Способность продуктов фотохимического разложения гербицида Раундап индуцировать окислительный стресс в бактериальных клетках

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Вещество с тривиальным названием «глифосат (Гл)» входит в состав более чем 20 коммерческих препаратов, в частности в Раундап (Рп) [*]. Он является самым распространенным по объему производства и применения в практике сельского хозяйства в мире [1]. Это неселективный системный гербицид, который используется для борьбы с сорняками, особенно многолетними. Действующее вещество имеет систематическое название N-фосфонометилглицин (N-ФМГ, N-phosphonomethylglycine) — фосфорорганическое вещество, относящееся к фосфонатам.

Согласно результатам многочисленных исследований, используемые гербициды и продукты их разложения загрязняют обрабатываемые территории [2, 3]. Причем Гл и его основные продукты распада, в частности аминометилфосфорная кислота (АМФК), ответственны за почти повсеместное загрязнение поверхностных и подземных вод [4]. По отношению к культурным растениям, например Allium cepa L. и Zea mays L., Рп показал высокую токсичность [5, 6]. Сорные виды растений, являющиеся объектом применения Рп или Гл, имеют способность быстро привыкать к нему, в связи с чем применяемые дозы периодически повышаются [7–10]. Ряд гербицидов, в том числе Рп, образует хелатные комплексы с металлами [11, 12] и взаимодействуют с оксидом алюминия [13]. Такого типа комплексы имеют значительно более высокие константы связывания с аденином, нуклеотидами и рядом других биологических молекул. В результате этого их химическая и биологическая устойчивость, а также токсикологические эффекты значительно возрастают [14, 15]. Остаточные количества Рп (Гл) и продукты его разложения содержатся в основных продуктах пищи, таких как сахар, кукуруза, соя и пшеница [16].

Как и другие гербициды, Рп негативно влияет на почвенные и водные организмы, проявляя высокую токсичность и резко снижая их численность [3, 14, 15]. Попадая с пищей в организм человека, Рп поражает органы пищеварительной и выделительной систем, становится причиной многих заболеваний [2, 3, 17–19]. В том числе Гл оказывает существенное влияние на окисление жиров и полипептидов. Характер воздействия меняется: при высоких концентрациях (10^–3–10^–6 моль/л) снижается интенсивность процессов перекисного окисления, а в низких — увеличивается интенсивность этих реакций для липидов и белков [20–22].

Одним из механизмов действия Рп является ингибирование холинэстеразных ферментов [23]. Зафиксировано подавление Рп активности мальтазы и пептидазы у гидробионтов, ингибирование активности фермента окислительно-восстановительной системы НАДН-оксидоредуктазы in vitro гербицидами Лонтрел, Рп, Зенкор, Базагран, Кузагард, Сетоксидим и комплексами Лонтрела с металлами [24, 25].

Ферменты цитохрома P450 (CYP) играют решающую роль в метаболизме животных и растений. В частности, участвуют в детоксикации ксенобиотиков. Ингибирование Гл ферментов CYP — недооцененный компонент его токсичности для млекопитающих. Таким путем Гл усиливает повреждающее действие химических веществ и токсинов, попадающих в организм из окружающей среды. Негативное воздействие на организм коварно и проявляется медленно с течением времени, поскольку воспаление повреждает клеточные системы во всем организме. Кроме ингибирования ферментов CYP Гл нарушает биосинтез ароматических аминокислот кишечными бактериями и транспорт сульфата в сыворотке. Все эти процессы синергически усиливают друг друга и совокупное действие на организм в целом [16].

Гербициды вызывают серьезные нарушения в антиоксидантной системе и индуцируют окислительный стресс, перекисное окисление липидов и снижают уровни восстановленного глутатиона и антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионредуктазы в ткани печени, что является предполагаемым токсико-динамическим путем окислительного стресса [26]. Имеется ряд указаний на генотоксический потенциал гербицида Рп [26–31] как его наиболее опасное действие. Окислительная фрагментация ДНК является важным механизмом генетического повреждения [28–30]. Рп изменяет экспрессию генов в печени, в частности TP53. Образование апуриновых/апиримидиновых повреждений ведет к разрывам в цепи ДНК и неправильному свертыванию белков [27]. Установлены общие молекулярные механизмы, связанные с генерацией активных форм кислорода (АФК) при воздействии Гл или через его метаболит— AMФК [31, 32].

