Селективная система на основе фрагментов вируса М1 для отбора трансформантов дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Дрожжи — гетерогенная группа микроорганизмов, которые в настоящее время привлекают внимание биотехнологов [1, 2]. Они находят применение в биотехнологии, в пищевой [3] и фармацевтической промышленности [4], а также в производстве биотоплива [5].

Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются идеальной генетической моделью. Для них разработаны методы генной инженерии, молекулярной биологии, биохимии, выделения и очистки белков [6]. Наличие селективных маркеров и соответствующих штаммов-реципиентов позволяет вводить в геном S. cerevisiae необходимые последовательности [7]. Использованию S. cerevisiae в биотехнологии способствует их статус GRAS (Generally Recognized As Safe) и устойчивость к низким рН [8]. Генетически модифицированные дрожжевые клетки служат биофабриками для производства целевых продуктов [9]. Одним из недостатков дрожжевых штаммов-продуцентов, используемых в промышленной биотехнологии, является наличие в составе плазмид генов устойчивости к антибиотикам, что может приводить к появлению устойчивых к антибиотикам природных микроорганизмов [10]. Поиск новых селективных маркеров дрожжей, не связанных с антибиотиками, является одной из актуальных задач. В этом отношении перспективным является использование в качестве селективного маркера киллер-токсина (микотоксина) дрожжей.

Впервые микоцины (киллер-факторы) были обнаружены у дрожжей S. cerevisiae [11]. Киллер-факторами называют белки, подавляющие рост чувствительных штаммов. Они имеют разнообразное строение и являются либо простыми белками, либо гликопротеинами. Киллер-факторы связываются с рецепторами, расположенными в клеточной стенке чувствительных дрожжей, и приводят к их гибели. Сами дрожжи-киллеры не чувствительны к собственному токсину. Киллерная активность может быть направлена не только против представителей своего вида, но и против широкого спектра эукариотических и прокариотических организмов [12].

Киллер-токсины обнаружены более чем в двадцати родах дрожжей, в частности у таких родов, как Hanseniaspora, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Ustilago, Williopsis и др. [13].

Лучше всего механизмы синтеза киллер-токсинов, способы их действия на чувствительные клетки и иммунность клеток-киллеров изучены у дрожжей S. cerevisiae. Было показано, что у дрожжей S. cerevisiae киллер-токсины синтезируются в клетках при наличии в цитоплазме днРНК-вирусов. Вирусы, обеспечивающие фенотип «киллер», принадлежат семейству Totiviridae, классу миковирусов. Один из них, вирус-помощник L-A, обеспечивает синтез оболочки вирусов. Другой, так называемый вирус-сателлит, один из днРНК-вирусов М (М1, М2, М28 или Мlus), кодирует токсин (K1, K2, K28 или Klus) [11]. Для синтеза эффективного киллер-токсина и формирования иммунитета клетки-хозяина необходимы оба вируса.

Синтез и созревание киллер-токсинов K1 и K28 изучены и подробно рассмотрены в статьях и обзорах [14–16]. Токсины синтезируются в виде препропептидов в цитоплазме, после чего транспортируются в эндоплазматический ретикулум, где происходит отщепление сигнальной последовательности (пре-), образование дисульфидных связей и гликозилирование. Формирующиеся пропептиды попадают в аппарат Гольджи, где происходит отщепление сигнальной последовательности (про-) и удаление γ-субъединицы.

Зрелые киллер-токсины секретируются в среду [17]. Способы их действия на чувствительные клетки различны. Токсин K1 в низких концентрациях запускает механизмы запрограммированной клеточной гибели. Он действует через белок-рецептор киллер-токсина Kre1р, белок кальциевых каналов Tok1р и митохондриальный белок Dnm1р. Это приводит к увеличению уровня активных форм кислорода (ROS) в клетке и инициирует апоптоз. При высоких концентрациях токсин K1 формирует в мембране каналы, что приводит к некрозу клеток [18]. Токсин K28 попадает в клетку за счет эндоцитоза и, двигаясь ретроградно по секреторному пути, направляется в цитоплазму. Здесь происходит его расщепление на α- и β-субъединицы. Субъединица α направляется в ядро, где ее активность блокирует синтез ДНК и деление клеток [19].

В данной работе разработана селективная система для трансформации дрожжей S. cerevisiae, где в качестве селективного маркера используется последовательность ДНК киллер-токсина. Применение киллер-токсина в качестве селективного маркера может способствовать расширению спектра биотехнологически интересных видов дрожжей и позволит получать штаммы-продуценты без применения плазмид, содержащих гены устойчивости к антибиотикам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Праймеры

Все праймеры, использованные в работе, представлены в табл. 1.

