Features of chromosome behavior in meiosis in the common wheat lines containing genetic material of tetraploid wheat species

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Мягкая пшеница (Triticum aestivum L.) является основной сельскохозяйственной культурой в странах СНГ. Растущий общемировой спрос на зерновые культуры диктует необходимость создания элитных сортов пшеницы, высоко адаптированных к ряду условий внешней среды без снижения такой важной агрономической характеристики, как качество зерна. Значительного усовершенствования пшеницы добиваются интрогрессией сегментов хромосом родственных видов злаковых с последующей передачей необходимых генов. Дикорастущие сородичи мягкой пшеницы T. aestivum L. регулярно вовлекаются в селекционный процесс для создания новых форм пшеницы с улучшенными свойствами, так как содержат генетические локусы, контролирующие устойчивость к биотическим и абиотическим факторам (Пшеницы мира,1987; Тимонова с соавт., 2012; Hajar, Hodgkin, 2007). Методом отдаленной гибридизации нами получены гибриды от скрещивания сортов мягкой пшеницы с дикорастущими видами рода Triticum (Орловская с соавт., 2011). Образование рекомбинантного генома пшеницы путем гибридизации с дикорастущими и близкородственными видами сопровождается комплексом структурных и функциональных перестроек, большая часть которых приводит к формированию гибридов с нестабильным геномом и ослабленной фертильностью. Изучение фенотипа рекомбинантных форм растений, молекулярно-генетической организации их генома, а также прохождения процессов мейоза является ключевым моментом для понимания того, как происходит формирование признаков злаковых культур. Проведенное ранее изучение гибридных линий T. aestivum/T. durum и T. aestivum/T. dicoccum по геномному составу показало, что линии достаточно сильно отличаются по данным SSR-анализа и С-окрашивания от образцов мягкой пшеницы, использованных в скрещиваниях (Леонова с соавт., 2013). Вполне вероятно, что это связано с реорганизацией гибридных геномов, сопровождающей формирование стабильных форм в процессе гибридизации. Целью данного исследования было изучение особенностей поведения хромосом в мейозе 14 линий мягкой пшеницы, полученных от скрещивания сортов T. aestivum с T. durum, T. dicoccum, T. dicoccoides, и оценка влияния геномного состава данных линий на их цитогенетическую стабильность. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использованы сестринские линии поколения F6-7, полученные от комбинаций скрещивания сортов мягкой пшеницы T. aestivum с образцами тетраплоидных видов T. durum, T. dicoccum, T. dicoccoides. Линии получены в Институте генетики и цитологии НАН Беларуси и отобраны на основании изучения наследования морфологических признаков и продуктивности в поколениях F1-F4 (Корень с соавт., 2011; Орловская с соавт., 2011). Изучение микроспорогенеза проводили на временных давленых препаратах. Колосья извлекали до выхода из листового влагалища, чтобы уловить все стадии мейоза, и фиксировали в этанол-уксусной смеси (3 : 1). Через сутки после фиксации материал переводили в 70%-й спирт, где он хранился до анализа при t = +2-4 °С. В качестве красителя использовали 2%-й ацетоорсеин. Для каждой комбинации скрещивания и исходной формы изучали по 30 пластинок метафазы I и по 50 пластинок следующих стадий мейоза: анафазы I и II, метафазы II, тетрад. Исследование препаратов проводили на микроскопе Ампливал (Карл Цейс, Йена) с объективом Апохромат 100× апертура 1,32 МИ. Статистический анализ полученных данных осуществляли с помощью программы Microsoft Excel. Выделение ДНК, микросателлитный анализ, полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и электрофорез фрагментов ПЦР проводили согласно ранее описанной процедуре (Леонова с соавт., 2005). Для генотипирования было использовано 140 микросателлитных маркеров (WMC, GWM и GDM), специфичных для генома мягкой пшеницы (Ganal, Röder, 2007; Somers et al., 2004). РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ЦИТОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГИБРИДНЫХ ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ Проведенный анализ стадии метафазы I выявил высокий