Gene expression analysis of genes coding key enzymes of cadmium detoxification in garden pea symbiotic nodules

Full Text

ВВЕДЕНИЕ В связи с усилением антропогенного воздействия на окружающую среду перед современным сельским хозяйством стоит задача получения сортов растений, устойчивых к разнообразным стрессовым воздействиям. Одним из факторов, оказывающих существенное влияние на большинство растительных организмов, является присутствие тяжелых металлов в почве, воде и атмосфере. Кадмий является одним из наиболее опасных и широко распространенных загрязняющих элементов, поступление которого в природную среду обусловлено разными видами хозяйственной деятельности человека. Соли данного тяжелого металла хорошо растворяются в воде и могут быть поглощены растениями. Кадмий, поступая в живые организмы через переносчики других металлов, вызывает на клеточном уровне многочисленные физиологические и метаболические нарушения (Han et al., 2006). У гороха довольно низкие концентрации кадмия ингибируют рост корней и побегов, а также поглощение воды и питательных веществ, нарушают фотосинтез и активность многих ферментов и индуцируют окислительный стресс (Sanita di Toppi, Gabrielli, 1999). Взаимовыгодные симбиозы, образуемые бобовыми растениями и клубеньковыми бактериями, оказывают существенное влияние на плодородие почвы и повышение урожайности (Skeffington, Bradshaw, 1980). Однако развитие симбиотических отношений является чувствительным к разнообразным неблагоприятным воздействиям, в том числе и солям кадмия (Balestrasse et al., 2003). Исследование влияния серии концентраций кадмия на развитие симбиотических клубеньков и азотфиксирующую активность у сои показало, что хотя количество клубеньков снижалось уже при самых низких концентрациях кадмия (2 мг/кг почвы), в то же самое время наблюдалась некоторая стимуляция азотфиксирующей активности при концентрациях до 5 мг/кг почвы (Chen et al., 2003). Стимуляция азотфиксирующей активности при определенных невысоких концентрациях кадмия наблюдалась в клубеньках модельных бобовых растений Lotus japonicus и Medicago truncatula (Цыганов и др., 2010). В ряде исследований была показана роль микоризы в увеличении устойчивости растений к кадмию. Так, при изучении нескольких генотипов гороха было показано, что инокуляция микоризным грибом увеличивает устойчивость растений к кадмию (Rivera-Becerril et al., 2002). Тем не менее механизмы такой устойчивости до конца не изучены (Rivera-Becerril et al., 2005). Исследование ряда штаммов ризосферных бактерий показало, что АЦК-утилизирующие ризобактерии улучшают образование и функционирование симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями в присутствии токсичных концентраций кадмия (Малков и др., 2012). В ответ на действие токсичных веществ, у растений, также как и у других живых организмов, начинается запуск специальных адаптивных механизмов. Основные механизмы устойчивости живого организма могут формироваться двумя путями: уходом от воздействия и перестройкой метаболизма для успешного выживания в условиях действия стрессора (Серегин, Иванов, 2001). Одним из важнейших защитных механизмов растений, нивелирующим негативное действие кадмия, является поддержание баланса металл-связывающих лигандов, таких как глутатион и фитохелатины (Kulaeva, Tsyganov, 2011). Глутатион в клетке поддерживает окислительно-восстановительный баланс, сдерживает негативное влияние активных форм кислорода, участвует в детоксикации кадмия (Zagorchev et al., 2013). Недавно опубликованные данные показывают, что концентрация глутатиона в различных частях растений увеличивается при засухе, засолении, тепловом стрессе, при воздействии кадмия и свинца (Estrella-Gomez et al., 2012; Gill et al., 2012; Kumar et al., 2013; Pyngrope et al., 2013). Синтез глутатиона из глутамата, цистеина и глицина является АТФ-зависимым, двухстадийным процессом (рис. 1). Первая реакция образования γ-Глу-Цис из глутамата и цистеина катализируется γ-глутамилцистеин синтетазой (EC 6.3.2.2), которая кодируется геном GSH1. Реакция, катализируемая этим ферментом, рассматривается в качестве лимитирующей стадии синтеза глутатиона (May et al., 1998). Вторая стадия синтеза глутатиона из γ-Глу-Цис и глицина катализируется глутатион синтетазой (EC 6.3.2.3), которая кодируется геном GSHS (Xiang, Oliver, 1998). У представителей семейства Fabaceae обнаружен гомолог глутатиона - гомоглутатион, у которого глицин заменен на аланин. Синтез гомоглутатиона осуществляется ферментом гомоглутатион синтетазой (EC 6.3.2.23), кодируемой геном hGSHS (рис. 1). Недавно показано, что в симбиотических клубеньках M. truncatula различаются паттерны экспрессии генов GSHS и hGSHS (в зоне азотфиксации активность экспрессии GSHS выше, чем hGSHS), что может свидетельствовать о различной их регуляции в разных тканях и зонах клубенька (El Msehli et al., 2011). Сверхэкспрессия GSH1 приводила к повышенному содержанию (гомо)глутатиона, а также к повышению уровня нитрогеназной активности в клубеньках и уровней экспрессии нескольких генов, активирующихся в азотфиксирующем клубеньке. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли, которую играет (гомо)глутатион в регуляции азотфиксации в симбиотическом клубеньке, однако необходимы дальнейшие исследования, чтобы вычленить роль каждого из тиолов (El Msehli et al., 2011). Важным механизмом детоксикации кадмия растительными организмами является индукция синтеза фитохелатинов, синтезируемых из глутатиона фитохелатинсинтазой (EC 2.3.2.15) (Серегин, 2001). Фитохелатины, представляющие собой олигомеры глутатиона, были открыты около 30 лет назад (Kondo et al., 1984, Grill et al., 1985), и с тех пор растет число публикаций, посвященных роли фитохелатинов в формировании устойчивости к металлам. В настоящее время первичная структура фитохелатинов определена для широкого спектра видов покрытосеменных растений из различных семейств. Они представляют собой небольшие богатые цистеином пептиды, состоящие из линейных цепей остатков глутаминовой кислоты и цистеина и способные связывать ионы тяжелых металлов через SH группы (Серегин, 2001). Фитохелатины обладают высоким сродством к ионам кадмия (Reese, Wagner, 1987). Кадмий стимулирует синтез фитохелатинов, которые быстро образуют низкомолекулярные комплексы с ионами кадмия и транспортируются через тонопласт в вакуоль через ABC переносчик (Park et al., 2012). К настоящему моменту известно лишь небольшое количество работ, посвященных механизмам детоксикации кадмия в клубеньках бобовых растений. В данном исследовании был проведен анализ влияния хлорида кадмия на изменение экспрессии четырех ключевых ферментов синтеза глутатиона, гомоглутатиона и фитохелатинов в клубеньках гороха посевного (Pisum sativum L.). В работе использовалась исходная линия гороха SGE и мутант SGECdt (Tsyganov et al., 2007). Данный мутант характеризуется повышенной устойчивостью к токсичным концентрациям кадмия, по сравнению с линией SGE. Фенотипическое проявление мутации cdt (сохранение способности образования боковых корней) наблюдается при выращивании растений в среде, содержащей от 3 до 30 мкМ хлорида кадмия. Также мутант SGECdt характеризуется повышенным в 1,5-2 раза по сравнению с линией SGE накоплением кадмия в биомассе растений (Кулаева, 2012). Ген Сdt (Cadmium tolerance) был локализован на генетической карте гороха в VI группе сцепления, но его