 

Таблица 1 Последовательности праймеров, использованных в работе
Название	Последовательность (от 5′ к 3′)
ScLEU2-5′-AvrII-F	CCTAGGAGTTCGAATCTCTTAGCAACC
ScLEU2-5′-AflII-R	TCTTAAGACACCTGTAGCATCGATAGC
ScLEU2-3′-AvrII-R	CCTAGGCCAGATCATCGTTATCCAG
ScLEU2-3′-AflII-F	GTGTCTTAAGAAGTTAAGAAAATCCTTGC
ScURA3-5′-AvrII-F	CCTAGGACATGAACAAACACCAGAGTC
ScURA3-5′-AflII-R	CCTTAAGAATCAGTCAAGATATCCACATG
ScURA3-3′-AvrII-R	CCTAGGTGGATTTGGTTAGATTAGATATGG
ScURA3-3′-AflII-F	GATTCTTAAGGGATGCTAAGGTAGAGG
PGAL-SacI-F	AAATGAGCTCGATCCACTAGTACGGATTAGAAG
PGAL-SalI-R	AAATGTCGACTTAATATTCCCTATAGTGAGTCG
αTOX-F	AAATAAAGCTTATGGAAGCGCCGTGGTATGACAAGATCTG
αTOX-R	AAATTGAATTCTTAAGCAACGGTAGCGCCATTAGGATCTG
LEU2-dR	ACCTTTGGATCCTCCTTTTTCTCCTTCTT
LEU2-dF	GAGGATCCAAAGGAATACAGGTAAGCAAAT
expαTOX-BHI-F	AATAGGATCCGGCGTAACCACCACACC
expαTOX-BHI-R	AATAGGATCCCGCAAATTAAAGCCTTCG
GFP-F	GGACTACTAGCAGCTGTAATACGACTCACTATAGGGAATATGGTGAGCAAGGGC
GFP-R	TCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTACTTGTACAGCTCGTCC

 

Плазмиды

Последовательности вирусов М1 и М28 (Приложение 1), фланкированные сайтами рестрикции BamHI/EcoRI и HindIII/EcoRI, были синтезированы (Eurofins Genomics, Германия) и клонированы в область полилинкера (MCS, multicloning site) вектора pEX-A128 (Eurofins Genomics, Германия). Таким образом, были получены плазмиды pEX-A128-М1, pEX-A128-М28. Последовательности вирусов М1, М28 проверены с помощью секвенирования по методу Сэнгера.

 

Приложение 1

Нуклеотидная последовательность M1:

GAAAAATAAAGAAATGACGAAGCCAACCCAAGTATTAGTTAGATCCGTCAGTATATTATTTTTCATCACATTACTACACCTAGTCGTAGCGCTGAACGATGTGGCCGGTCCTGCAGAAACAGCACCAGTGTCATTACTACCTCGTGAAGCGCCGTGGTATGACAAGATCTGGGAAGTAAAAGATTGGCTATTACAGCGTGCCACAGATGGCAATTGGGGCAAGTCGATCACCTGGGGTTCATTCGTAGCGAGCGATGCAGGTGTAGTAATCTTTGGTATCAATGTGTGTAAGAACTGCGTGGGTGAGCGTAAGGATGATATCAGTACGGACTGCGGCAAGCAAACACTTGCTTTACTAGTCAGCATTTTTGTAGCAGTTACATCCGGCCATCATCTTATATGGGGTGGTAATAGGCCGGTGTCGCAGTCAGATCCTAATGGCGCTACCGTTGCTCGTCGTGACATTTCTACTGTCGCAGACGGGGATATTCCACTGGACTTTAGTGCGTTGAACGACATATTAAATGAACATGGTATTAGTATACTCCCAGCTAACGCATCACAATATGTCAAAAGATCAGACACAGCCGAACACACGACAAGTTTTGTAGTGACCAACAACTACACTTCTTTGCATACCGACCTGATTCATCATGGTAATGGAACATATACCACGTTTACCACACCTCACATTCCAGCAGTGGCCAAGCGTTATGTTTATCCTATGTGCGAGCATGGTATCAAGGCCTCATACTGTATGGCCCTTAATGATGCCATGGTGTCGGCTAATGGTAACCTGTATGGACTAGCAGAAAAGCTGTTTAGTGAGGATGAGGGACAATGGGAGACGAATTACTATAAATTGTATTGGAGTACTGGCCAGTGGATAATGTCGATGAAGTTTATTGAGGAAAGTATTGATAACGCCAATAATGACTTTGAAGGCTGTGACACAGGCCACTAGGGCATCGTGTCTGACCTCTGATGCGATAACTCGACCCTACAGAGCACCGGGCTATATATAATATAGTAGGCACAAAATAAAATAAAAATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAGAGAGAGAAGAAGAAGAAGAAAAAGAAAAAACAAAAGAAACAGAAAAAGAGAGAACAGGACAACAAACGCAACAAAACACAAACACAAGCACACTCACCTTGAGTCTAACTGGTGGCACGCAGCATATCTCACCCTGAGACTAACTGGCGGCAGGCGACCGTGAGCATACAGCATGCCCCACTCGATTCGAGACGCGATTCGCGCTCGTAGGTATCGAGCGGCTACGTTGAGCTATTATGGCAGTGACATGCGATTCGCGCACTGCCAAGATCAGCTCAGCAAAGTTAAGACCAGTATCGGATATGGTAGACTACTACAATTCGCACAGGTATGAGATTCTCAGTCTAGTGTATGGATGAGTAGTTGAGCCAATGAATCTAGGGTTTAAATTACTATGCATTGACATATAGCAGGTACAAGCGTAGATAATACTTACTAGGCCCCAGCCGGTACACCCTGTATTGAATAAATACGACTATTTGGCCAGGTCTGGACGGGGCAGTCGAATTACTAGGTTGAGCACACACACGTGAATCACACAACATAACAGTGTAGGAACATAATGTGCCATTCGTAGTCTGAGACGCCGCTAGCCTGGTTTAATGCAACAGCATAGAAGAAACACACATCA