уровень бивалентного спаривания хромосом у всех гибридных линий (табл. 1). Количество хромосом, входящих в состав бивалентов, варьировало от 97,1 % у линии 206-2 комбинации Pitic S62 × T. dicoccum до 99,7 % у линии 190/6-1 T. durum × Chinese Spring. Количество материнских клеток пыльцы (МКП) со 100%-м бивалентным спариванием у исследуемых линий находилось в пределах от 53,3 % (линия 190/6-1) до 93,3 % (линия 196-1) (данные в таблице не представлены). У всех проанализированных линий наблюдалось явное преобладание закрытых бивалентов над открытыми, что свидетельствует о высокой интенсивности процесса синапсиса гомологов (табл. 1). Наибольшим числом закрытых бивалентов характеризовалась линия 190/6-1, а наименьшим - линия 196-1. Метафаза I мейоза в норме характеризуется строгой ориентацией центромерных районов объединенных в биваленты хромосом к полюсам веретена деления. Строго ориентированные и расположенные в экваториальной области микроспороцита биваленты составляют метафазную пластинку. Основным типом нарушений на этой стадии мейоза является наличие унивалентных хромосом. Среди МКП с унивалентами у подавляющего большинства гибридных линий пшеницы модальным классом являлось сочетание 20II + 2I. Максимальное число унивалентов, обнаруженное для исследованного материала, равно четырем, чаще всего такие клетки встречались у линий комбинации T. durum × Chinese Spring. Если исходить из положения, что образующиеся в метафазе I униваленты являются основной причиной аномалий на последующих стадиях мейоза, то на стадии анафазы I у данных гибридных линий пшеницы следует ожидать незначительное количество нарушений. Одним из основных нарушений мейоза у исследованных линий в анафазе I являлось отставание одной или нескольких хромосом (преимущественно тех, которые в метафазе I находились в унивалентом состоянии) от основных анафазных групп деления (табл. 2). Униваленты, разбросанные вокруг метафазной пластинки, в анафазе I оказываются в экваториальной области микроспороцита. Большинство отставших унивалентов не достигают полярных групп и остаются в цитоплазме, образуя на стадии телофазы микроядра в клетках диад. В МКП с нарушениями количество отставших хромосом варьировало от 1 до 5, причем максимальное количество унивалентов отмечено только у одной линии 196-1 комбинации T. durum × Chinese Spring. Кроме этого основного нарушения поведения хромосом на исследуемой стадии у всех линий отмечены МКП с хромосомными мостами, количество которых варьировало от 5,0 до 22,0 %. Количество МКП без нарушений на стадии анафазы I находилось в интервале от 52,5 % (линия 196-1) до 85,7 % (линия 221-1). Если сравнить количество нарушений на стадии анафазы I с таковым на стадии метафазы II, то у гибридных линий пшеницы, как правило, наблюдалась тенденция к увеличению этого показателя. Основным нарушением на этой стадии мейоза, как и в метафазе I, являлось наличие хромосом, не включенных в метафазные пластинки (рис. 1 А). У исследованных линий количество таких хромосом варьировало от 1 до 4. У десяти линий модальным классом являлись МКП с одной хромосомой, не включенной в метафазную пластинку, у четырех - с двумя. Для всех линий выявлены МКП с асинхронным делением, процент которых варьировал в широких пределах от 1,3 (линия 190/6-1) до 33,3 (линия 206-2). Количество МКП без нарушений на стадии метафазы II составило 55,6 -80,0 % (табл. 2). Расхождение хромосом к полюсам во втором делении мейоза (анафаза II) сопровождалось отставанием отдельных хромосом, нарушением синхронности (рис. 1 Б), образованием мостов (рис. 1 В). У восьми линий чаще всего встречались группы клеток с одной отставшей хромосомой, у четырех - с двумя, у линии 184/1-6 наблюдалось равное количество МКП с одной и двумя отставшими хромосомами. В целом число отставших хромосом в анафазе II осталось на уровне предыдущей стадии и варьировало от 1 до 4. Количество МКП с хромосомными мостами изменялось от 1,7 до 12,0 %, причем у четырех линий данный тип нарушений не был выявлен. Как следствие этого, частота встречаемости МКП с мостами во втором делении значительно меньше по сравнению с первым. У всего исследованного материала обнаружены клетки с