Assessment of the state population gene pool of specially protected species Helicopsis striata (Mollusca, Gastropoda, Pulmonata) using DNA-markers

Full Text

Введение Исследование состояния природных популяций уязвимых видов является одним из основных направлений современного биомониторинга различных территорий. Одним из таких видов является Helicopsis striata Müller (улитка степная ребристая), который занесен в Красную книгу Белгородской области (Красная книга…, 2004) а также в охраняемые списки Польши, Чехии и Словакии (Ložek, 1980; Stępczak, 1999). Ареал вида охватывает территорию от Западной и Средней Европы до восточной Украины, Курской, Белгородской и Воронежской областей (Шилейко, 1978). В пределах Среднерусской возвышенности, где проходит восточная граница его ареала, вид обитает на сухих, хорошо прогреваемых склонах балок, как правило южной экспозиции с меловой почвой. Период основной активности приходится на апрель-май, а так же сентябрь. В это время в местах обитания можно наблюдать массовые скопления моллюсков. Летние месяцы улитки проводят, зарывшись в почву. H. striata относится к средиземноморской реликтовой группе ксерофильных моллюсков (Николаев, 1973). В исследованиях по восстановлению исторического прошлого биоценозов Европы вид используется в качестве индикатора сухих остепнённых экосистем (Sparks, 1953). На территории Среднерусской возвышенности часто является компонентом реликтовых ценозов, называемых «Сниженные Альпы» (Снегин, 2002). Цель работы. На основе анализа изменчивости RAPD- и ISSR-маркеров ДНК оценить состояние популяций H. striata на восточной границе его видового ареала в природоохранных целях. Актуальность данного исследования диктуется необходимостью пристального внимания к реликтовым сообществам меловых обнажений, которые в последние годы из-за реализации областной программы «Зеленая столица» подвергаются облесению, что ставит их на грань полного уничтожения. Материалы и методы Материалом для исследования послужили образцы тканей особей H. striata, хранящиеся в криобанке, созданном при лаборатории популяционной генетики и генотоксикологии НИУ «БелГУ». Выборки из популяций были сделаны во время экспедиции с 2006 по 2010 годы. Всего по ДНК-локусам было исследовано 694 особи H. striata из девятнадцати популяций (рис. 1, табл. 1). Анализ изменчивости проводили с использованием полимеразной цепной реакции - методы RAPD (Random amplified polymorphic DNA) (Welsh, McClelland, 1990) и ISSR (Inter simple sequence repeats) (Zietkiewicz et. al., 1994). Для анализа использовали два праймера: ОРА 1 (5΄-CAGGCCCTTC-3΄; метод RAPD), UBC 811 (5΄- (GA)8C-3΄, метод ISSR). Амплификацию проводили в термоциклерах MJ Mini и MyCycler (Bio-Rad, США). Метод RAPD. Реакцию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, ПЦР-буфер (10 мМ трис-НСl (рН 8,3), 50 мМ КСL, 2 мМ MgCl2), 0,25 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймера, 1 единица Taq ДНК полимеразы (ингибированной для горячего старта). Реакция проходила в следующих условиях: «горячий старт» -2 мин/94 °С, 35 циклов (денатурация - -45 с/94 °С, отжиг праймера - 15 с/36 °С, 15 с/45°С, синтез - 1 мин/72 °С), дополнительный синтез - 10 мин/72 °С, охлаждение до 4 °С. Метод ISSR. Реакцию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, ПЦР-буфер (67 мМ трис-НСl (рН 8,8), 16 мМ (NH4)2SO4, 5 мМ β-меркаптоэтанол, 7 мМ ЭДТА, 3 мМ MgCl2), 0,25 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймера, 1 единица Taq ДНК полимеразы (ингибированной для горячего старта). Реакция проходила в следующих условиях: «горячий старт» - 2 мин/94 °С, 40 циклов (денатурация - 30 с/94 °С, отжиг праймера - 30 с/55 °С, синтез - 2 мин/72 °С), дополнительный синтез - 10 мин/72 °С, охлаждение до 4 °С. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2%-м агарозном геле с использованием ТАЕ буфера (охлажденного до +4 °С), 10 В/см - 45 мин. Блоки окрашивали бромистым этидием. По картинам амплифицированных фрагментов, полученных в ходе электрофореза, составляли бинарные матрицы, где присутствие полосы обозначалось как «1» (аллель p), отсутствие «0» (аллель q). Ввиду того, что при использовании метода RAPD могут появляться неспецифические продукты амплификации, для анализа мы использовали четко просматриваемые и воспроизводимые ампликоны. Критерием воспроизводимости было повторное проявление амплификонов после ПЦР у одних и тех же исследуемых особей. У H. striata нами выделено по 17 локусов с использованием праймеров ОРА 1 и UBC 811. Полученные ДНК-паттерны и их расшифровка приведены на рисунке 2. Обработка полученных данных проводилась с использованием программы GenAlEx (Peakall, Smouse, 2001), POPGENE 32 (Yeh et al., 2000), MEGA5 (Tamura et al., 2011). Полигоны Дебеца были построены при помощи программы Statistica 6.0. Результаты и обсуждение На первом этапе был проведен тест на нейтральность Эвенса-Ваттерсона (Ewens, 1972; Watterson, 1978; Manly, 1985) используемых локусов, который показал, что по большинству аллелей (в среднем 88,7 %) нет статистически значимых отличий между наблюдаемой гомозиготностью по Харди-Вайнбергу и гомозиготностью, ожидаемой при нейтральном процессе (табл. 2). Анализ генетической изменчивости популяций H. striata мы проводили на фоне сопоставления с аналогичными данными, полученными нами ранее по двум фоновым видам наземных моллюсков, обитающих в районе исследования и являющихся индикаторами антропогенного влияния на экосистемы - Bradybaena fruticum (кустарниковая улитка) и Chondrula tridens (улитка трехзубая) (Снегин, 2010, 2011 а, 2011 б, 2012, 2013). Уровни генетической гетерогенности, а также графические полигоны исследуемых популяций, построенные с использованием частот q-аллеля, приведены в таблице 3 и на рисунке 3. Полученные данные демонстрируют картину во многом сходную с результатами, полученными нами ранее по исследуемым популяциям на основе изоферментным маркеров (Снегин, Сычев, 2011), согласно которым в зонах влияния горно-обогатительных комбинатов (ГОК), относящихся к Курской магнитной аномалии, в популяциях H. striata происходит снижение уровня изменчивости. Так, наиболее мономорфной по всем показателям изменчивости ДНК оказалась группа из пункта «Мелавое» (№ 11). Пониженная изменчивость зафиксирована также в пункте «Губкин» (№ 10), «Телешовка» (№ 12), «Хмелевое» (№ 13) и «Ямская степь» (№ 19). Причиной гомозиготности, по-видимому, является чрезвычайная раздробленность популяций ввиду активного освоения территории примыкающих к ГОК (создание карьеров, строительство дорог и путепроводов). Аналогичное снижение гетерозиготности наблюдали в степных биотопах «Нагольное» (№ 14) и «Калюжный яр» (№ 15)[1], где промышленные территории отсутствуют. Это, вероятно, вызвано тем, что уровень изоляции популяций моллюсков в степном биоме выше, т. к. количество пригодных биотопов в более аридном климате меньше и между ними существуют обширные территории непригодные для улиток. Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA) (Excoffier et al., 1992) по ДНК-локусам (табл. 4) выявил большую разобщенность между популяциями H. striata. 