GAAAAAATTTGAATGGAGAGCGTTTCCTCATTATTTAACATTTTTTCAACAATCATGGTTAACTATAAATCGTTAGTTCTAGCACTATTAAGTGTTTCAAATCTCAAATATGCACGGGGTATGCCGACATCTGAGAGACAGCAGGGCTTAGAAGAACGTGACTTCAGTGCTGCTACTTGCGTACTGATGGGCGCAGAAGTAGGCTCATGGGGAATGGTTTATAGTGGTCAGAAGGTCGAGAGTTGGATCCTCTACGTTCTGACTGGCATTACTACGATGAGCGCAATCGTTGACGAAATTGACTATTATGCGTCACATATGCCACTGAGTGTTGTGGGTGAGAACTCAGGGCTACAAATCGTTCGTGATACCATAGTAACCTTGGTTATGGCTGGCCTGACAGCATCAGCTAACAAGGTAATCAGTAAGACTGAAAACGCAGAGAATATACAATCGCGTAGTCTTATACCGGGTCTGCTTAGTATGGATTATAACAGTACTCATACTATGGCGATTAATTTGGAAGACGTATTCTCGGAGCTCGGCTGGGACATCGATACTAGTGATAGCTCTGGTTTATACAAACGTGACGATAATTCTGTCACTCTGCACCTAGGGGACGTACCTGCTCTAGGCACCAGTAACACTATCATACCTAACGCTGTCATGCAAATATATAATAACGCATCATTTGCTTTCGGTTTTGCACCTCATAGCAACGGTAATTCTACAGGCTTGCAGAAACGAGCTAGTATTGATGATGCGGTGTGGTTACAATCTGCATACGGAATAGCTTATAGTGCCTGGATAGGCTCTGAGAATGTGGGTTCCTATGATCAGCATCTAGCTGAAGCTAACGGTATGGCTAACTACTGGACGTCCGAGTGTTCTAAGTACAATGGTGTCATCTGGGGTGACGAATCAGACGCCTGCGGTAACTGGCTAGCATCACAGCGTTTAGACATAGTGAGTCACTCAACAGGCAATTACTACAGAGACGTTAACCTCTGTGGTGACGACGAGGCAAGGTGCCACGATGAGCTACGCTAA TAGTCCAGACCGACGCTTCTTAGTTATGATCAGGCTGTGA

Нуклеотидная последовательность M28:

 

Конструирование плазмид pAL2T-delleu2 и pAL2T-delura3. Используя геномную ДНК штамма Y-1236 S. cerevisiae и пары праймеров ScLEU2-5′-AvrII-F/ScLEU2-5′-AflII-R и ScLEU2-3′- AflII-F/ScLEU2-3′-AvrII-R, амплифицировали последовательности, фланкирующие ген LEU2. Полученные фрагменты использовали для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами ScLEU2-5′-AvrII-F и ScLEU2-3′-AvrII-R. Фрагмент 5′-3′-leu2, содержащий 5′- и 3′-области гена LEU2, встраивали в вектор pAL2-T (Евроген) с помощью ТА-клонирования. Полученную плазмиду pAL2-T-5′-3′-leu2 обрабатывали рестриктазой AflII и дефосфорилировали.

Ранее нами была получена плазмида pPICZ-FLP (Приложение 2), содержащая ген флиппазы под контролем промотора гена АОХ1, ген устойчивости к антибиотику зеоцину, а также две последовательности сайтов FRT, разделенных сайтом рестрикции AflII. Используя праймеры PGAL-SacI-F и PGAL-SalI-R и плазмиду pYES2 (Thermo Fisher Scientific), амплифицировали последовательность промотора гена GAL1. Фрагмент обрабатывали рестриктазами SacI и SalI и встраивали в плазмиду pPICZ-FLP вместо промотора гена АОХ1. Полученную плазмиду pPICZ-P_GAL1-FLP обрабатывали рестриктазой AflII и лигировали с линеаризованной плазмидой pAL2-T-5′-3′-leu2. Структура итоговой плазмиды pAL2-T-delleu2 представлена на рис. 1, а. Аналогичным образом была получена плазмида pAL2-T-delura3. Для этого использовали пары праймеров ScURA3-5′-AvrII-F/ScURA3-5′-AflII-R и ScURA3-3′-AflII-F/ScURA3-3′-AvrII-R. Структуру плазмид проверяли с помощью ПЦР и рестрикционного анализа.