асинхронным делением. Максимальное число таких МКП характерно для линии 184/1-6 (20,7 %), минимальное - для линий 16-5 и 200-3 (1,7 %). Количество МКП без нарушений на стадии анафазы II было достаточно велико и варьировало от 55,0 до 80,0 % (табл. 2). Стадия тетрад является заключительной, и количество МКП без нарушений на этой стадии (так называемый мейотический индекс) - важный показатель нормального течения всего мейоза. Максимальный мейотический индекс (95 %) отмечен у линии 29 комбинации Рассвет × T. dicoccoides и линии 208-3 Pitic S62 × T. dicoccum, в то время как самый низкий показатель принадлежит линии 206-2 комбинации Pitic S62 × T. dicoccum (60,0 %) (табл. 2). Основным нарушением на данной стадии мейоза является наличие в тетрадах микроядер, количество которых варьировало в исследованном материале от 1 до 7, однако чаще всего образовывались тетрады с одним и двумя микроядрами (рис. 1 Г). Три линии 15-7, 196-1, 206-2 имели МКП, содержащие от 5 до 7 микроядер, однако частота встречаемости таковых была очень низкой и находилась на уровне 1,2-1,3 % от общего числа проанализированных клеток. Другим нарушением на стадии тетрад было наличие триад (1,2 %), которые наблюдались только у одной линии 184/1-6. Следует отметить, что линии, имеющие высокий показатель хромосомных ассоциаций на ранних стадиях мейоза, как правило, имели более высокое значение мейотического индекса. Изучение особенностей поведения хромосом в мейозе гибридных линий, полученных от скрещивания сортов T. aestivum с тетраплоидными видами пшениц, выявило небольшое количество аномальных клеток не только на стадии метафазы I, но и на заключительной стадии тетрад, которая является отражением нарушений в поведении хромосом на всех предшествующих стадиях. Таким образом, выявленная мейотическая стабильность у большинства гибридных линий пшеницы F6-7 обеспечивает формирование у них полноценных гамет и тем самым создает предпосылки для сохранения чужеродных интрогрессий в ряду последующих поколений. ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ ГЕНОМНОГО СОСТАВА ГИБРИДНЫХ ЛИНИЙ ПШЕНИЦЫ НА ИХ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ Анализ поведения хромосом в микроспорогенезе обнаружил различия по уровню цитологической стабильности как между различными комбинациями скрещивания, так и между линиями внутри одной и той же комбинации. Ранее генетическое разнообразие линии T. aestivum/T. durum и T. aestivum/T. dicoccum было изучено цитологическими и молекулярными методами с использованием 42 SSR-маркеров, картированных в геноме мягкой пшеницы (Леонова и др., 2013). Микросателлитные маркеры, входящие в этот набор и выбранные на основании анализа 998 образцов из мировой коллекции сортов мягкой пшеницы, характеризуются наиболее высоким уровнем полиморфизма (Huang et al., 2002). Этот набор маркеров эффективно используют в настоящее время для оценки биоразнообразия современных и стародавних сортов пшеницы и ее сородичей в различных регионах мира, в работах по паспортизации сортов, оценки чистоты и идентичности сортового материала, а также для генотипирования внутривидовых и межвидовых гибридов мягкой пшеницы (Huang et al., 2003; Хлесткина и др., 2004; Landjeva et al., 2006; Абугалиева и др., 2012). Результаты комплексного молекулярно-цитологического анализа гибридных линий пшеницы позволили предположить, что спектр изменчивости по уровню цитологической стабильности между изученными линиями является следствием различий по числу и локализации фрагментов геномов тетраплоидных пшениц в гибридном геноме. Для оценки генетического разнообразия обычно используют 1-2 полиморфных маркера на хромосому, что часто бывает недостаточно, особенно для оценки длин фрагментов интрогрессии при изучении гибридов, полученных в результате межвидовых скрещиваний. В работах авторов, анализирующих случайным образом отобранные селекционные линии пшеницы, показано, что для достоверной оценки параметров генетического разнообразия и установления филогенетических связей в группах образцов необходимо не менее 70 маркеров (Zhang et al., 2002; You et al., 2004). Поэтому ряд исследователей для большего покрытия хромосом маркерами и более высокой информативности увеличивают число используемых маркеров (Peng et al., 2009; Akrifat, Uncuoglu, 2013). Для более точной оценки протяженности фрагментов чужеродного генома в исследуемых линиях число SSR-маркеров было увеличено до 140, так, что на каждую хромосому геномов A и В приходилось от 7 до 12 маркеров. Число и хромосомная локализация фрагментов тетраплоидных видов пшеницы представлены в таблице 3. Сравнительный анализ гибридного материала показал, что линии, имеющие максимальное количество унивалентов, содержали в своем геноме наибольшее число чужеродных фрагментов. Так, у линии 196-1 T. durum × Chinese Spring, для которой выявлен самый низкий уровень бивалентного спаривания хромосом, отмечено наибольшее число интрогрессированных фрагментов среди исследованного материала - 12. У данной линии фрагменты чужеродного генома не обнаружены только в 4-й гомеологичной группе хромосом (табл. 3). Линии 208-3 и 213-1 комбинации Pitic S 62 × T. dicoccum характеризовались высоким уровнем цитологической стабильности (табл. 2), что согласуется с результатами оценки их геномного состава с помощью SSR анализа. Данные линии имеют высокое сходство как по хромосомной локализации фрагментов чужеродного генома, так и по их протяженности (табл. 3, рис. 2). Кроме того, число интрогрессированных фрагментов T. dicoccum в геноме данных линий было незначительно, что объясняет высокое значение их мейотического индекса (табл. 2). Проведенное ранее кариотипирование гибридов методом С-окрашивания хромосом подтверждает почти полное генетическое сходство линий 208-3 и 213-1 (Леонова с соавт., 2013). В отличие от линий 208-3 и 213-1, линия 206-2 комбинации Pitic S 62 × T. dicoccum обладала значительным количеством МКП с нарушениями на всех стадиях мейоза. Результаты молекулярного анализа также выявили значительные отличия по числу интрогрессированных фрагментов у данного материала. Линия 206-1 содержит 11 фрагментов генома T. dicoccum, в то время как линии 208-3 и 213-1 - только по 4 (табл. 3, рис. 2). Корреляции между числом чужеродных фрагментов и степенью нарушения процесса мейоза (или мейотической стабильностью) показаны и в публикациях других исследователей, выполненных на межвидовых гибридах (Гордеева и др., 2009; Zeng et al., 2013). Однако авторы утверждают, что число интрогрессий не всегда является критерием мейотической стабильности, особенно в случае отдаленных скрещиваний. Отдельные хромосомы могут оказывать значительное влияние на рекомбинационную способность. Это убедительно продемонстрировано результатами, полученными при изучении пшенично-ржаных замещенных и добавочных линий (Apolinarska, 2003; Chrząstek, 2003; Силкова и др., 2006). Литературные данные свидетельствуют, что микросателлитные праймеры, разработанные для T. aestivum, можно эффективно использовать для анализа геномов близкородственных видов и злаков из отдаленных таксономических групп (Sun et al., 1997; Korzun et al., 1999). Высокий уровень переносимости маркеров гексаплоидной пшеницы установлен для тетраплоидных видов пшеницы с геномами А и B, при изучении которых было показано что почти 90 % SSR-маркеров T. aestivum не только амплифицируют фрагменты в геномах T. durum, T. dicoccum и T. dicoccoides, но и являются полиморфными (Fahima et al., 2002; Teklu et al., 2006). В связи с высокой гомеологией хромосом A и В геномов тетраплоидных видов T. durum и T. dicoccum и мягкой пшеницы T. aestivum можно предполагать, что цитологическая стабильность линий, полученных от скрещивания этих видов, в большей степени зависит от числа и протяженности интрогрессированных фрагментов. Линии 15-7 и 16-5 (T. dicoccoides × Фестивальная) имели высокое значение мейотического индекса (90 и 91 % соответственно), одинаковое число хромосомных перестроек - 8, но отличались по хромосомной локализации интрогрессированных фрагментов. Из таблицы 3 видно, что данные линии различались по хромосомам 1 В, 2 А, 3 В, 4 А, 5 А, 5 В, 6 В и 7 А, что однако не вызвало существенных отличий по уровню цитологической стабильности между ними. Известно, что направление скрещивания оказывает влияние на успех межвидовой гибридизации. Так, в экспериментах по гибридизации в