Inheritance of acaricide resistance in inbreeding lines of two-spotted spider mite

Full Text

ВВЕДЕНИЕ Формирование у членистоногих резистентности к инсектоакарицидам связано с отбором из популяции особей, у которых модифицирована чувствительность биохимических мишеней токсиканта или произошли точечные мутации в аллелях, контролирующих течение физиологических процессов противодействия отравлению. По существующим представлениям каждый из функционирующих биохимических механизмов резистентности генетически детерминируется независимо. Если в геноме членистоногих имеется несколько механизмов резистентности, то они проявляют своё действие аддитивно. Сведения о наличии таких механизмов у членистоногих весьма значимы для практического применения химических средств защиты растений, поскольку чередование токсикантов неродственных химических групп часто осуществляется как профилактическое мероприятие, затрудняющее формирование резистентной популяции вредителя к пестициду какой-либо одной химической группы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В проводившихся экспериментах использовались самки обыкновенного паутинного клеща (Tetranychus urticae Koch) полученных нами гомозиготных линий по признакам чувствительности к токсическому действию селектирующих инсектоакарицидов. Дизруптивная селекция проводилась диагностическими концентрациями инсектоакарицидов (СК95 × 2 для клещей чувствительной линии) различных химических групп - диметоатом, бифентрином, бромпропилатом и абамектином. Клещи каждой линии разводились посемейно от единичных самок после инбредного скрещивания. Получаемые от самок семьи содержались на листовых плотиках фасоли, уложенных на залитую водой вату в кристаллизаторах, при длиннодневном фотопериодическом режиме. Резистентные (R) к акарицидам линии клещей являлись потомством самок из семей, выживавших на 90-100 % после обработки диагностической концентрацией селектирующего акарицида. Чувствительные к этому акарициду линии (S) были получены сибселекцией от сестёр самок из семей 100 % погибавших при обработке диагностической концентрацией токсиканта. Для селекции использовали препаративные формы инсектоакарицидов - диметоата (Би-58 40 % к. э.),[1] бифентрина (талстар 10 % к. э.), бромпропилата (неорон 50 % к. э.) и абамектина (вертимек 1,8 % к. э.). Для изучения перекрестной резистентности полученных генотипов клещей использовали также малатион (малатион 50 % к. э.), пиридабен (санмайт 20 % с. п.) и феназахин (демитан 20 % к. с.). Клещей обрабатывали методом окунания кусочков кормового растения с находящимися на них самками в водные растворы различных весовых (в %) концентраций токсикантов. После окунания кусочки листа с клещами раскладывали на чистые листовые плотики. Через первые и третьи сутки подсчитывалось количество выживших особей. Фракционный состав эстераз у самок клещей сопоставляемых линий определяли методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле с использованием трис-вероналового электродного буфера pH 7,2-7,5. Концентрация акриламида в разделяющем геле составляла 7,5 %. Самок клеща гомогенизировали с 40%-й сахарозой. Фракции эстераз после их электрофоретического разделения выявляли в инкубационной среде с 0,2 М фосфатным буфером pH 6,9, 1-нафтилацетатом в качестве гидролизуемого субстрата и прочным синим RR в качестве красителя (Šula, Weyda, 1983). При гибридологическом изучении особенностей наследования признака резистентности к акарицидам из исследуемых линий клеща для скрещивания брали готовых к линьке дейтонимф, к которым на отдельные листовые плотики подсаживали по одному самцу. Критерием оценки фенотипического выражения признака резистентности у самок из родительских и гибридных семей служило их распределение по уровням смертности через трое суток после обработки диагностической концентрацией акарицида. Анализирующее скрещивание (Fа) гибридных самок первого поколения (F1) проводилось с самцом из чувствительной или резистентной к акарициду родительской линии в зависимости от типа детерминации признака резистентности. Партеногенетический способ размножения клещей в форме арренотокии исключал возможность получения генотипических комбинаций гетерозиготных гибридов, которые возникают при реципрокном скрещивании, когда оба пола у