 

Рис. 1. Схема получения штаммов дрожжей S. cerevisiae с делециями в генах LEU2 и URA3: а — структура плазмиды pAL2T-delleu2; b — cхема получения ауксотрофного штамма 1-Y-1236 (Δleu2) при помощи системы FLP-FRT рекомбинации (штаммы 2-Y-1236 (Δura3), 1-Y-2177 (Δleu2) и 2-Y-2177 (Δura3) получали аналогично). Штаммы с двумя ауксотрофностями по лейцину и урацилу 3-Y-1236 (Δleu2 Δura3) и 3-Y-2177 (Δleu2 Δura3) получали путем использования штаммов с одиночной ауксотрофностью в качестве исходных

 

Приложение 2

Карта плазмиды pPICZ-FLP:

 

Нуклеотидная последовательность плазмиды pPICZ-FLP:

TTAAGGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCGGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGACATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATACACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAACACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTCGCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGTCTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAAGCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGGGTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCTGTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAACTAAGTTTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTTCCAAAAGTCGGCATACCGTTTGTCTTGTTTGGTATTGATTGACGAATGCTCAAAAATAATCTCATTAATGCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTGCACCTGTGCCGAAACGCAAATGGGGAAACACCCGCTTTTTGGATGATTATGCATTGTCTCCACATTGTATGCTTCCAAGATTCTGGTGGGAATACTGCTGATAGCCTAACGTTCATGATCAAAATTTAACTGTTCTAACCCCTACTTGACAGCAATATATAAACAGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTACTTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTAACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAACGTCGACATGCCACAATTTGATATATTATGTAAAACACCACCTAAGGTCCTGGTTCGTCAGTTTGTGGAAAGGTTTGAAAGACCTTCAGGGGAAAAAATAGCATCATGTGCTGCTGAACTAACCTATTTATGTTGGATGATTACTCATAACGGAACAGCAATCAAGAGAGCCACATTCATGAGCTATAATACTATCATAAGCAATTCGCTGAGTTTCGATATTGTCAACAAATCACTCCAGTTTAAATACAAGACGCAAAAAGCAACAATTCTGGA AGCCTCATTAAAGAAATTAATTCCTGCTTGGGAATTTACAATTATTCCTTACAATGGACAAAAACATCAATCTGATATCACTGATATTGTAAGTAGTTTGCAATTACAGTTCGAATCATCGGAAGAAGCAGATAAGGGAAATAGCCACAGTAAAAAAATGCTTAAAGCACTTCTAAGTGAGGGTGAAAGCATCTGGGAGATCACTGAGAAAATACTAAATTCGTTTGAGTATACCTCGAGATTTACAAAAACAAAAACTTTATACCAATTCCTCTTCCTAGCTACTTTCATCAATTGTGGAAGATTCAGCGATATTAAGAACGTTGATCCGAAATCATTTAAATTAGTCCAAAATAAGTATCTGGGAGTAATAATCCAGTGTTTAGTGACAGAGACAAAGACAAGCGTTAGTAGGCACATATACTTCTTTAGCGCAAGGGGTAGGATCGATCCACTTGTATATTTGGATGAATTTTTGAGGAATTCTGAACCAGTCCTAAAACGAGTAAATAGGACCGGCAATTCTTCAAGCAACAAACAGGAATACCAATTATTAAAAGATAACTTAGTCAGATCGTACAACAAGGCTTTGAAGAAAAATGCGCCTTATCCAATCTTTGCTATAAAGAATGGCCCAAAATCTCACATTGGAAGACATTTGATGACCTCATTTCTGTCAATGAAGGGCCTAACGGAGTTGACTAATGTTGTGGGAAATTGGAGCGATAAGCGTGCTTCTGCCGTGGCCAGGACAACGTATACTCATCAGATAACAGCAATACCTGATCACTACTTCGCACTAGTTTCTCGGTACTATGCATATGATCCAATATCAAAGGAAATGATAGCATTGAAGGATGAGACTAATCCAATTGAGGAGTGGCAGCATATAGAACAGCTAAAGGGTAGTGCTGAAGGAAGCATACGATACCCCGCATGGAATGGGATAATATCACAGGAGGTACTAGACTACCTTTCATCCTACATAAATAGACGCATTCTAGAACTATAGTGAGCATGCGTTTGTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTTCTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCACTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTTCCCTCTTTCTTCCTCTAGGGTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCTCGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCA CGTTTCTTTTTCTTGAAATTTTTTTTTTTAGTTTTTTTCTCTTTCAGTGACCTCCATTGATATTTAAGTTAATAAACGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCTATTACAACTTTTTTTACTTCTTGTTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAATCTAAGGGGCGGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTATAATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCCGGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGGCTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGGACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAACACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGGTCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCGAGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCGGCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTCGGAGATCCGTCCCCCTTTTCCTTTGTCGATATCATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCG CTCTAACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTTTTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTTTTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGAGAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGGAGACCAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATCAGATCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCC

 

Конструирование плазмид pYES2-M1 и pYES2- M28. В составе плазмиды pEX-A128-М1 фрагмент ДНК-вируса M1 фланкирован сайтами рестрикции BamHI и EcoRI, фрагмент ДНК вируса M28 в плазмиде pEX-A128-М28 — сайтами HindIII и EcoRI. Эти фрагменты были вырезаны и встроены в экспрессирующий вектор pYES2 с использованием соответствующих сайтов рестрикции. В плазмидах pYES2-M1 и pYES2-M28 полноразмерные последовательности ДНК-вирусов оказались под контролем промотора гена GAL1, индуцируемого добавлением галактозы в среду.

Конструирование плазмиды pAL2-T-P_GAL1-αTOX. Амплифицировали последовательности ДНК гена LEU2, используя пары праймеров ScLEU2-5′-AvrII-F/LEU2-dR и LEU2-dF/ScLEU2-3′-AvrII-R и хромосомную ДНК штамма Y-1236 S. cerevisiae в качестве матрицы. Полученные фрагменты очищали и их смесь использовали для проведения ПЦР с праймерами ScLEU2-5′-AvrII-F и ScLEU2-3′-AvrII-R. Итоговый фрагмент встраивали в вектор pAL2-T (Евроген) с помощью ТА-клонирования. В результате была получена плазмида pAL2-T-LEU2, содержащая полноразмерный ген LEU2, в 3′-область которого был внесен сайт рестрикции BamHI. Плазмиду pEX-A128-М1 использовали в качестве матрицы для амплификации последовательности ДНК гена токсина М1 с праймерами αTOХ-F и αTOX-R. Фрагмент был обработан рестриктазами HindIII и EcoRI и встроен в вектор pYES2. Плазмида pYES2-aTOХ была использована в качестве матрицы для проведения ПЦР с праймерами expαTOX-BHI-F и expαTOX-BHI-R. Полученный фрагмент обрабатывали рестриктазой BamHI и встраивали в плазмиду pAL2-T-LEU2. Итоговая плазмида pAL2-T-P_GAL1-αTOX содержала последовательность ДНК токсина вируса М1 под контролем промотора гена GAL1, встроенную в 3′-область гена LEU2 (рис. 2, b).

 

Рис. 2. Схема интеграции последовательности токсина вируса M1 в геном штаммов дрожжей S. cerevisiae и ее применения в качестве селективного маркера: a — структура плазмиды pAL2-T-P_GAL1-αTOX; b —схема получения штаммов 4-Y-1236 (LEU2-P_GAL1-toxM1 Δura3) и 4-Y-2177 (LEU2-P_GAL1-toxM1 Δura3), в геном которых была интегрирована последовательность ДНК-токсина вируса M1 под контролем регулируемого промотора гена GAL1; с — схема интеграции гена GFP, фланкированного последовательностями, гомологичными промотору гена GAL1 и терминаторной области гена CYC1

 

Штаммы

Штаммы дрожжей S. cerevisiae, использованные в данной работе, представлены в табл. 2. Также был использован штамм бактерий Escherichia coli DH5α (fhuA2 Δ(argF-lacZ)U169 phoA glnV44 Φ80Δ (lacZ)M15 gyrA96 recA1 relA1 endA1 thi-1 hsdR17).

Среды и условия культивирования. Для культивирования штаммов дрожжей использовали следующие среды. YEPD: 2 % глюкоза, 2 % пептон, 1 % дрожжевой экстракт, 2,4 % агар. YEPDS: 2 % глюкоза, 2 % пептон, 1 % дрожжевой экстракт, 2,4 % агар, 1М сорбитол, зеоцин 200 мкг/мл. MD и MGal (минимальные среды): 7,34 мМ KH₂PO₄, 0,95 мМ K₂HPO₄ · 2H₂O, 4 мМ MgSO₄ · 7H₂O, 0,9 мМ CaCl₂, 1,7 мМ NaCl, 37,85 мМ (NH₄)₂SO₄; витамины, микроэлементы; 2 % — глюкоза (MD) или галактоза (MGal), 2,4 % агар, аминокислоты и азотистые основания (если необходимо): лейцин, урацил — 40 мг/л. Для культивирования бактерий использовали среду LB: 1 % триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 170 мМ NaCl, бензилпенициллин — 5 · 10⁵ е.а./л. Штаммы S. cerevisiae выращивали при температуре 30 °C, E. coli — при 37 °C.