последовательность к настоящему моменту остается еще не идентифицированной (Tsyganov et al., 2013; Kulaeva, Tsyganov, 2013). Следует отметить, что данный мутант способен формировать симбиотические системы, также более устойчивые к кадмию (Tsyganov et al., 2005). В клубеньках гороха исходной линии SGE и мутанта SGECdt было изучено изменение экспрессии генов, кодирующих γ-глутамилцистеин синтетазу (GSH1), глутатион синтетазу (GSHS), гомоглутатион синтетазу (hGSHS) и фитохелатинсинтазу (PsPCS). Материал и методы исследования Растительный материал и штамм клубеньковых бактерий В исследовании были использованы исходная линия гороха посевного (Pisum sativum L.) SGE (Kosterin, Rozov, 1993) и мутант SGECdt, характеризующийся повышенными устойчивостью к кадмию и его аккумуляцией в тканях растений (Tsyganov et al., 2007). В работе был использован штамм клубеньковых бактерий из коллекции Центра Джона Иннеса, Великобритания, Норвич) Rhizobium leguminosarum bv. viceae (rlv 3841) - природный стрептомицин-устойчивый мутант. Инокуляцию пятидневных проростков гороха проводили в условиях гидропоники. Условия выращивания растений Семена стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 30 мин, промывали дистиллированной водой 6 раз. Растения выращивались в условиях смены день/ночь - 16/8 ч, температуры - 21 °C, относительная влажность воздуха 75 %, освещенность 38 тыс. люкс, в условиях гидропоники с аэрацией. Раствор хлорида кадмия (осч, Merck) концентрацией 0,5 мкМ добавлялся в сосуды с питательной средой (Tsyganov et al., 2007) к шестидневным проросткам гороха. После добавления кадмия растения выращивали 4 недели, смена гидропонного раствора проводилась каждые три дня. Анализ сухого веса растений После выращивания растения были высушены при комнатной температуре в течение недели, после чего был определен сухой вес их корневых систем и побегов. Для каждого варианта обработки было проанализировано 15 растений. Выделение РНК Для выделения РНК клубеньки исследуемых растений были гомогенизированы с использованием ступки и пестика с добавлением жидкого азота. Выделение РНК проводилось из навески растительной ткани массой 60-100 мг. РНК выделяли согласно протоколу изготовителя http://www.bio-rad.com/ru-ru/product/purezol-rna-isolation-reagent (BioRad Laboratories, США). Качество выделенной РНК определяли с использованием гель-электрофореза в 1,5 % агарозном геле в 0,5 % трис-ацетатном буфере с окрашиванием бромистым этидием. Определение концентрации РНК, постановка обратной транскрипции Определение концентрации выделенной РНК проводилось на спектрофотометре Shimadzu UV mini-1240 (Shimadzu, Япония). Реакция обратной транскрипции проводилась в объеме 20 мкл, из которых 1 мкл - это обратная транскриптаза RevertAid™ M-MuLV Reverse Transcriptase (200 ед/мкл, MBI Fermentas, Литва), 4 мкл 5x буфер для обратной транскриптазы (MBI Fermentas, Литва), 1 мкл 100 мкМ праймеры Oligo (dT)18 (MBI Fermentas, Литва), 0,5 мкл 25 мM dNTP (MBI Fermentas, Литва), 1 мкл ингибитор РНКаз RiboLock™ RNase Inhibitor (40 ед/мкл, MBI Fermentas, Литва), остальные 12,5 мкл составляли деионизированная вода и РНК (1,5 мкг). Реакцию осуществляли в автоматическом амплификаторе С1000TM Thermal Cycler (Bio-Rad, США). Схема проведения реакции ОТ: синтез кДНК на матрице мРНК ферментом обратной транскриптазой: 40 ºС, 60 мин; инактивация фермента: 70 ºС, 10 мин. Проведение ПЦР в режиме реального времени ПЦР в режиме реального времени осуществляли в автоматическом амплификаторе С1000TM Thermal Cycler, совмещенном с оптическим модулем CFX96TM Real-Time System (Bio-Rad Laboratories, США) с использованием коммерческого набора iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, США). Анализ экспрессии генов проводился в трех повторностях. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащем 1х буфер для ПЦР, 4 мМ MgCl2, 10 мМ dNTP, 1 ед. Taq-полимеразы, 10 пМ каждого праймера и 0,5x SYBR Green I. Амплификацию проводили по следующей программе: 95 °C - 30 с, 58 °C - 30 с и 72 °C - 30 с. Флуоресценцию интеркалирующего красителя SYBR Green I регистрировали в конце каждого цикла при 72 ºC. Количественную оценку экспрессии анализируемого гена проводили с помощью программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager 3.0. Данные по количественной оценке анализируемого гена представлены в относительных единицах, рассчитанных при сравнении с уровнем экспрессии референсного гена GAPDH (X73150). Для проведения ПЦР в режиме реального времени были использованы праймеры, представленные в таблице 1. РЕЗУЛЬТАТЫ Анализ сухого веса растений Было проанализировано влияние 0,5 мкМ хлорида кадмия на развитие симбиоза между штаммом Rh. leguminosarum bv. viceae 3841 и растениями гороха линии SGE и мутанта SGECdt. Сравнительный анализ контрольных и опытных растений исходной линии SGE и мутанта SGECdt не выявил влияния 0,5 мкМ CdCl2 на изменение cухого веса корней и побегов (рис. 2). При этом сухой вес корней и побегов исходной линии SGE не отличался от такового у мутанта SGECdt как в контрольных условиях, так и при воздействии CdCl2 (рис. 2). Анализ экспрессии генов, кодирующих компоненты синтеза глутатиона Последовательности генов, контролирующих биосинтез (гомо)глутатиона, и их роль в разнообразных биологических процессах выявлены для многих видов, в том числе и для гороха посевного (Matamoros et al., 1999; Moran et al., 2000). Нами было проанализировано изменение экспрессии трех генов, продукты которых участвуют в синтезе (гомо)глутатиона: γ-глутамилцистеин синтетазы (GSH1), глутатион синтетазы (GSHS) и гомоглутатион синтетазы (hGSHS). У исходной линии SGE не наблюдалось изменения уровня экспрессии гена GSH1 в ответ на действие CdCl2, в то время как у мутанта SGECdt было выявлено небольшое снижение экспрессии данного гена. При этом в контрольных условиях уровень экспрессии GSH1 не раличался у обеих линий (рис. 3). Та же закономерность была выявлена при анализе гена GSHS. Уровень экспрессии гена GSHS в контрольных условиях практически не различался у исходной линии SGE и мутанта SGECdt. Обработка растений CdCl2 приводила к небольшому ослаблению экспрессии данного гена у мутанта, в то время как у линии SGE экспрессия GSHS усиливалась (рис. 3). Экспрессия гена hGSHS усиливалась при действии хлорида кадмия как у мутанта SGECdt, так и у линии SGE (рис. 3). Сравнение уровней экспрессии исследуемых генов показало, что сильнее всего при контрольных условиях в клубеньках гороха экспрессировался ген hGSHS, кодирующий гомоглутатион синтетазу. Анализ экспрессии гена фитохелатинсинтазы До недавнего времени последовательность гена фитохелатинсинтазы была расшифрована всего для нескольких видов, однако в последнее время было опубликовано большое количество литературы, посвященной исследованию фитохелатинсинтазы у представителей разных семейств. Нами была выявлена последовательность кодирующей области гена фитохелатинсинтазы гороха посевного (Кулаева О. А., Цыганов В. Е., неопубликованные данные). На основе выявленной последовательности были подобраны праймеры для анализа экспрессии данного гена в клубеньках гороха. Как видно из рисунка 3, обработка растений хлоридом кадмия приводила к усилению экспрессии гена PsPCS как у линии SGE, так и у мутанта SGECdt. При этом в контрольных условиях уровень экспрессии гена PsPCS был выше у исходной линии SGE (рис. 3). Обсуждение результатов В данном