членистоногих диплоидны. Поэтому реципрокные скрещивания не включались в гибридологический анализ. Статистическая обработка получаемых токсикологических данных при определении среднелетальных концентраций акарицидов и расчет доверительных интервалов средних арифметических проводили методом пробит-анализа по Литчфильду и Уилкоксону (Беленький, 1959). Графики строили при помощи компьютерной программы Microsoft@ Excel 2002. Ошибку частного при определении показателя резистентности (ПР) рассчитывали по Урбаху (1964). РЕЗУЛЬТАТЫ Токсикологическая характеристика отселектированных линий обыкновенного паутинного клеща Эксперименты проводились с линиями клещей после 70 поколений дизруптивного отбора. Фенотипически они характеризовались по значениям среднелетальных концентраций (СК50) токсикантов и показателям резистентности - СК50 R-линии/СК50 S-линии (табл. 1). Клещи полученных линий, как ожидалось, должны были быть гомозиготны по наличию или отсутствию признака резистентности к селектирующим токсикантам. Значения СК50 к акарицидам других химических групп, при определении перекрестной резистентности у отселектированных генотипов, отражали наличие в геноме клещей аллельных модификаций, детерминирующих их устойчивость и к этим токсикантам. Клещи отселектированной диметоатом линии до 1000-кратного уровня резистентности проявляли перекрестную устойчивость к малатиону и бромпропилату. К остальным акарицидам достоверного (более чем 20-кратного, по существующим оценочным критериям), наличия перекрестной устойчивости не выявлялось. При селекции клещей бифентрином перекрестная резистентность проявлялась кроме бромпропилата еще и к фосфорорганическим инсектоакарицидам - диметоату и малатиону. Отселектированные на резистентность к абамектину клещи проявляли перекрестную устойчивость ко всем использованным для сопоставления акарицидам, кроме пиридабена. При селекции клещей бромпропилатом различные уровни перекрестной устойчивости обнаруживались ко всем токсикантам, включая и пиридабен. Представления о биохимических механизмах резистентности У членистоногих, проявляющих резистентность к фосфорорганическим инсектоакарицидам, обнаруживается общее увеличение эстеразной активности. При этом выявляется значительно более высокая, по сравнению с нормой, активность одной из множественных молекулярных форм амфифильной карбоксилэстеразы (гидролазы эфиров карбоновых кислот КФ 3.1.1.1.). В настоящее время это считается специфическим биохимическим механизмом резистентности к фосфорорганической и карбаматной химическим группам инсектоакарицидов. Мутация, детерминирующая у членистоногих данный механизм резистентности, может приводить к увеличению синтеза карбоксилэстеразы двумя способами. Посредством транскрипционного регулирования каталитических свойств фермента вследствие изменения порядка нуклеотидных последовательностей в цепочке ДНК (Cui et al., 2011; Oakeshott et al., 2005) или путем умножения (амплификации) в матрице ДНК отдельного локуса, ответственного за синтез одной из множественных молекулярных форм карбоксилэстеразы (Вass, Field, 2011; Devonshire, Field, 1991; Field, Foster, 2002). Выявляемая электрофоретически фракция этой множественной молекулярной формы фермента может служить биохимическим маркёром наличия резистентных к фосфорорганическим соединениям особей в исследуемых популяционных выборках членистоногих. Различия между чувствительными и резистентными к фосфорорганическим соединениям самками клещей отселектированных линий показаны на рис. 1. Идентификация выявляемых эстеразных фракций была проведена ранее (Сундуков, 2012). Резистентность членистоногих к пиретроидным инсектоакарицидам связывается с генной мутацией, вызывающей нарушение транспортных функций ионных каналов плазматической мембраны клеток для катионов натрия, условно называемой «kdr-фактором». Результатом воздействия пиретроидных инсектоакарицидов на воротный механизм натриевых каналов являются патологические изменения натрий-калиевой асимметрии в клеточных и межклеточных жидкостях и, как следствие, патологическая модификация электрического потенциала на электрогенных мембранах. Данная мутация считается основным биохимическим механизмом резистентности членистоногих к пиретроидным соединениям (Burton et al., 2011; Leeuwen et al. 