 

Таблица 2 Штаммы дрожжей S. cerevisiae, использованные в работе
Название	Генотип	Источник
Y-1236	MATa wt	ВКПМ
1-Y-1236	MATa ∆leu2	Данная работа
2-Y-1236	MATa ∆ura3	Данная работа
3-Y-1236	MATa ∆leu2 ∆ura3	Данная работа
Y-2177	MATa wt	ВКПМ
1-Y-2177	MATa ∆leu2	Данная работа
2-Y-2177	MATa ∆ura3	Данная работа
3-Y-2177	MATa ∆leu2 ∆ura3	Данная работа
4-Y-1236	MATa LEU2-PGAL1-toxM1 ∆ura3	Данная работа
4-Y-2177	MATa LEU2-PGAL1-toxM1 ∆ura3	Данная работа

 

Методы молекулярной генетики

В работе использовали эндонуклеазы рестрикции и фосфатазу FastAP (Thermo Fisher scientific Inc., США), Т 4-лигазу (Евроген, Россия), согласно рекомендациям производителей. Очистку ДНК из агарозных гелей и реакционных смесей проводили с помощью наборов Cleanup Standard (Евроген, Россия). Выделение плазмидной ДНК проводили с помощью наборов Plasmid Miniprep (Евроген, Россия). Для проведения ПЦР использовали наборы реактивов Encyclo Plus PCR (Евроген, Россия). Электрофорез фрагментов ДНК проводили в 0,7 % агарозном геле в буфере TAE [20]. Трансформацию бактерий E. coli и дрожжей — согласно [21, 22]. Выделение хромосомной ДНК из дрожжей S. serevisiae — по методике [23]. Секвенирование ДНК — с использованием BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Получение штаммов 3-Y-1236 и 3-Y-2177 с делециями кодирующих последовательностей генов LEU2 и URA3

В качестве исходных были использованы прототрофные штаммы S. cerevisiae Y-2177 и Y-1236 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), сверхчувствительные к киллер-токсинам. На первом этапе у штаммов Y-2177 и Y-1236 получали одиночные делеции в генах URA3 и LEU2 соответственно. Для этого использовали плазмиды pAL2T-delura3 и pAL2T-delleu2.

Фрагмент 5′LEU2-FRT-P_GAL1-FLP-ZeoR-FRT-3′LEU2 амплифицировали с помощью праймеров ScLEU2-5′-AvrII-F и ScLEU2-3′-AvrII-R, используя плазмиду pAL2T-delleu2 в качестве матрицы. Фрагмент очищали и трансформировали штаммы Y-1236 и Y-2177. Селекцию трансформантов проводили на среде YEPDS с антибиотиком зеоцином. В ходе трансформации за счет гомологичной рекомбинации происходила замена кодирующей последовательности гена LEU2 на кассету FRT-P_GAL1-FLP-ZeoR-FRT. На следующем этапе культуры полученных трансформантов инкубировали в течение 24 ч в жидкой среде с галактозой (MGal). В клетках происходил синтез флиппазы, которая вносит двунитевые разрывы в последовательности FRT. В результате происходило удаление кассеты FRT-P_GAL1-FLP-ZeoR-FRT из генома трансформантов. Клетки были высеяны на среду YEPD, после чего с помощью метода отпечатков среди полученных колоний были отобраны те, которые из-за удаления кассеты не росли на среде YEPDS с зеоцином. Полученные штаммы 1-Y-1236 (Δleu2) и 1-Y-2177 (Δleu2) не росли на среде MD без добавления лейцина, что свидетельствует об их ауксотрофности. Схема экспериментов приведена на рис. 1, b.

Аналогичным образом с использованием плазмиды pAL2T-delura3 были получены штаммы 2-Y-1236 (Δura3) и 2-Y-2177 (Δura3) ауксотрофные по урацилу. Далее были получены штаммы 3-Y-1236 (Δleu2 Δura3) и 3-Y-2177 (Δleu2 Δura3) с двумя ауксотрофностями. Наличие делеций подтверждали с помощью метода ПЦР, используя в качестве матрицы хромосомную ДНК штаммов 3-Y-1236, 3-Y-2177 и исходных штаммов Y-1236, Y-2177 в качестве контроля, и пары праймеров ScLEU2-5′-AvrII-F/ScLEU2-3′-AvrII-R и ScURA3-5′-AvrII-F/ScURA3-3′-AvrII-R.

Экспрессия полноразмерных вирусных геномов M1 и M28 в штаммах 3-Y-1236 и 3-Y-2177

Векторы pYES2-M1 и pYES2-M28 использовали для трансформации штаммов 3-Y-1236 (∆leu2 ∆ura3) и 3-Y-2177 (∆leu2 ∆ura3). Трансформанты отбирали по прототрофности по урацилу и анализировали появление киллерного эффекта. Для этого трансформанты этих штаммов 3-Y-1236 (∆leu2 pYES2-M1), 3-Y-1236 (∆leu2 pYES2-M28), 3-Y-2177 (∆leu2 pYES2-M1) и 3-Y-2177 (∆leu2 pYES2-M28) высевали на среды MGal, содержащие галактозу в качестве единственного источника углерода, на газоны контрольных штаммов, содержащих исходную плазмиду pYES2: 3-Y-1236 (∆leu2 pYES2) и 3-Y-2177 (∆leu2 pYES2).