40 % изменчивости пришлось на межпопуляционные различия, при этом индекс дифференциации Фst = 0,404, а интенсивность потока генов Nm = 0,360 особи за поколение. Стоит отметить, что по аллозимным маркерам степень различий между популяциями была выше (Снегин, 2012; Снегин, Сычев, 2011). Соотношение межпопуляционной дисперсии (Vар) и внутрипопуляционной дисперсии (Vwp) было 50/50 %, при этом Фst = 0,497, Nm = 0,288. Эти данные значительно отличаются от аналогичных показателей, полученных для фоновых видов моллюсков (Снегин, 2012). Например, у Br. fruticum по локусам ДНК уровень дифференциации популяций Фst = 0,298, уровень потока генов Nm = 0,708, а соотношение Vар/Vwp = 30/70 %. У Ch. tridens - Фst = 0,185, Nm = 0,954, Vар/Vwp = 19/81 %. Оценка степени дифференциации популяций H. striata на основе модели, предложенной М. Неем (Nei, 1975) показала несколько меньшую разобщенность изучаемых групп в условиях лесостепи Gst = 0,358 (табл. 5). При этом средний поток генов оказался Nm = 0,895 особи за поколение. В основном это обеспечено более слабой дистанцией между группами по ISSR-маркерам. Наиболее полиморфными среди RAPD-маркеров являются локусы 4, 6, 8 и 14, а среди ISSR-маркеров более изменчивыми оказались локусы 4, 8, 10 и 13. В группу более мономорфных локусов вошли: по праймеру OPА 1 - локусы 1, 9, 16 и 17, а по праймеру UBC 811 - локусы 2, 9 и 17. Причем, стоит отметить, что в среднем ожидаемая гетерозиготность по RAPD локусам (Ht = 0,317 ± 0,005) достоверно не отличается от гетерозиготности по ISSR локусам (Ht = 0,328 ± 0,004). Известно также, что средние величины Gst соответствуют уровню генетической дифференциации при селективно-нейтральном процессе. В таком случае локусы с большими значениями Gst вероятнее всего могут испытывать действие дизруптивного отбора, а локусы с низкими показателями индекса подразделенности подвержены влиянию стабилизирующего отбора (Динамика популяционных генофондов…, 2004). Согласно полученным данным, наибольшая дифференциация между популяциями зафиксирована по локусам ОРА1-1, -5, -10, -11, -12 и UBC 811-6. Кластерный анализ, результаты которого показаны на рисунке 4, продемонстрировал, что популяции H. striata в районе исследования расходятся по трем географически обособленным группам. Исключение составила лишь популяция их Луганской области (пункт 16), которая по соотношению частот аллелей оказалась ближе к популяциям из района истоков р. Северский Донец (пункты с 1 по 9 и 18). Не исключено, что это является следствием либо генетического дрейфа в этой сильно изолированной популяции, либо ошибкой выборки. Стоит отметить также, что подобную картину дивергенции популяций по кластерам, с небольшими отклонениями, мы наблюдали по локусами аллозимов (Снегин 2012; Снегин, Сычев, 2011). Данные кластеризации во многом подтверждаются графиком прямолинейной регрессии (рис. 5), который демонстрирует достоверную корреляцию между логарифмами географических расстояний Dg между группами и логарифмами попарных показателей уровня потока генов Nm, вычисленных через попарные индексы дифференциации Фst (RDNA = 0,571 ± 0,052, t = 10,9, p < 0,05)[2]. Аналогичная картина была получена нами ранее по аллозимам (RALL = 0,552 ± 0,053 t = 10,4, p < 0,05). При этом нужно отметить, что эта зависимость достоверно выше, чем у фоновых видов Br. fruticum (RALL = 0,059 ± 0,063; RDNA = 0,014 ± 0,063) и Ch. tridens (RALL = 0,112 ± 0,069; RDNA = 0,085 ± 0,069). Исходя из приведенных данных, можно утверждать, что популяционная структура H. striata в условиях юга Среднерусской возвышенности носит более упорядоченный характер и больше соответствует эффекту изоляции расстоянием (Wright, 1943). Это, вероятно, связано с особенностями биологии данного вида, приуроченного исключительно к сообществам меловых обнажений и обладающего ограниченными возможностями расселения в условиях сильно фрагментированного ландшафта, что не позволяет ему сформировать метапопуляционную структуру, которая характерна для фоновых видов Br. fruticum и Ch. tridens. Кроме того, наличие эффекта изоляции расстоянием в популяционной структуре H. striata может свидетельствовать в пользу снижения роли стабилизирующего (балансирующего) отбора в популяциях данного вида по ряду селективно значимых локусов. Генетическое сходство между популяциями внутри групп, особенно там, где наблюдается повышенная гомозиготность (в зоне ГОК или в степных биотопах), обеспечивается, вероятнее всего, не миграцией особей между популяциями, а тем, что в условиях изоляции в популяциях H. striata увеличивается частота гомозиготных комбинаций по одним и тем же аллелям, что было показано нами ранее на примере изоферментных маркеров (Снегин, 2012; Снегин, Сычев, 2011). Последнее, вероятно, обеспечивается сходными векторами естественного отбора в похожих условиях, а также дрейфом генов и процессами генетической революции в изолированных группах, когда селективную ценность получают гены, которые особенно жизнеспособны в гомозиготном состоянии (гены «солисты») и редки в открытых популяциях из-за доминирования в них так называемых «хорошо смешивающихся генов». (Майр, 1968). Уравнение прямолинейной регрессии, основанное на коэффициентах линейной функции между попарными оценками потока генов и географического расстояния между популяциями, использовалось нами также для расчета эффективной численности: log Nm = a+b·log Dg М. Слаткин (1993) показал, что эффективную численность популяции (для всех исследованных популяций в целом) можно получить как Ne = 10a, где а - коэффициент, полученный в уравнении. Результаты вычислений приведены в таблице 6. Согласно полученным данным, достоверных отличий эффективной численности, вычисленной по изоферментам, у трех видов не выявлено. А в отношении эффективного размера групп, рассчитанных на основе ДНК-маркеров, достоверно низкие значения оказались у Br. fruticum. Несколько иной результат был получен нами при вычислении эффективной численности с помощью интегральной модели основанной на значениях индекса подразделенности популяции (Wright, 1951): , где , где K - количество использованных популяций. Виду того, что для определения степени подразделенности популяций в данной работе нами вместо индекса Fst было задействовано два других интегральных и взаимозаменяемых показателя Gst и Фst, мы сочли возможным модифицировать указанную формулу, внося в нее поочередно значения этих индексов. Стоит отметить, что опыт подобных манипуляций был заимствован нами из работы по определению эффективной численности популяций C. vindobonensis, обитающих на территории г. Николаев (Крамаренко, Крамаренко, 2010). Результаты вычислений приведены в таблице 7. Среди видов моллюсков наибольший эффективный размер популяций имеет Ch. tridens, немного уступает ему Br. fruticum. В популяциях H. striata значения эффективной численности оказались достоверно ниже, чем у первых двух видов. Заключение Таким образом, популяционная структура H. striata в районе исследования больше соответствует естественной, исторически сформировавшейся структуре[3]. Предположительно H. striata мог проникнуть на Среднерусскую возвышенность в эпоху суббореального периода голоцена. Современные популяции этого вида сохранили в себе тот аллельный потенциал, который был характерен для девственного лесостепного ландшафта. Поэтому генетические процессы в популяциях H. striata, в силу его стенотопности, вероятно могут являться лучшими показателями сукцессионных изменений происходящих в естественных сообществах, чем это можно ожидать, используя для этих целей эврибионтные фоновые виды, которые активно адаптируются к влиянию человека. Кроме того, существует опасение, что в условиях антропогенной инсуляризации, со все продолжающимся в настоящее время разрушением уникальных меловых биотопов, на фоне значительного снижения аллельного разнообразия, особенно в промышленных зонах, может произойти вымирание изолированных групп этого реликтового вида.

About the authors

Edward Anatoljevich Snegin

Belgorod national research university

Email: snegin@bsu.edu.ru
Dr. Biol. Sci., senior lecturer, head of department of biocenology and ecological genetics

References

Supplementary files