2010; Soderlund., 2008). Однако известны факты, свидетельствующие об участии также и гена кароксилэстеразной активности в детерминации признака резистентности у членистоногих к пиретроидным инсектоакарицидам (Gunning et al., 2007; Leeuwen, Tirry, 2007). Непосредственным доказательством участия этого фермента в проявлении резистентности клещей к бифентрину в наших экспериментах являлось выявление у них высокоактивной фракции множественной молекулярной формы карбоксилэстеразы, также как и у резистентных к диметоату и малатиону особей (рис. 1). Это позволяет заключить, что генетическая детерминация резистентности клещей к пиретроидным инсектоакарицидам может осуществляться кроме основной мутации - по «kdr-фактору» также и в результате амплификации локуса ДНК, ответственного за синтез одной из множественных молекулярных форм карбоксилэстеразы. Проявление довольно широкого спектра различий в перекрестной устойчивости к диметоату и малатиону в семьях разных поколений у селектировавшихся на устойчивость к бифентрину клещей могло быть связано с разной степенью амплификации у них локуса ДНК, контролирующего синтез этого фермента. В семьях отселектированной по признаку чувствительности к бифентрину линии клеща отсутствовали мутации как по гену «kdr-фактора», так и по гену, ответственному за увеличение синтеза карбоксилэстеразы. Высокоактивная маркерная фракция этого фермента у чувствительных к бифентрину самок паутинного клеща не выявлялась (рис. 1). Для макроциклических лактонов - авермектинов и мильбемицинов мишенью первичного токсического действия считается рецепторно-ионофорный комплекс гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), регулирующий воротный механизм ионных каналов хлора, а также глутаматные, гистаминовые и серотониновые рецепторы (Bloomquist, 2003; Clark et al., 1995; Kwon et al., 2010; Zhao, Salgado, 2010). У обыкновенного паутинного клеща выявлены и охарактеризованы мутантные протеиновые субъединицы глутаматных рецепторов ГАМК, с воздействием токсиканта на которые связывают проявление резистентности к абамектину (Dermauw et al., 2012). В эндоплазматическом ретикулуме и митохондриях членистоногих локализована универсальная ферментативная система, осуществляющая окислительное разрушение любых ксенобиотиков. Основным составляющим ее элементом являются цитохром Р450 зависимые монооксигеназы. Увеличение монооксигеназной активности в организме членистоногих за счет усиления транскрипции или генной амплификации обеспечивает значительное повышение уровня резистентности членистоногих, как полагают, ко всем инсектоакарицидам (Bass, Field, 2011; Feyereisen, 2005; Scott, 1999). Проявление резистентности к пиридабену и феназахину связывают с их действием на митохондриальный электронный транспорт в этой системе (Leeuwen et al., 2005; Pottenlberge et al., 2009; Stumpf, Nauen, 2001). Гибридологический анализ наследования признаков резистентности к акарицидам в отселектированных линиях паутинного клеща Скрещивание устойчивых к диметоату самок и чувствительных самцов показало, что наследование признака резистентности к фосфорорганическому акарициду у паутинного клеща в поколении F1 является полностью доминантным (рис. 2). Гибридные самки поколения F1 составляли только одну группу (Rs) устойчивых к диметоату особей, что свидетельствовало о моногенной детерминации признака резистентности к этому токсиканту у клещей. Возвратное анализирующее скрещивание гибридных самок из поколения F1 с самцом чувствительной к диметоату родительской линии давало в получаемом поколении Fа ожидаемое для моногенного наследования признака распределение особей на две группы - резистентных по фенотипу самок (Rs) с уровнем смертности от 20 до 40 % и чувствительных к токсиканту особей (ss) с уровнем смертности от 60 до 80 %. В отличие от резистентных к диметоату клещей, самки отселектированных бифентрином чувствительной и резистентной линий в первом поколении скрещивания (F1) давали гибриды, которые распределялись после обработки диагностической концентрацией этого токсиканта на две группы с пиками смертности на уровнях 40 и 70 % (рис. 3). Это являлось показателем дигенного наследования признака резистентности. Суммарно, по общему проценту резистентных самок, фенотипическое выражение признака