На среде с галактозой происходит синтез киллерного белка, что приводит к подавлению роста чувствительных штаммов и формированию зоны лизиса. Результаты приведены на рис. 3. Экспрессия полноразмерных вирусных геномов не влияла на рост самих штаммов 3-Y-1236 (∆leu2 pYES2-M1), 3-Y-1236 (∆leu2 pYES2-M28), 3-Y-2177 (∆leu2 pYES2-M1) и 3-Y-2177 (∆leu2 pYES2-M28), так как они обеспечивают устойчивость к собственному токсину [11].

Наиболее выраженный киллерный эффект проявился у штамма 3-Y-1236 (∆leu2 pYES2-M1), синтезирующего вирус M1. Поэтому далее для создания селективной системы был выбран именно токсин M1.

 

Рис. 3. Фенотипы штаммов 3-Y-1236 (Δleu2 pYES2-M1) и 3-Y-1236 (Δleu2 pYES2-M28) на среде с газонами контрольных штаммов 3-Y-1236 (Δleu2 pYES2) и 3-Y-2177 (Δleu2 pYES2). Зона подавления возникает в результате действия киллер-токсинов

 

Использование последовательности токсина вируса M1 в качестве селективного маркера

Использованный ранее фрагмент ДНК (αТОХ 315 п. н.) киллер-вируса M1, который отвечает за синтез токсина [24], амплифицировали с помощью праймеров αТОХ-F и αТОХ-R. Получили плазмиду pAL2-T-P_GAL1-αTOX, содержащую один из фрагментов вируса M1 (αТОХ) под контролем промотора гена GAL1. Используя эту плазмиду в качестве матрицы, с помощью праймеров ScLEU2-5′-AvrII-F и ScLEU2-3′-AvrII-R амплифицировали фрагмент 5′LEU2-P_GAL1-αTOX-3′LEU2. Данным фрагментом трансформировали штаммы 3-Y-1236 и 3-Y-2177. Трансформантов отбирали по восстановлению прототрофности по лейцину. Схема эксперимента представлена на рис. 2, b. Полученные таким образом штаммы 4-Y-1236 (LEU2-P_GAL1-toxM1 ∆ura3) и 4-Y-2177 (LEU2-P_GAL1-toxM1 ∆ura3) характеризуются условной летальностью — они не растут на средах с галактозой, поскольку в этих условиях в их клетках происходит синтез токсина (рис. 4). Наличие интеграций проверяли с помощью метода ПЦР, используя пару праймеров αTOX-F/αTOX-R и геномную ДНК трансформантов 4-Y-1236 и 4-Y-2177 в качестве матрицы. В случае штамма 4-Y-1236 на среде с глюкозой наблюдали незначительное подавление роста, что может быть связано с особенностями регуляции глюкозной репрессии у данного штамма. Для дальнейшей работы использовали штамм 4-Y-2177.

 

Рис. 4. Рост штаммов 4-Y-1236 (LEU2-P_GAL1-toxM1 Δura3) и 4-Y-2177 (LEU2-P_GAL1-toxM1 Δura3), в геномы которых была интегрирована последовательность ДНК токсина вируса M1 под контролем регулируемого промотора гена GAL1, на средах с глюкозой и галактозой. Штаммы характеризуются условной летальностью — они не растут на средах с галактозой, поскольку в этих условиях в их клетках происходит синтез токсина. Высевали по 10 мкл суспензии 10⁴ и 10³ кл/мл

 

Так как на среде с галактозой в результате синтеза токсина происходит подавление роста штамма 4-Y-2177, следовательно ген токсина может быть использован в качестве селективного маркера. Для оценки возможности использования этого подхода при отборе трансформантов амплифицировали последовательность гена флуоресцентного белка GFP. Для этого использовали праймеры GFP-F и GFP-R, которые содержали на 5′-концах последовательности, гомологичные промотору гена GAL1 и терминаторной области гена CYC1. Полученный фрагмент очищали и использовали для трансформации штамма 4-Y-2177. Селекцию трансформантов проводили на среде MGal с галактозой. В ходе трансформации за счет гомологичной рекомбинации происходила замена последовательности, кодирующей киллер-токсин, на последовательность гена GFP (рис. 2, c). Полученные трансформанты способны расти на среде MGal с галактозой, что свидетельствует о замене последовательности токсина на последовательность гена GFP. Наличие интеграции гена GFP в геном трансформантов подтвердили с помощью ПЦР с праймерами expαTOX-BHI-F и GFP-R, а также с помощью метода флуоресцентной микроскопии (рис. 5).