исследовании растения исходной линии гороха SGE и мутантной линии SGECdt, инокулированные эффективным штаммом ризобий подвергались длительному (4 недели) воздействию низкой концентрации хлорида кадмия (0,5 мкМ). При анализе сухого веса растений не наблюдалось достоверных различий между всеми проанализированными вариантами, что подтверждает тот факт, что сами растения гороха проявляют бóльшую устойчивость, чем формируемые на их корнях клубеньки. Действительно, существенная разница между исходной и мутантной линиями наблюдалась нами при воздействии 3 мкМ хлорида кадмия (Tsyganov et al., 2007). В то же время клубенькообразование у исходной линии SGE было значительно снижено при концентрации хлорида кадмия 0,5 мкМ и полностью ингибировалось при концентрации 1,5 мкМ, а у мутантной линии при концентрации 2,0 мкМ (Tsyganov et al., 2005). Нами было изучено влияние хлорида кадмия на изменение экспрессии генов, кодирующих γ-глутамилцистеин синтетазу, глутатион синтетазу, гомоглутатион синтетазу и фитохелатинсинтазу, являющихся ключевыми ферментами детоксикации кадмия в клубеньках исходной и мутантной линий с использованием ПЦР в режиме реального времени. Было показано, что экспрессия гена GSH1 не изменялась при действии кадмия у исходной линии, и даже снижалась у мутанта SGECdt. Фермент γ-глутамилцистеин синтетаза образует комплексы глутамата и цистеина, причем данный этап является лимитирующим в синтезе глутатиона (May et al., 1998). Анализ влияния сверхэкспрессии гена GSH1 на устойчивость растений арабидопсиса и томата к хлориду кадмия выявил, что, несмотря на повышенное содержание у таких растений глутатиона, повышенной устойчивости к данному тяжелому металлу выявлено не было (Goldsbrough et al., 1998, Xiang et al., 2001). При изучении факторов, взаимодействующих с γ-глутамилцистеин синтетазой и влияющих на ее активность у арабидопсиса, было показано, что обработка клеточных суспензий хлоридом кадмия не влияет на уровень экспрессии генов AtGSH1 и AtGSHS, что указывает на отсутствие прямой регуляции транскрипции под воздействием стресс-фактора. При этом выявленное увеличение накопления глутатиона коррелирует у арабидопсиса с усилением активности фермента γ-глутамилцистеин синтетазы, а не глутатион синтетазы, что свидетельствует о наличии у растений механизмов посттранскрипционной регуляции активности γ-глутамилцистеин синтетазы (May et al., 1998). Анализ экспрессии генов, кодирующих ферменты заключительного этапа синтеза глутатиона и гомоглутатиона в клубеньках гороха, показал, что у мутанта SGECdt наблюдается снижение уровня экспрессии гена GSHS, по сравнению с исходной линией, при воздействии хлорида кадмия, в то же время уровень экспрессии гена hGSHS повышался как у мутантой, так и у исходной линий. В целом было показано, что экспрессия hGSHS усилена по сравнению с экспрессией GSHS, что может косвенно свидетельствовать об участии гомоглутатиона в защитных процессах, протекающих в клубеньках. Гомоглутатион, синтезируемый ферментом гомоглутатион синтетазой, характерен для представителей семейства Fabaceae, у которых он выполняет разнообразные функции, частично сходные с таковыми глутатиона (Noctor et al., 2012). Исследование влияния разнообразных стрессовых воздействий показало, что экспрессия гомоглутатион синтетазы в клубеньках фасоли усиливается только при действии перекиси водорода, и не меняется при засухе, засолении и обработке растений тяжелыми металлами (Loscos et al., 2008). Соотношение количества глутатиона и гомоглутатиона в разных растительных тканях сильно варьирует в зависимости от вида растения. Предполагается, что глутатион и гомоглутатион играют различные роли в процессах развития растений и