резистентности к бифентрину у гибридов в F1 оказалось не полностью рецессивным. По литературным данным известно, что признак устойчивости детерминируемый «kdr-фактором» - всегда рецессивен (Park et al., 2000; Shono, 1985). Наличие у резистентных к пиретроидному акарициду клещей доминантного гена, амплификация которого увеличивает карбоксилэстеразную активность, модифицировало проявление детерминации основного гена по токсикологическому фенотипу от полной рецессивности к частичной. При скрещивании самок поколения F1 с резистентным к бифентрину самцом, гибридные самки нового потомства (Fа) при действии диагностической концентрации бифентрина группировались по уровню смертности (60-100 %) только в зоне рецессивного наследования признака (рис. 3). Как можно заключить по результатам проведённых экспериментов, резистентность к пиретроидным инсектоакарицидам детерминируется главной мутацией по «kdr-фактору» и дополнительно - по гену карбоксилэстеразной активности. Вторая мутация, не является облигатной и присутствует в случаях проявления самого высокого уровня устойчивости членистоногих к этим соединениям. Гибридологический анализ наследования признака резистентности к абамектину и бромпропилату выявил типично дигенную детерминацию признака резистентности к обоим токсикантам. При этом наследование признака устойчивости в поколении F1 к абамектину было доминантным, а к бромпропилату - не полностью рецессивным. Анализирующее скрещивание гибридных самок первого поколения (F1) этих линий с чувствительным к абамектину и резистентным к бромпропилату самцами давало в обоих случаях четыре группы возможных аллельных комбинаций распределения по уровням смертности получаемого в (Fа) потомства самок (рис. 4 и 5). Проведенным гибридологическим анализом выявлены главные гены, определяющие фенотипическое выражение признака резистентности к инсектоакарицидам четырех различных химических групп. Значения показателей перекрестной резистентности для клещей отселектированных линий (табл. 1) свидетельствовали о том, что действие главных генов, детерминирующих устойчивость к абамектину и бромпропилату, в значительной мере связано с активностью полимерных факторов. Для выяснения их участия в механизме противодействия отравлению необходимо проведение дополнительных экспериментов. Резистентность к абамектину, по имеющимся литературным сведениям, может определяться доминантной мутацией, ослабляющей воздействие токсиканта на глутаматные рецепторы ГАМК, и доминантной мутацией, модифицирующей функциональную активность микросомальной монооксигеназной системы. Устойчивость к бромпропилату связывают также с воздействием на монооксигеназную систему и, предположительно, с рецессивной мутацией по «kdr-фактору». ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Имеющийся изначально в популяционном генофонде у различных особей обыкновенного паутинного клеща набор всевозможных биохимических мутаций определяет большой биотический потенциал этого вида для быстрого формирования резистентности к любому токсиканту. Дизруптивный отбор в инбредных линиях клещей по признаку устойчивости к диметоату позволил получить чувствительную и высоко резистентную гомозиготные линии. Признак резистентности к фосфорорганическому акарициду у этих клещей наследовался доминантно, а его фенотипическое проявление было обусловлено мутацией, вызывающей увеличение синтеза одной из множественных молекулярных форм амфифильной карбоксилэстеразы. Повышение активности этого фермента у резистентных членистоногих многие авторы связывают с усилением им детоксикации различных инсектоакарицидов (Devorshak, Roe, 1998; Goh et al., 1995; Oakeshott et al., 2005). Однако карбоксилэстераза может гидролизовать оказавшиеся в межклеточных жидкостях организма членистоногих ксенобиотики только в том случае, если они по своей химической структуре будут сложными карбоксиэфирами, например, малатион или пиретроидные инсектоакарициды. Фосорорганические соединения, не являющиеся карбоксиэфирами, ингибируют активность всех эстераз, включая и карбоксилэстеразу. Повышение активности карбоксилэстеразы у резистентных к инсектоакарицидам членистоногих может противодействовать их отравлению другим способом. Основной физиологической функцией карбоксилэстеразы, как известно, является