмах их регуляции [16, 24]. Однако практически ничего неизвестно о возможном участии субъединиц V-Н⁺-АТФазы в обеспечении роста растяжением ни в условиях нормоксии, ни при затоплении.

Тем не менее для изоформ субъединицы VHA-Е, играющей важнейшую роль в ассоциации доменов V₁ и V₀ вакуолярной АТФазы, описано тканеспецифичное накопление на этапе эмбриогенеза арабидопсиса [38]. Было высказано предположение, что основная изоформа VHA-Е 1 относится к группе белков домашнего хозяйства и, по-видимому, участвует в обеспечении роста. Напротив, изоформа VHA-Е2 была идентифицирована исключительно в пыльце и возможно участвует в регуляции роста пыльцевой трубки [16, 39]. Ряд отрывочных данных позволяет заключить, что субъединица VHA-В, известная как нуклеотид-связывающая, но утратившая каталитическую функцию, имеет достаточно выраженное регуляторное значение благодаря способности связываться с цитоскелетом и ферментом гликолиза альдолазой [40, 41]. В то же время показано, что экспрессия генов, кодирующих эту субъединицу пшеницы, в арабидопсисе приводило к удлинению корней на фоне солевого стресса [42]. На основании приведенных выше данных именно эти субъединицы были выбраны для дальнейшего анализа.

Применение специфичных антител позволило оценить динамику содержания обеих субъединиц в микросомальной фракции, полученной из клеток колеопилей риса (рис. 2). Можно видеть, что в ходе аэробного развития пул субъединицы B менялся нелинейно и имел максимум на 5-е сутки развития, когда удлинение было максимальным. Изменения для сорта Кубань 3 были значительно более выражены по сравнению с сортом Аметист. Интересно отметить, что и для субъединицы E была выявлена та же закономерность. Особенно сильно (почти в 18 раз) усиливалось ее накопление у сорта Кубань 3 на 5-е сутки развития.

Недостаток кислорода при затоплении кардинальным образом менял выявленную динамику. В целом можно заключить, что содержание субъединицы B практически оставалось неизменным, независимо от сорта риса. Рассматривая субъединицу E, следует отметить небольшое увеличение ее представленности по сравнению с таковым на начальном этапе развития (3-е сутки). В дальнейшем изменений не отмечено ни у колеоптией быстро растущего сорта Кубань 3, ни у медленно растущего сорта Аметист. Из полученных данных можно заключить, что вовлечение вакуолярной Н⁺-АТФазы в обеспечение роста клеток колеоптилей при разном уровне снабжения кислородом различалось. Энергетическое голодание приводило к отсутствию ожидаемого накопления субъединиц B и E не только на 5-е, но и на 7-е сутки развития при затоплении, когда рост еще активно продолжался.

Тем самым особое значение приобретает анализ изменения экспрессии генов, кодирующих эти субъединицы. Следует отметить, что VHA-B и VHA-E кодируются малым семейством из 2 генов (OsVHA-B2, OsVHA-В2 и OsVHA-Е1, OsVHA-Е2). Показано, что динамика накопления продуктов транскрипции этих генов сильно отличалась от динамики содержания кодируемых белков (рис. 3). В условиях нормоксии в абсолютном большинстве случаев уровень экспрессии практически не менялся независимо от сорта и периода развития колеоптиля. Исключение составляет изменение экспрессии OsVHA-Е2 с максимумом на 5-е сутки развития и OsVHA-В2 с максимумом на 7-е сутки. Причем оба исключения относятся к проросткам риса сорта Аметист. Однако при подводном прорастании для большинства генов было продемонстрировано усиление экспрессии на 5-е и/или 7-е сутки, что может указывать на их участие в регуляции стресс-индуцированного роста. В этом варианте исключение составили гены OsVHA-В2 и OsVHA-Е2, но для проростков риса сорта Кубань 3. Выявленные различия можно объяснить несколькими причинами. Так, например, для изоформ VHA-Е уже было показано несоответствие между накоплением РНК-продукта и концентрацией кодируемого белка [43]. Отмечалась также возможность нескоординированной регуляции субъединиц A и B V-АТФазы на траснкрипционном уровне при засолении [44]. Важное значение может иметь и временной фактор. Для генов субъединицы E, транскрипция которых была детектирована только спустя 72 ч после начала засоления [45]. Тем не менее представленные результаты указывают на различия в регуляции экспрессии генов, кодирующих субъединицы B и E в ходе развития двух сортов риса, различающихся по нативной способности к росту, в условиях нормоксии и гипоксии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог, следует отметить, что на колеоптилях риса получены результаты, указывающие на различия, возникающие на экспрессионном и протеомном уровне для двух субъединиц (B и E) вакуолярной Н⁺-АТФазы в ходе роста растяжением клеток колеоптилей риса в норме и при затоплении. Тем не менее полного соответствия в характере изменения роста, представленности указанных субъединиц в составе эндомембран и интенсивность экспрессии кодирующих их генов не выявлено. Данный феномен может быть обусловлен различиями в регуляции на транскрипционном и пост-трансляционном уровнях.

Полученные данные свидетельствуют о целесообразности продолжения исследования функциональной значимости различных субъединиц Н⁺-АТФазы вакуоли в реализации роста растяжением, а также по выявлению механизмов временной координации регуляции работы протон-транспортирующего фермента на транскрипционном и протеомном уровнях.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Благодарности. Авторы выражают благодарность А.Д. Бертовой и А.В. Кондратьевой за помощь в проведении предварительных экспериментов. Исследования выполнены с использованием оборудования Ресурсного центра Санкт-Петербургского государственного университета «Развитие молекулярных и клеточных технологий».

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Личный вклад каждого автора: А.А. Кирпичникова — выращивание растительного материала, получение микросомальной фракции, блот-анализ, анализ полученных данных, написание текста; М.О. Бикташева — выращивание растительного материала, сбор и обработка материалов, анализ экспрессии генов; В.В. Емельянов — блот-анализ, анализ полученных данных, обзор литературы, написание текста статьи, внесение окончательной правки; М.Ф. Шишова — концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных, обзор литературы, подготовка текста статьи, привлечение финансирования.

Источник финансирования. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 22-14-00096, https://rscf.ru/project/22-14-00096/.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

About the authors

Anastasia A. Kirpichnikova

Saint Petersburg State University

Email: nastin1972@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5133-5175
SPIN-code: 9960-9527
Russian Federation, Saint Petersburg

Maria O. Biktasheva

Saint Petersburg State University

Email: togepi03@mail.ru
ORCID iD: 0009-0000-9263-7815
Russian Federation, Saint Petersburg

Vladislav V. Yemelyanov

Saint Petersburg State University

Email: bootika@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2323-5235
SPIN-code: 9460-1278

Cand. Sci. (Biology), Assistant Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

Maria F. Shishova

Saint Petersburg State University

Author for correspondence.
Email: mshishova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3657-2986
SPIN-code: 7842-7611

Dr. Sci. (Biology), Professor

Russian Federation, Saint Petersburg

References

Supplementary files