Ген экспансина NtEXPA5 повышает стрессоустойчивость волосовидных корней табака через влияние на антиоксидантную систему

Полный текст

ВВЕДЕНИЕ

Экспансины — это неферментативные белки, участвующие в размягчении клеточных стенок, механизм действия которых связан с ослаблением и разрывом водородных связей между ксилоглюканами и микрофибриллами целлюлозы [1]. Повышенная экспрессия экспансинов способствует улучшению роста корней за счет стимуляции клеточного растяжения [2, 3]. Имеются многочисленные данные об участии экспансинов в реакциях стрессоустойчивости [4–6]. Ранее нами были созданы трансгенные растения табака Nicotiana tabacum с конститутивной экспрессией гена экспансина NtEXPA5 [7]. Полученные растения характеризовались увеличением размеров листьев и стебля. Однако нами также был выявлен высокий уровень экспрессии этого гена в корнях табака дикого типа [6], и более того, трансгенные растения, сверхэкспрессирующие ген NtEXPA5, характеризовались улучшением роста корней как при нормальных условиях, так и при действии стрессовых факторов [3]. Исходя из полученных данных, было сделано предположение, что экспансины могут способствовать улучшению роста также у культур волосовидных корней (англ. hairy roots — HRs), являющихся перспективной биотехнологической системой для продуцирования ценных вторичных метаболитов и рекомбинантных белков. Культуры волосовидных корней в биотехнологическом производстве могут подвергаться отрицательному влиянию изменений состава среды, температуры и подобных явлений, поэтому создание не только высокопродуктивных, но и стрессоустойчивых волосовидных корней весьма актуально. Ранее был показан более высокий уровень экспрессии гена NtEXPA5 в волосовидных корнях табака, по сравнению с обычными корнями [8], что говорит о важности его белкового продукта для роста HRs.

Исходя из этого, целью нашей работы было получение волосовидных корней табака с конститутивной экспрессией гена NtEXPA5, их морфометрический анализ и оценка состояния их антиоксидантной системы при действии стрессовых факторов. Предполагалось, что трансген NtEXPA5 будет способствовать повышению продуктивности и стрессоустойчивости волосовидных корней, что может сопровождаться изменениями в компонентах антиоксидантной системы.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Семена ранее полученных трансгенных растений табака 35S::NtEXPA5 сорта Petit Havana линии SR1 поколения T₂ с единичной копией трансгена стерилизовали в 75 % этиловом спирте (~30 с) и в 2,5 % гипохлорите натрия (~5 мин), после чего промывали стерильной дистиллированной водой 5 раз и высаживали в чашки Петри с селективной (200 мг/л антибиотика гигромицина), твердой (7 г/л агара) питательной средой МС (0,5 соли МС, 14 г/л сахарозы, 60 мг/л инозитола, 2 мг/глицина, 1 мг/л тиамина и 1 мг/л никотиновой кислоты). Спустя 20 дней проростки одинаковых размеров, не имеющих морфологических аномалий, высаживали в смесь почвы и вермикулита (3 : 1 соответственно). Растения выращивали в вегетационных сосудах объемом 500 мл при температуре воздуха 24 ± 1 °C, освещенности 120 мкмоль/м²с и фотопериоде 16 ч.

Культуры волосовидных корней были созданы из листовых эксплантов двухмесячных растений при помощи Agrobacterium rhizogenes штамма А4. Агробактерии предварительно выращивали на жидкой селективной среде LB (100 мг/л рифампицина). Экспланты листьев табака стерилизовали с использованием 75 % раствора этилового спирта (~1 мин) и 2 % раствора гипохлорита натрия (~8 мин). Совместное культивирование листовых эксплантов и агробактерий проводили на твердой (7 г/л агара) среде МС (1 соли МС, 28 г/л сахарозы, 120 мг/л инозитола, 2 мг/л глицина, 1 мг/л тиамина и 1 мг/л никотиновой кислоты) в течение трех суток при температуре +26 °C, после чего листовые экспланты были перенесены на твердую среду МС, содержащую антибиотик (100 мг/л цефотаксим). Все образованные на эксплантах волосовидные корни фрагментами длиной по 1,5–2 см помещались в отдельные чашки Петри со средой МС и содержались при температуре воздуха 24 ± 1 °C, в темноте. Была проведена предварительная селекция, для отбора наиболее активно и стабильно растущих корней. После 2 мес. культивации на селективной среде МС фрагменты волосовидных корней вместе с апикальной меристемой (длиной ~1,2 см) были пересажены на свежую среду МС. В качестве контрольной линии, относительно которой делали выводы об эффектах трансгена, выступали линии волосовидных корней, созданные из нетрансгенных растений N. tabacum сорта Petit Havana линии SR1.

ДНК из волосовидных корней выделяли стандартным методом с применением цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ) [9]. Для подтверждения трансгенности созданных волосовидных корней использовали классический метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами CGTATGTTATTGCCGGGAAAAGTG и CAGAACATTACATTGACGCAGGTGAT, подобранными к репортерному гену uidA (GUS).

Тотальную РНК из волосовидных корней выделяли при помощи тризола, первую цепь кДНК синтезировали с использованием олиго(dT)-праймера и M-MuLV-обратной транскриптазы (ОТ) (NEB, USA). Для ОТ-ПЦР гена NtEXPA5 использовали праймеры TGGTGCAATCCCCCTCTC и GACATTGTTTGCCATCCAGTATTA. В качестве референсного гена был использован ген EF-1α N. tabacum (AF120093.1), для амплификации которого использовали праймеры: GAATTGGTACTGTCCCTGTT и TTGCCAATCTGTCCTGAAT. Полуколичественную ОТ-ПЦР для обоих генов проводили при следующих условиях: 94 °C — 1 мин, затем 94 °C — 30 с, 53 °C — 30 с, 72 °C — 1 мин — 30 циклов, и финальная элонгация 72 °C — 5 мин. Для каждого эксперимента использовали по три контрольных и опытных растения (n = 3).

Волосовидные корни табака подвергали следующим стрессовым воздействиям: 150 мМ NaCl, 100 мкМ CuSO₄, 100 мкМ Cd(CH₃COO)₂ и 75 мМ маннитола в агаризованной питательной среде МС в условиях in vitro. Интенсивность стрессовых условий была подобрана в ходе предварительных исследований по отношению к волосовидным корням табака без трансгена NtEXPA5 таким образом, чтобы она значительно (до 20 раз) замедляла рост, но вызывала гибель не более 10 % образцов корней. Морфометрический анализ заключался в измерении среднего прироста длины волосовидных корней на 30-й день культивации. Средний прирост рассчитывался как отношение суммы удлинения всех HRs к числу корней. Для оценки продуктивности также анализировали прирост сухого веса корней. Поскольку начальный сухой вес фрагментов корней очень мал (не более 1 мг) им было решено пренебречь. Для измерения сухого веса HRs высушивали в сухожаровом шкафу при 105 °C в течение 16 ч. Все испытания велись в 64 биологических повторностях (n = 64). Достоверность различий проверяли относительно контрольного варианта волосовидных корней без трансгена NtEXPA5 по критерию Дункана [10].

Для проведения биохимического анализа опосредованных стрессом изменений антиоксидантной системы культуры волосовидных корней выращивали в течение 30 дней в условиях действия стресс-факторов. Активность ферментативных систем выражалась в мг общего растворимого белка. Общую антиоксидантную активность пересчитывали на г сырого веса HRs. Все биохимические исследования по определению активности антиоксидантной системы проводили в 15 биологических повторностях (n = 15). Достоверность различий рассчитывали относительно HRs без трансгена NtEXPA5 (контрольный вариант) по критерию Дункана [10].

Для определения активности супероксиддисмутазы (СОД) применяли метод, основанный на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием за супероксид-анионы [11]. Пероксидазную активность определяли по способности полимеризации гваякола до тетрагваякола [12]. Каталазную активность проверяли по скорости деградации молекул перекиси водорода [13]. Общая антиоксидантная активность (ОAА) оценивалась на метанольных (80 %) экстрактах по восстановлению Mo(VI) до Mo(V) при кислом pH [14]. Содержание общего растворимого белка определяли по методу Бредфорда [15].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Первая часть работы была посвящена отбору небольшого числа линий волосовидных корней с повышенной экспрессией гена NtEXPA5. Из 24 линий для морфометрического анализа были отобраны 6 линий волосовидных корней, которые мы обозначили как E1–E6. Во всех этих шести линиях выявлялся наиболее высокий уровень транскрипционной активности трансгена NtEXPA5. При нормальных условиях трансгенные волосовидные корни росли в длину на 38 % быстрее в среднем для всех линий, чем контрольные варианты (дикий тип, WT). При действии хлорида натрия также трансгенные HRs росли лучше дикого типа на 28 %, в среднем для всех линий (рис. 1, а). Только волосовидные корни линии E1 росли в длину медленнее контроля. В условиях загрязнения среды сульфатом меди трансгенные HRs также росли лучше дикого типа на 36 %, в среднем для всех линий (рис. 1, а). На среде с ацетатом кадмия все линии трансгенных волосовидных корней были больше по длине, чем в контроле, на 39 % в среднем. При действии 75 мМ маннитола трансгенные волосовидные корни были длиннее контрольных вариантов также в среднем на 39 % (рис. 1, а).

Таким образом, волосовидные корни табака, сверхэкспрессирующие ген NtEXPA5, растут в длину быстрее дикого типа как при нормальных условиях, так и при действии стрессовых факторов. Однако наибольший интерес представляет продуктивность исследуемых линий HRs, что может и не коррелировать с их ростом в длину. Наиболее полно отражает наработку биомассы волосовидных корней их сухой вес. При нормальных условиях все трансгенные линии, кроме E3, накапливали больший сухой вес, чем дикий тип (рис. 1, b). В среднем разница с контролем составила 33 % для всех линий. В условиях засоления хлоридом натрия все линии трансгенных HRs набирали больше сухого веса на 50 %, в среднем для всех линий. При действии CuSO₄ сухой вес трансгенных HRs был больше контрольных вариантов в среднем на 49 %. В условиях кадмиевого загрязнения волосовидные корни 35S::NtEXPA5 росли лучше дикого типа на 296 %, в среднем для всех линий. При действии маннитола сухой вес трансгенных HRs был еще больше и превысил показатели контроля на 390 % в среднем для всех линий (рис. 1, b).

Рис. 1. Морфометрический анализ волосовидных корней с конститутивной экспрессией гена NtEXPA5: а — прирост корней в длину за 30 дней культивации; b — сухой вес корней через 30 дней культивации. WT — дикий тип (контроль), Е1–Е-6 — линии HRs. Звездочками обозначены достоверные различия от контроля согласно критерию Дункана (p < 0,05)

Исходя из полученных данных, следует, что волосовидные корни 35S::NtEXPA5 характеризуются не только повышенной продуктивностью, но и большей стрессоустойчивостью по сравнению с HRs дикого типа. Механизмы участия экспансинов в обеспечении роста растений в целом уже известны, однако как именно они влияют на стрессоустойчивость пока не совсем ясно. Безусловно, при повышении стрессоустойчивости должны быть затронуты компоненты антиоксидантной системы. Поэтому была поставлена задача определить в волосовидных корнях активность СОД, каталаз, пероксидаз и общую антиоксидантную активность при нормальных условиях и при действии стрессовых факторов. Для этих экспериментов случайным образом были отобраны линии HRs E1, E4 и E6.

При нормальных условиях волосовидные корни 35S::NtEXPA5 отличались от контрольных вариантов повышенной активностью СОД, каталаз и общей антиоксидантной активности (рис. 2, а, b, d). Лишь по активности пероксидаз трансгенные HRs не отличались от дикого типа (рис. 2, c). В условиях засоления хлоридом натрия для всех линий трансгенных волосовидных корней было характерно повышение активности СОД и каталаз. Повышение пероксидазной активности над контролем было характерно только для линий E1 и E4 (рис. 2, с). При действии 75 мМ маннитола наблюдали повышенную активность СОД и общей антиоксидантной активности (ОАА) во всех анализируемых линиях по сравнению с контролем (рис. 2, а, d). При этом каталазная активность в трансгенных линиях была, наоборот, ниже контроля.

Рис. 2. Анализ антиоксидантной системы культур волосовидных корней с конститутивной экспрессией гена NtEXPA5: а — активность супероксиддисмутазы; b — каталазная активность; c — пероксидазная активность; d — общая антиоксидантная активность. Звездочками обозначены достоверные различия от контроля согласно критерию Дункана (p < 0,05)

ОБСУЖДЕНИЕ

Конститутивная экспрессия гена NtEXPA5 способствовала увеличению биомассы волосовидных корней как при нормальных условиях, так и при действии стрессовых факторов. Наибольшая разница с контролем выявлялась при действии кадмия и маннитола (рис. 1, b). В литературе имеются данные о повышении устойчивости волосовидных корней арахиса Arachis hypogaea сверхэкспрессирующих ген экспансина AdEXLB8 к нематодам Meloidogyne arenaria [16]. Однако, судя по всему, на сегодняшний день эффекты конститутивной экспрессии генов экспансинов на устойчивость волосовидных корней к абиотическим стрессовым факторам не изучались. В то же время имеются работы по повышению стрессоустойчивости HRs при помощи ряда других трансгенов. К примеру, трансгенные по двум генам пероксидаз (tpx1 и tpx2) HRs N. tabacum показали повышенную устойчивость к фенолу [17], а внедрение гена протеинкиназы GmBIN2 в HRs сои повышало их устойчивость к соли и дефициту влаги [18]. Эти работы говорят об актуальности проводимых нами исследований по созданию стрессоустойчивых волосовидных корней. Таким образом, гены экспансинов можно использовать не только для повышения продуктивности HRs, но и для увеличения их стрессоустойчивости.

В нормальных условиях волосовидные корни 35S::NtEXPA5 характеризовались увеличением активности СОД, каталаз и повышением общей антиоксидантной активности (рис. 2). То есть трансгенные волосовидные корни были изначально готовы расти лучше контроля при действии стрессовых факторов. Ранее на примере трансгенных растений табака было показано, что сверхэкспрессия гена TaEXPB23 способствует повышению пероксидазной активности [19]. Однако в трансгенных HRs 35S::NtEXPA5 пероксидазная активность не повышалась, ни при нормальных условиях, ни при действии стрессовых факторов (рис. 2). Наоборот, при действии маннитола активность пероксидаз в исследованных нами волосовидных корнях уменьшалась. В другой работе этих же авторов описаны трансгенные растения табака, экспрессирующие ген TaEXPB23, под контролем корнеспецифичного промотора [20]. В этом случае авторами уже были получены данные о повышении активности СОД и каталаз в корнях трансгенных растений, что в целом совпадает с нашими результатами. Такое совпадение может быть связано с особенностями проявления трансгенов экспансинов в корнях растений.

При засолении волосовидные корни 35S::NtEXPA5 характеризовались увеличением скорости роста, сухого веса, активности антиоксидантных ферментов и ОАА. Похожие данные были получены С. Jadamba и соавт. [21] на трансгенных растениях, которые показали, что сверхэкспрессия гена риса OsEXPA7 способствует увеличению солеустойчивости, уменьшению количества активных форм кислорода (АФК) и увеличению общей антиоксидантной активности.

При действии маннитола волосовидные корни 35S::NtEXPA5 характеризовались увеличением скорости роста, сухого веса, активности СОД и ОАА. Хорошо известно, что маннитол, как и полиэтиленгликоль, вызывает в растениях дефицит влаги [20, 22]. Ранее было показано, что сверхэкспрессия гена экспансина TaEXPA2 способствует увеличению устойчивости к дефициту влаги как в трансгенных растениях табака [22], так и в трансгенных растениях мягкой пшеницы [23]. Причем эти трансгенные растения характеризовались уменьшением содержания АФК, увеличением активности ряда антиоксидантных ферментов и ОАА.

Общим эффектом конститутивной экспрессии гена NtEXPA5 как при нормальных условиях, так и при действии стрессовых факторов было увеличение активности СОД и ОАА во всех проанализированных линиях HRs. Полученные нами результаты в совокупности с данными литературы говорят, что экспансины оказывают свой позитивный эффект на продуктивность и стрессоустойчивость растений не только через влияние на рост клеток растяжением, но и через воздействие на антиоксидантную систему. Вероятнее всего, особенности влияния экспансинов на антиоксидантую активность связаны с регуляцией роста в общей сети клеточной сигнализации. К примеру, в нашем исследовании под влиянием экспансина NtEXPA5 не повышалась только пероксидазная активность. Действительно, имеются данные о негативном влиянии пероксидаз на клеточное растяжение за счет стимуляции лигнификации [24], поэтому при регуляции роста экспансины и пероксидазы могут выступать в качестве антагонистов. Однако при этом до сих пор остается без ответа весьма интригующий вопрос: каков конкретный механизм влияния белков клеточной стенки — экспансинов, которые известны в основном лишь как регуляторы роста клеток растяжением, на антиоксидантную систему?

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Источник финансирования. Работа выполнена в рамках государственного задания (№ AAAA-A19-119021190011-0) при поддержке грантов Президента РФ (№ МД-2304. 2020.4) и РФФИ (№ 18-04-00118 А).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Об авторах

Булат Разяпович Кулуев

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Башкирский государственный университет»

Автор, ответственный за переписку.
Email: kuluev@bk.ru
ORCID iD: 0000-0002-1564-164X
SPIN-код: 8580-5347
Scopus Author ID: 23094029400
ResearcherId: N-3927-2016

д-р биол. наук, заведующий лабораторией геномики растений

Россия, 450054, Уфа, пр. Октября, д. 71; Уфа

Халит Галеевич Мусин

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук

Email: khalit.musin@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7336-2027
SPIN-код: 8966-4290
ResearcherId: P-2298-2017

Младший научный сотрудник лаборатории геномики растений

Россия, 450054, Уфа, пр. Октября, д. 71

Альфира Буребаевна Якупова

Институт биохимии и генетики – обособленное структурное подразделение Федерального государственного бюджетного научного учреждения Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук; Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Башкирский государственный университет»

Email: alfiram@yandex.ru
SPIN-код: 1480-4353
Scopus Author ID: 36344236800

канд. биол. наук

Россия, 450054, Уфа, пр. Октября, д. 71; Уфа

Список литературы

Дополнительные файлы