участие в гидролизе и транспорте через биомембраны клеток циркулирующих в межклеточных жидкостях биорегуляторов химических реакций, являющихся сложными карбоксиэфирами, таких как ювенильный гормон, а также карбоксиэфиров, образующихся в течение различных метаболических реакций. С помощью этого процесса происходит трансмембранное перемещение таких соединений из клеточных и внеклеточных жидкостей в структуры выделительной системы. Это должно быть неразрывно связано и с общей циркуляцией органических веществ и продуктов их метаболизма в жидкостях внутренней среды. Увеличение количества амфифильной карбоксилэстеразы, у резистентных к инсектоакарицидам членистоногих должно противодействовать быстрому блокированию межклеточного транспорта сложноэфирных соединений, предотвращая или затрудняя этим развитие летального патогенеза. Основным биохимическим механизмом резистентности до настоящего времени считается интенсивность метаболизма инсекоакарицидов в организме членистоногих. Уровень резистентности членистоногих, как полагают, должен зависеть от количества разрушенного в их организме токсиканта эстеразой, глутатион-S-трансферазой или монооксигеназами (Leeuwen et al., 2010; Li et al., 2007). Сведения об этиологии летального действия инсектоакарицидов на членистоногих дают основание сомневаться в правильности такого представления. Действие любого инсектоакарицида острого токсического действия на членистоногих во всех случаях начинается со связывания с периферическими рецепторами, локализованными в плазматических мембранах клеток. Это является пусковым механизмом патогенеза летального отравления, а непосредственной причиной гибели членистоногих при действии инсектоакарицидов является быстротечный и необратимый критический сдвиг от нормы количественного соотношения содержания воды и электролитов в жидкостях организма (Сундуков, 2012). Между этими крайними физиологическими состояниями происходят патологические изменения важнейших для жизнедеятельности организма процессов нейрональной и гормональной регуляции с различными сопутствующими нарушениями. Инсектоакарицид запускает цепь патогенеза отравления у членистоногих в момент первичного локального контакта со своей «мишенью» - рецепторами нервной системы. Возможное последующее проникновение токсиканта через покровы, распространение его в межклеточных жидкостях организма и гипотетическое разрушение различными ферментными системами, за исключением случаев сублетального действия, уже не будет иметь значения для развития процессов летального патогенеза. Проявление резистентности членистоногих к инсектоакарицидам будет зависеть от усиления генетически детерминируемой реактивности организма - способности различных компенсаторных биохимических реакций, таких как повышение активности карбоксилэстеразы или монооксигеназ, способствовать восстановлению нарушаемых в течение развития летального патогенеза жизненно важных функций. У членистоногих, отравленных любыми инсектоакарицидами острого токсического действия, на начальном этапе патогенеза можно обнаружить нарушения различных тесно взаимосвязанных процессов клеточного метаболизма - трансмембранных сигнальных связей, процессов окислительного фосфорилирования в митохондриях, функционирования ионных каналов, интенсивности цитоплазматического обмена веществ, транспорта продуктов распада и прочее. Отличия первичного действия инсектоакарицидов различного химического строения на «мишень» будут определяться тем, с какого из этих взаимозависимых функциональных нарушений начнется развитие процессов патогенеза и генетическая детерминация биохимических модификаций, повышающих устойчивость членистоногих к действию токсиканта, должна быть направлена на уменьшение «чувствительности» к его начальному деструктивному действию.

About the authors

Oleg Veniaminovich Sundukov

All-Russian institute for plant Protection

Email: Sunduckov.oleg@yandex.ru
PhD, Senior scientist. Laboratory ecotoxicology

Irina Anatolyevna Tulayeva

All-Russian institute for plant Protection

Email: zubanov63@yandex.ru
PhD, scientist. Laboratory ecotoxicology

Yevgeniy Aleksandrovich Zubanov

All-Russian institute for plant Protection

Email: zubanov63@yandex.ru
PhD, scientist. Laboratory ecotoxicology

References

Supplementary files