роде Triticum было показано, что, если мягкую пшеницу использовать как материнскую форму, то при скрещивании с диплоидными пшеницами завязываемость зерен ниже, чем в обратных комбинациях. Однако всхожесть полученных гибридных зерновок в данном случае выше (Таврин, 1989). Анализ результатов по скрещиванию гексаплоидных (2n = 42) и тетраплоидных (2n = 28) пшениц, полученных нами, подтвердил литературные данные о том, что оплодотворение протекает более успешно, когда опылителем является многохромосомный вид. Например, в комбинации, где в качестве материнского компонента скрещивания мы использовали T. persicum К11899, а в качестве отцовского - сорт пшеницы Тома, завязываемость составила 21,11 %, тогда как в обратной комбинации - 9,5 % (Khotyleva et al., 2010). Следует отметить, что проведенный анализ поведения хромосом в мейозе также выявил отличия по уровню цитологической стабильности для линий прямой и обратной комбинации скрещивания с участием сорта Chinese Spring и T. durum. Уровень цитологической стабильности для линий, при получении которых материнским растением выступала мягкая пшеница, был высоким и отличия между линиями по данному показателю были незначительны. В обратных комбинациях скрещивания, когда стабилизация ядерного генома гибридных линий происходила на фоне цитоплазмы тетраплоидных пшениц, наблюдаются более существенные различия между линиями по количеству МКП с нарушениями на разных стадиях мейоза. Такая же зависимость обнаружена нами ранее при изучении генетического разнообразия гибридных линий мягкой пшеницы T. aestivum/ T. durum и T. aestivum/T. dicoccum с помощью хромосом-специфичных микросателлитных (SSR) маркеров и С-окрашивания хромосом. Так, было установлено значительное генетическое сходство между линиями, при получении которых мягкая пшеница была использована в качестве материнского растения. В обратных комбинациях скрещивания, напротив, наблюдался высокий уровень дивергенции между сестринскими линиями, превышающий в ряде случаев 50 % (Leonova et al., 2013). Например, линии 183/2-2 и 183/1-6 комбинации Chinese Spring × T. durum очень близки как по уровню цитологической стабильности, так и по геномному составу (табл. 2, 3), в то время как линии 195-3 и 196-1 обратной комбинации скрещивания T. durum × Chinese Spring отличаются по поведению хромосом в мейозе (табл. 1 и 2). Кариотипирование данных линий также выявило их генетическое различие. Показано, что линии 195-3 и 196-1 сходны по хромосомам 1 А, 2 А, 3 А, 4 А, но значительно различаются по хромосомам 1 В, 5 А, 5 В, 6 В и 7 В, причем у линии 195-3 хромосома 5 В имеет характер распределения бэндов, сходный с хромосомой 5 В образцов T. durum (Леонова с соавт., 2013). Проведенные исследования показали, что осуществленная нами интрогрессия чужеродного генетического материала в геном T. aestivum не оказала негативного влияния на его мейотическую стабильность, так как количество аномальных клеток было невелико не только на стадии метафазы I, но и на заключительной стадии тетрад. Спектр изменчивости по уровню цитологической стабильности у изученных линий является следствием различий по числу и локализации фрагментов интрогрессии геномов тетраплоидных пшениц в гибридном геноме. Установлено влияние цитоплазмы на становление кариотипа у интрогрессивных линий пшеницы.

About the authors

Ol’ga Aleksandrovna Orlovskaya

Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus

Email: O.Orlovskaya@igc.bas-net.by
leading scientist, Ph.D., laboratory of ecological genetics and biotechnology

Irina Nikolaevna Leonova

Institute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: leonova@bionet.nsc.ru
senior scientist, Ph.D., laboratory of plant molecular genetics and cytogenetics

Elena Artemovna Salina

Institute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences

Email: salina@bionet.nsc.ru
heard of laboratory, Doctor in Biological Science, professor

Lyubov’ Vladimirovna Khotyleva

Institute of Genetics and Cytology of the National Academy of Sciences of Belarus

Email: L.Khotyleva@igc.bas-net.by
head scientist, academician, laboratory of ecological genetics and biotechnology

References

Supplementary files