ответа на стрессовое воздействие. Таким образом, несмотря на то, что многие функции глутатиона и гомоглутатиона перекрываются, у бобовых растений их синтез может изменяться по-разному в ответ на действие стрессора, однако причины таких варьирований еще остаются неизвестными (Frendo et al., 2013). В клубеньках гороха нами было выявлено усиление экспрессии гена PsPCS, кодирующего фитохелатинсинтазу при действии кадмия как у линии SGE, так и у мутанта SGECdt. Исследования, проведенные на разных видах, свидетельствуют о наличии корреляции между повышенной устойчивостью к кадмию и повышенным уровнем фитохелатинов или гетерологичной экспрессией генов, связанных с синтезом фитохелатинов (Mohamed et al., 2012, Liu et al., 2012, Son et al., 2012). С другой стороны, показано, что фитохелатины не связаны с развитием процессов длительной адаптации к действию кадмия и процессами гипераккумуляции данного тяжелого металла (Gupta et al., 2010). Дискуссионным остается вопрос о регуляции активности фитохелатинсинтазы. Так, долгое время предполагалось, что у растений происходит саморегуляция активности данного фермента (Loeffler et al., 1989). Исследования гена TcPCS1 пшеницы показали, что он регулируется на уровне транскрипции (Сlemens et al., 1999). Анализ, проведенный на арабидопсисе, выявил, что регуляция гена, кодирующего фитохелатинсинтазу, осуществляется на уровне транскрипции, но только на ранних этапах развития растения (Lee et al., 2002). У некоторых представителей семейства Fabaceae помимо фитохелатинов выявляют еще гомофитохелатины, синтезируемые из гомоглутатиона ферментом гомофитохелатин синтазой. Ген, кодирующий данный фермент, выявлен к настоящему моменту лишь у некоторых видов (Oven et al., 2002). Мало изученным остается роль фитохелатинов и гомофитохелатинов в защитных процессах, происходящих в клубеньках бобовых растений. Так, при обработке растений L. japonicus солями кадмия было выявлено повышенное накопление фитохелатинов и гомофитохелатинов в клубеньках (Ramos et al., 2007, 2008). У представителей вида Vigna angularis функцию защиты клубеньков от кадмия несут только гомофитохелатины, поскольку синтеза фитохелатинов у них не обнаружено (Oven et al., 2001). Таким образом, поскольку регуляция процессов защиты клубеньков от негативного действия кадмия представляется пока достаточно неоднозначной и сильно варьирует в зависимости от вида растения, представляется перспективным клонирование гена, кодирующего гомофитохелатинсинтазу, оценка роли гомофитохелатинов в защитных реакциях и исследование регуляции активности фитохелатин и гомофитохелатинсинтаз у гороха посевного. В ходе данного исследования при анализе экспрессии генов, кодирующих ключевые ферменты детоксикации кадмия у гороха, не было выявлено усиления экспрессии какого-либо из генов у мутантной линии SGECdt, по сравнению с исходной линией. Таким образом, вероятно, что ни глутатион, ни фитохелатины не играют значительной роли в повышенной устойчивости клубенькообразования у мутантной линии к токсичным концентрациям хлорида кадмия, по сравнению с исходной линией. В то же время дальнейшие исследования необходимы для выявления возможной роли посттранскрипционной, трансляционной и посттрансляционной регуляции активности данных ферментов.

About the authors

Olga Alekseyevna Kulaeva

All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology RAAS

Email: koa1983@yandex.ru
Scientific Researcher, Laboratory of Molecular and Cellular Biology

Viktor Yevgenyevich Tsyganov

All-Russia Research Institute for Agricultural Microbiology RAAS

Email: tsyganov@arriam.spb.ru
Head of the Laboratory of Molecular and Cellular Biology

References

Supplementary files