 

Рис. 5. Проверка наличия интеграции гена GFP в геном трансформантов: a — результаты ПЦР с праймерами expαTOX-BHI-F и GFP-R и геномной ДНК штаммов: 1) 4-Y-2177; 3) 4-Y-2177 с интеграцией гена GFP, клон 1; 4) 4-Y-2177 с интеграцией гена GFP, клон 2. Размеры фрагментов соответствуют теоретически ожидаемому — 1343 п. о.; 2) маркер длин ДНК 1 kb (Евроген). b — схема расположения праймеров expαTOX-BHI-F и GFP-R; с — флуоресценция клеток исходного штамма 4-Y-2177 и штамма, трансформированного фрагментом GFP (клон 2)

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Дрожжи S. cerevisiae широко используются в биотехнологических процессах. Созданию штаммов-продуцентов, используемых в промышленном производстве, способствуют разнообразие методик трансформации дрожжей и доступность удобных систем селекции.

При конструировании плазмид для работы с S. cerevisiae используются гены URA3, LEU2, HIS3, TRP1 и другие гены, кодирующие различные ферменты метаболических путей дрожжей. Мутации в этих генах приводят к ауксотрофности по соответствующим аминокислотам или азотистым основаниям [25]. Плазмиды, используемые для получения штаммов-продуцентов, как правило, содержат бактериальные гены устойчивости к антибиотикам. Это позволяет успешно амплифицировать плазмиды в штаммах E. coli [26]. Также гены устойчивости к антибиотикам, например зеоцину, используются непосредственно для селекции дрожжевых трансформантов [27].

Однако в процессе создания штаммов-продуцентов наличие генов устойчивости к антибиотикам в плазмидах является проблемой. Использование антибиотиков для поддержания плазмид не рекомендуется при синтезе рекомбинантных белков для фармацевтического производства. Это связано с риском загрязнения антибиотиками конечных продуктов и попаданием ДНК, кодирующей устойчивость к антибиотикам, в окружающую среду [28, 29].

В связи с этим у бактерий, например, предпринимаются попытки замены генов устойчивости к антибиотикам в плазмидах на ген lgt, кодирующий (про)липопротеин глицерилтрансферазу. Этот фермент у бактерий участвует в биосинтезе бактериального липопротеина, и делеция этого гена летальна. Разработана система для получения продуцентов рекомбинантных белков, в которой ген lgt в хромосоме бактерий делетирован и интегрирован в плазмиду вместе с целевым геном. Потеря плазмиды приводит к гибели клеток [30].

В настоящей работе в качестве селективного маркера впервые использован киллер-токсин дрожжей М1. Это позволяет при создании штаммов-продуцентов обойтись без последовательностей, приводящих к устойчивости к антибиотикам.

Данная система селекции предполагает, что в качестве штамма-реципиента должен быть использован штамм, чувствительный к киллер-токсину.

На первом этапе в случае прототрофности штаммов в их геном вводятся делеции генов URA3 и LEU2. Затем в геном штаммов интегрируется конструкция, содержащая последовательность ДНК токсина вируса M1 под контролем регулируемого промотора гена GAL1. Для получения штамма-продуцента необходимо трансформировать штамм-реципиент амплифицированной кодирующей последовательностью гена интереса, которая фланкирована промотором гена GAL1 и терминатором гена CYC1. За счет гомологичной рекомбинации на среде с галактозой происходит замещение гена, кодирующего токсин, и производится отбор целевых трансформантов. При этом ген интереса окажется в составе генома трансформированного штамма под контролем промотора гена GAL1, что обеспечит его регулируемую экспрессию. Такой подход может быть использован для экспрессии рекомбинантных белков. Он способствует уменьшению распространения генов, кодирующих устойчивость к антибиотикам, уменьшая выброс антибиотиков в окружающую среду и освобождая конечные продукты (часто используемые в фармацевтике) от загрязнения потенциально вредными остатками антибиотиков. Кроме того, предложенная селективная система может быть использована как один из подходов к решению проблемы нехватки удобных селективных маркеров, возникающей при работе с новыми штаммами дрожжей.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ (проект № 18-04-01057).

Об авторах

Дмитрий Михайлович Музаев

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: dmmuzaev@yandex.ru

инженер

Россия, Санкт-Петербург

Андрей Михайлович Румянцев

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Email: a.m.rumyantsev@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0002-1744-3890
SPIN-код: 9335-1184
Scopus Author ID: 55370658800
ResearcherId: N-3546-2015

канд. биол. наук, младший научный сотрудник

Россия, Санкт-Петербург

Усама Раек Аль Шанаа

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»; Комиссия по атомной энергии Сирии

Email: oalshanaa@mail.ru

аспирант

Сирия, Санкт-Петербург; Дамаск, Сирия

Елена Викторовна Самбук

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: e.sambuk@spbu.ru
ORCID iD: 0000-0003-0837-0498
SPIN-код: 8281-8020
Scopus Author ID: 6603061322
ResearcherId: H-6895-2013

д-р биол. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы