Obtaining of interspecific hybrids for pea introgressive breeding

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Горох (Pisum sativum L.) является важной зернобобовой сельскохозяйственной культурой умеренного климата. Селекция гороха на высокую и стабильную урожайность, устойчивость к биотическим и абиотическим стрессорам, высокое содержание и качество запасных белков является основным условием повышения конкурентоспособности культуры (Ali et al., 1994; Бобков, Уварова, 2010). Молекулярно-генетические исследования выявили парадоксально узкий генетический базис современных сортов гороха (Baranger et al., 2004). Вовлечение в селекционный процесс новых аллелей хозяйственно-ценных признаков дикорастущего гороха позволит повысить генетическое разнообразие исходного материала для селекции новых сортов (Ellis, 2011; Smykal et al., 2011). Существуют два пути переноса полезных генов (аллелей) в элитные селекционные линии гороха - генетическая инженерия и интрогрессия из геномов диких родичей (Ellis, 2011). Генетическая инженерия является дорогим и недостаточно разработанным на горохе методом. Межвидовая гибридизация приводит к интрогрессии как полезных, так и нежелательных для коммерческих сортов генов. Поэтому при интрогрессии генов интереса следует принять меры по блокировке переноса нежелательного генетического материала. Использование беккроссов с сортами и элитными селекционными линиями способствует селективной интрогрессии ценных генов. Указанные стратегии переноса генетического материала не являются исключительными и имеют перспективу для комбинированного использования. Вид P. fulvum среди дикорастущих родичей гороха является важным источником новых аллелей хозяйственно-ценных признаков. Размер генома у вида P. fulvum составляет 108,9 % от Р. sativum (Baranyi et al., 1996). Этот вид интересен для использования в селекции гороха на устойчивость к болезням, вредителям и абиотическим стрессорам (засуха, экстремальные температуры) (Ochatt et al., 2004; Byrne et al., 2008; Clement et al., 2009). Корни растений P. fulvum проникают в почву с высокой скоростью на большую глубину (Ali et al., 1994). Из литературных источников известно, что межвидовая гибридизация гороха сталкивается с проблемой репродуктивной несовместимости (Ben-Ze’ev, Zohary, 1973; Bogdanova, Kosterin, 2007) и отличается низкой эффективностью скрещиваний (Ochatt et al., 2004). Значительная филогенетическая дивергенция между видами P. sativum и P. fulvum проявляется в достаточно сильной репродуктивной изоляции (Ben-Ze’ev N., Zohary D., 1973; Ellis, 2011; Smykal et al., 2011; Zaytseva et al., 2012). Если в скрещиваниях Р. sativum × P. fulvum возможно получение гибридов (Ochatt et al., 2004; Byrne et al., 2008; Fondevilla et al., 2010; Бобков, Лазарева, 2012), то в обратном направлении гибридизация сталкивается с выраженной несовместимостью. В научной литературе сообщается как о получении нежизнеспособных семян (Ben-Ze’ev N., Zohary D., 1973) так и об одном гибридном растении, полученном в результате проведения 100 скрещиваний (Bogdanova, Kosterin, 2007). Несмотря на определенные успехи в интрогрессии генов устойчивости P. fulvum в геном культурного вида (Fondevilla et al., 2010), репродуктивная изоляция ограничивает использование межвидовых гибридов в селекции гороха. Преодоление барьеров межвидовой несовместимости является первостепенной и важной задачей (Ochatt et al., 2004). Исходя из того, что разные гены интереса могут находиться в различных образцах P. fulvum (Byrne et al., 2008; Fondevilla et al., 2010) исследование межвидовой несовместимости необходимо проводить с учетом генетического разнообразия дикорастущего вида. Эту работу можно совместить с поиском и идентификацией образцов, которые являются источниками хозяйственно-ценных признаков. Цель работы состояла в исследовании особенностей межвидовой гибридизации гороха с использованием широкого набора образцов дикорастущего вида для создания интрогрессивных линий Р. sativum с включениями части генома P. fulvum в качестве источника новых генов и аллелей хозяйственно-ценных признаков. Проведена идентификация гибридов и уникального генетического материала P. fulvum с использованием электрофоретических спектров белков семян. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ В экспериментах использовали сорта Р. sativum ssp. sativum: Стабил (af, безлисточковый морфотип), Аист (листочковый морфотип) и линию ВИ 9402 (tl, акациевидный морфотип), а также образцы P. fulvum К2523, К6070, И592573, И582583, И592575, И592577, И592579, И592589, И582593, И592595, И592597, И592598, И592602, И592603, И592608, И592609, И592612, И592615, И592619, И592626, И592881, И609881, И609884 из мировой коллекции ВИР (табл. 1). Межвидовую гибридизацию гороха проводили в июне-июле 2012 и 2013 гг. в условиях тепличного бокса по реципрокной схеме. В направлениях Р. sativum × P. fulvum и P. fulvum × Р. sativum проведено 61 и 25 скрещиваний соответственно. Коэффициент корреляции между числом образцов P. fulvum, используемых в разных направлениях скрещиваний, равнялся 0,45 (p < 0,05). Для культивирования изолированных семяпочек и зародышей in vitro в направлении P. fulvum × Р. sativum проводили дополнительные скрещивания. По одному скрещиванию проведено в комбинациях И592595 × Стабил, И592583 × Стабил, И592602 × Стабил, И592612 × Стабил, И592589 × Аист, К2523 × Стабил. По три скрещивания проведены в комбинациях К6070 × Стабил и К2523 × Стабил, а в комбинации К2523 × Аист - 6 скрещиваний. В обратных комбинациях Стабил × К6070 и Стабил × К2523 проведено по одному скрещиванию. Изолированные семяпочки и зародыши, полученные в результате межвидовых скрещиваний, высаживали на агаризованные питательные среды для инициации морфогенного каллусогенеза, длительного субкультивирования регенерирующих каллусных тканей и получения растений-регенерантов (Bobkov, 2014). Семяпочки выделяли и высаживали на питательные среды в возрасте 4-6 суток. В комбинациях скрещивания К2523 × Аист и И592589 × Аист изолировали незрелые зародыши в возрасте 8 суток. При сравнении результативности скрещиваний в направлениях P. fulvum × Р. sativum и Р. sativum × P. fulvum учитывали число бобов и семян (в абсолютных значениях и пересчете на одно скрещивание), а также среднее число семян в 1 бобе (Kosterin, Bogdanova, 2014). Межвидовые гибриды идентифицировали по электрофоретическим спектрам индивидуальных семян и морфологическим маркерам вегетирующих растений. Для выделения и электрофоретического разделения белков семян в полиакриламидном геле применяли стандартный арбитражный метод ISTA (Конарев, 2000). Белки экстрагировали из муки в течение 20 часов при температуре 3-4 °С с помощью электродного буфера (ТРИС, глицин, додецил сульфат натрия), рН = 8,3. После центрифугирования 10 мкл экстракта переносили в ячейку планшетки, где смешивали с равным объемом буфера нанесения (додецил сульфат натрия, ТРИС-НCl, глицерин, β-меркаптоэтанол, бромфеноловый синий). Электрофорез проводили в полиакриламидном геле с использованием камеры для вертикального электрофореза VE-4 (Хеликон, Россия). Концентрация разделяющего геля - 12,5 %, концентрирующего - 5 %. Для идентификации уникальных компонентов P. fulvum использовали маркеры молекулярной массы 6,5-200 кДа (SIGMA-ALDRICH, США) (Shand et al., 2007). Анализ наследования белкового компонента 7 в электрофоретических спектрах проводили с использованием 19 семян гибридов F2. Оценку существенности различий проводили с использованием критерия Стьюдента (Доспехов, 1985). РЕЗУЛЬТАТЫ Результативность скрещиваний В наших опытах результативность гибридизации при использовании P. fulvum в качестве материнского компонента скрещивания была ниже, чем в обратной комбинации. В направлении Р. sativum × P. fulvum из 25 опыленных цветков были сформированы 9 бобов, которые в сумме содержали 20 семян (табл. 2). Число сформированных бобов и семян в пересчете на одно скрещивание равнялись 0,36 и 0,80 соответственно. В направлении скрещивания P. fulvum × Р. sativum в результате 61 скрещивания получили 4 боба и 13 семян. Число бобов и семян в пересчете на одно скрещивание равнялись 0,07 и 0,21 соответственно. Различия по числу сформированных бобов и семян между этими направлениями скрещиваний были статистически значимыми (p = 0,005 - 0,001). В направлениях скрещиваний P. fulvum × Р. sativum и Р. sativum × P. fulvum среднее число семян в бобе составило 3,25 и 2,22 соответственно. Выявлены результативные комбинации скрещивания. В направлении скрещиваний Р. sativum × P. fulvum семена были получены в комбинациях: Стабил × К2523, Стабил × К6070, Стабил × И592589, Стабил × И592595, Стабил × И592603, Аист × И592579, Аист × И582598. В направлении P. fulvum × Р. sativum семена получены в комбинациях: И592577 × Стабил, И692603 × Стабил, И582593 × Аист, И592602 × Аист (табл. 3). Результативные скрещивания в этом направлении приводили к формированию бобов с неразвитыми семенами. В комбинации И592577 × Стабил получили одно выполненное семя, которое оказалось жизнеспособным. Вегетирующее растение F1 И592577 × Стабил отличалось хорошим развитием (рис. 1). В культуре in vitro изолированных 8-дневных зародышей комбинации скрещивания И592589 × Аист получены морфогенные каллусы, регенерирующие каллусные ткани и растения-регенеранты. Идентификация межвидовых гибридов F1 гороха по компонентному составу белков электрофоретических спектров Индивидуальные семена гороха, полученные в результате межвидовых скрещиваний в комбинациях Стабил × И592603, Стабил × И592595, И592603 × Стабил, И582593 × Аист, И592602 × Аист подвергали электрофоретическому анализу (табл. 3). Полученные белковые спектры сравнивали со спектрами семян родителей. В комбинации скрещивания Стабил × И592603 анализировали спектры белков 7 индивидуальных семян предполагаемых гибридов (рис. 2). Во всех спектрах присутствовали белковые компоненты сорта Стабил и отцовского компонента скрещивания - образца дикорастущего вида P. fulvum И592603. Наличие в спектрах белковых компонентов обеих родителей служило индикатором гибридной природы полученных семян. В комбинации Стабил × И592595 анализировали спектры 3 индивидуальных семян предполагаемых гибридов. Во всех спектрах анализ выявил уникальные компоненты сорта Стабил и образца P. fulvum И592595 (рис. 4). Следовательно, все полученные семена были гибридными. В направления скрещиваний P. fulvum × P. sativum наблюдали формирование невыполненных семян. В комбинации И692603 × Стабил сформированы 4 семени, которые практически не содержали зародышей. Электрофоретический анализ показал отсутствие спектров. Два семени, полученные в комбинации скрещивания И582593 × Аист, также были невыполненными. Однако электрофоретический анализ выявил наличие спектров из наиболее многочисленных белков (рис. 3). Недостаточное количество белков не позволило провести сравнительный анализ полиморфных компонентов, необходимый для идентификации гибридов. В комбинации И592602 × Аист получили 6 семян (табл. 3). Одно семя было практически выполненным, а остальные 5 не содержали полноценных зародышей. Электрофоретический анализ белков сформированного семени выявил наличие в спектре 5 уникальных белковых компонентов сорта Аист (рис. 4). В спектре также присутствовали компоненты образца P. fulvum И592602, что позволило идентифицировать полученное семя как гибрид F1. Вегетирующее растение, полученное в комбинации скрещивания И592577 × Стабил, характеризовалось красными цветками и зубчатым краем прилистников, что свидетельствовало о его гибридной природе (рис. 1). Примечательно, что венчики цветков в бутонах первоначально имели светло-желтую окраску, а к моменту раскрытия приобретали красную пигментацию. Идентификация и интрогрессия генов уникальных белков P. fulvum При проведении сравнительного анализа электрофоретических спектров белков семян большое значение имеет поиск и идентификация уникальных компонентов у образцов дикорастущего вида P. fulvum, которые отсутствуют в спектрах сортов и линий культивируемого гороха Р. sativum. Уникальные белковые компоненты P. fulvum могут представлять белки, играющие важную роль в устойчивости растений к вредителям и болезням, а также служить маркерами генов хозяйственно-ценных признаков. Ранее в наших исследованиях был обнаружен белковый компонент 7 (нумерация проведена по реперным компонентам спектра сои), который отсутствовал у сортов и линий гороха и являлся уникальным для образца P. fulvum И509881. Было показано, что этот компонент наследовался в F1 в гибридных комбинациях 109 б × И609881, Стабил × И609881 (Бобков, Лазарева, 2012). Позднее компонент 7 был обнаружен в электрофоретических спектрах образцов P. fulvum К2523 и К6070, а также образца P. sativum sp. transcaucasicum К296. Для определения наследования компонента 7 проводили гибридизацию растений образца акациевидной формы гороха ВИ 9402 с образцом И509881. В результате скрещиваний были получены гибриды F1 и F2. Электрофоретическому анализу подвергали запасные белки индивидуальных семян гибридов F1 и F2. Компонент 7 присутствовал в спектрах всех гибридных семян F1. В спектрах 19 семян гибридов F2 наблюдали генетическое расщепление по этому компоненту (рис. 5). Фенотипы с наличием и отсутствием компонента 7 распределялись в соотношении 13 : 6. В соответствии с гипотезой моногенного доминантного наследования теоретическое расщепление соответствует отношению 3 : 1. Фактически расщепление составило 2,2 : 1. Сравнение результатов по критерию χ2 выявило совпадение фактического и теоретического расщеплений (χ2 факт = 0,44; χ205 = 3,84). Следовательно, наследование компонента 7 является моногенным и доминантным. ОБСУЖДЕНИЕ Существуют различные методы переноса нового генетического материала в селекционные линии - генетическая инженерия и межвидовая гибридизация. Генетическая инженерия является дорогостоящим и недостаточно разработанным на горохе методом (Ellis, 2011). Межвидовая гибридизация приводит к созданию материала, мало пригодного для использования в селекции вследствие параллельного переноса хозяйственно-ценных и нежелательных генов (аллелей). Методы маркерной селекции с использованием линий культурного гороха в качестве рекуррентных родителей при возвратных скрещиваниях способны создать интрогрессивные линии гороха с отсутствием нежелательных для селекции аллелей. При проведении межвидовой гибридизации необходимо подтвердить факт получения межвидовых гибридов. Межвидовые гибриды идентифицировали по маркерным генам морфологических признаков, окраске цветков вегетирующих растений F1 (Byrne et al., 2008; Бобков, Лазарева, 2012), электрофоретическим спектрам изоэнзимов и генетическим маркерам (Ochatt et al., 2004). В наших опытах был использован метод, основанный на сравнении электрофоретических спектров индивидуальных семян родителей и гибридов. Он позволяет проводить идентификацию гибридов при отсутствии необходимости получения вегетирующих растений, а также при использовании нежизнеспособных семян. Дополнительно для идентификации гибридов использовали морфологические маркеры. Известно, что для рода Pisum характерна репродуктивная изоляции таксонов. Например, описаны нарушения мейоза вследствие ядерно-цитоплазматической несовместимости у гибридов, полученных в результате скрещивания между образцами дикорастущего подвида elatius и культурного подвида sativum вида Р. sativum L. (Богданова, Галиева, 2009). Гибридизация гороха посевного (Р. sativum) с дикорастущим видом (P. fulvum) сталкивается с более выраженной репродуктивной несовместимостью (Ben-Ze’ev, Zohary, 1973). Из литературных источников известно, что межвидовые гибриды получали только в комбинациях скрещивания, в которых P. fulvum использовали в качестве отцовского компонента (Ochatt et al., 2004; Byrne et al., 2008; Бобков, Лазарева, 2012). При этом гибридизация не отличалась высокой результативностью (Ochatt et al., 2004). Использование P. fulvum в скрещиваниях в качестве отцовского компонента приводило к появлению нежизнеспособных проростков (Ben-Ze’ev, Zohary, 1973). Получение одного гибридного семени и вегетирующего растения стало возможным в результате проведения 100 скрещиваний в направлении P. fulvum × Р. sativum (Bogdanova, Kosterin, 2007). Использование ДНК маркеров показало, что все четыре полученные гибридные растения F2 содержали пластиды отцовского компонента скрещивания (Р. sativum). В настоящих опытах средняя эффективность формирования бобов в направлении P. fulvum × P. sativum составила 7 %, что существенно (p = 0,005) меньше, чем при использовании P. fulvum в качестве отцовского компонента скрещивания (36 %). Существенные (p = 0,001) различия наблюдались и по числу полученных семян в пересчете на одно скрещивание в направлениях P. fulvum × P. sativum (0,21) и P. sativum × P. fulvum (0,8). Число семян в одном бобе в направлении P. fulvum × P. sativum равнялось 3,25, что было больше чем в обратной комбинации (2,22). Если в направлении скрещиваний P. sativum × P. fulvum все полученные семена были хорошо развитыми и гибридными, то в реципрокной комбинации наблюдали формирование невыполненных семян. В комбинации И592603 × Стабил полученные 4 семени практически не содержали зародышей (арест развития на ранних стадиях). Два семени, полученные в комбинации скрещивания И582593 × Аист, были невыполненными. Электрофоретический анализ выявил наличие спектров, но недостаточное количество белков (отсутствовали полиморфные компоненты) не позволило провести идентификацию продуктов гибридизации. Однако факт присутствия и разделения запасных белков в полиакриламидном геле (рис. 3) указывал на формирование и рост зародышей. В комбинации скрещивания И592602 × Аист только одно из 6 сформированных семян характеризовалось наличием выполненного зародыша (табл. 3). Электрофоретический анализ белков этого семени подтвердил получение гибрида в направлении скрещивания P. fulvum × Р. sativum, где P. fulvum использовали в качестве материнского компонента (рис. 4). Из литературных источников известно, что у гороха межвидовая гибридизация возможна при использовании P. fulvum в качестве отцовского компонента скрещиваний. Основной причиной репродуктивной несовместимости в комбинации P. fulvum × Р. sativum является отсутствие прорастания пыльцевых зерен Р. sativum на рыльцах пестиков P. fulvum (Ochatt et al., 2004). Получение гибридного семени можно объяснить тем, что в отдельных случаях пыльца прорастает и происходит оплодотворение. Межвидовая гибридизация у зернобобовых культур сталкивается с пост-зиготической несовместимостью, что приводит к отмиранию зародышей на ранних стадиях развития. Для их спасения используют метод эмбриокультуры in vitro. Культивирование изолированных зародышей межвидовых гибридов на питательных средах рассматривается в качестве важного метода для осуществления интрогрессии генетического материала диких видов нута (Clarke et al., 2006). Метод эмбриокультуры in vitro успешно применяется в межвидовой гибридизации чечевицы (Suvorova, 2014). Преодоление пост-зиготической несовместимости гороха с использованием метода эмбриокультуры особенно актуально в низко результативном направлении межвидовых скрещиваний P. fulvum × Р. sativum. В наших опытах к положительным результатам приводило культивирование in vitro изолированных 8-дневных зародышей гороха в комбинации скрещивания И592589 × Аист. В результате были получены морфогенные каллусные ткани и растения-регенеранты. У межвидовых гибридов гороха P. fulvum × Р. sativum должны присутствовать митохондрии P. fulvum, которые, как известно, наследуются по материнской линии (Богданова, Галиева, 2009). Создание интрогрессивных линий гороха с митохондриальным геномом P. fulvum открывает новые возможности для генетических и физиологических исследований. Отдельные образцы дикого вида P. fulvum характеризуются повышенной устойчивостью к вредителям и болезням (Byrne et al., 2008; Fondevilla et al., 2010). Поэтому весьма актуален вопрос, могут ли уникальные компоненты белков семян P. fulvum служить маркерами повышенной устойчивости к неблагоприятным факторам среды. Известно, что повышенная устойчивость к вредителям и болезням может поддерживаться уникальными изоформами липоксигеназ (Porta, Rocha-Sosa, 2002). Липоксигеназы обнаружены в зрелых и незрелых семенах, а также в вегетирующих органах гороха (Domoney et al., 1990). Среди представителей вида P. fulvum обнаружены образцы, характеризующиеся наличием уникального компонента 7 с молекулярной массой белка ~110 кДа. Этот белок на электрофоретических спектрах находится в непосредственной близости к двум основным изоформам липоксигеназы гороха с молекулярными массами ~90 и ~97 кДа (Casey et al., 1985). С использованием аффинной хроматографии у гороха выявлена изоформа липоксигеназы с молекулярной массой ~100 кДа (Domoney et al., 1990). Марганцевые липоксигеназы патогенного гриба Gaumannomyces graminis локализуются на электрофоретических спектрах в интервале 100-140 кДа (Su, Oliw, 1998). Присутствие компонента 7 в смежной области с компонентами липоксигеназ гороха не является достаточным основанием считать белок ранее неизвестной изоформой. Определение принадлежности белка компонента 7 к липоксигеназам или другим белкам, а также изучение его функциональных свойств, требуют проведения дополнительных исследований. Интрогрессия уникальных генов P. fulvum в геном культурного гороха с использованием белковых маркеров не имеет существенных технических ограничений для использования в селекции гороха. Для проведения электрофоретического анализа требуется небольшое количество белка, экстрагированного из одной семядоли или её части. В результате проращивания второй семядоли с почкой вырастает нормальное растение.

About the authors

Sergey Vasilevich Bobkov

All-Russia Research Institute of Legumes and Groat Crops, Doctor of agriculture, senior scientist

Email: svbobkov@gmail.com
head of plant physiology and biochemistry laboratory

Tatyana Nikolaevna Selikhova

All-Russia Research Institute of Legumes and Groat Crops, Doctor of agriculture, senior scientist

Email: tat.selihowa@yandex.ru
Doctor of biology, senior scientist of plant physiology and biochemistry laboratory

References

Supplementary files