Как результат этих биохимических нарушений, происходящих в результате действия Рп (Гл), возникают эмбриотоксические, гемотоксические, цитотоксические и генотоксические изменения в организме человека и животных [17, 18, 33], снижается фертильность, наблюдаются канцерогенные и тератогенные нарушения [19, 34, 35]. По классификации Международного агентства по изучению рака (МАИР) Всемирной организации здравоохранения с 2015 г. Рп находится в группе канцерогенов 2А [36, 37].

Фитотоксический эффект гербицидов зависит от того, насколько долго они сохраняются на листьях. Это зависит от рецептуры гербицидов, которая, наряду с действующим веществом, содержит вспомогательные вещества, усиливающие смачиваемость листьев и проникновение молекул гербицида в клетки растений. Поэтому после обработки на листьях растений длительное время сохраняются капли гербицида, который, находясь под воздействием лучей солнца, подвергается разложению. В этой связи имеется ряд публикаций по изучению продуктов фоторазложения Гл [38–41]. Например, ранее нами показано, что при облучении раствора N-ФМГ светом с длин волн λ = 250–600 нм в течение 14 ч образуется генотоксичный продукт, способный индуцировать SOS-ответ у биосенсора K12 — MG1655 (pColD-lux). При этом необлученный раствор N-ФМГ не обладал такой активностью [41].

Несмотря на все имеющиеся данные, острейшими для ученых-экологов остаются вопросы: во-первых, каковы продукты разложения N-ФМГ; во-вторых, каковы наиболее эффективные способы очистки питьевой воды от N-ФМГ и продуктов его разложения.

Были исследованы различные процессы обработки природной и питьевой воды для снижения в ней концентрации гербицидов и сведения к минимуму потенциальных рисков для здоровья, связанных с воздействием этих химических веществ при потреблении загрязненной воды [42, 43]. Со временем исследователи пришли к выводу, что усовершенствованные процессы окисления являются ключевой технологией для решения проблем загрязнения гербицидами как при очистке питьевой воды, так и при очистке сточных вод [44]. В работах [45–47] в условиях воздействия УФ-излучения исследовалось параллельное влияние ряда других факторов, таких как катализатор, рН, введение H₂O₂. В нашей предыдущей статье кроме УФ-излучения применялось воздействие озоном [41].

Следует подчеркнуть, что проведено очень мало исследований основных продуктов разложения Гл (Рп), но представленные результаты неоднозначны. В исследовании [45] утверждается, что AMФК — основной метаболит, обладающий высокой устойчивостью и низкой токсичностью. Микроядерным анализом in vitro на линии клеток яичника китайского хомячка (Chinese Hamster) CHO-K1 в работе [46] для Гл и АМФК показана цитогенетическая токсичность, которая увеличивалась в 100 раз после светового облучения. Оценка внутриклеточных АФК позволила предположить участие окислительного стресса в генотоксическом воздействии Гл.

Столь же противоречивые мнения высказываются о возможном пути фоторазложения N-ФМГ. В обзоре [47] анализируется значительное количество данных и приводятся два пути образования продуктов реакции. Однако устойчивыми соединениями называются глицин, саркозин, формальдегид, а не AMФК, и процесс их образования не сопряжен с ней. В нашей предыдущей статье методом хромато-масс-спектрометрии (МС) были установлены продукты фоторазложения, среди которых не было идентифицировано АМФК [41]. С нашей точки зрения, это легко объяснить, поскольку существуют определенные трудности стабилизации фосфатной группы в составе молекул [48]. А продукты, образующиеся при гидролитическом отщеплении фосфатной группы, сильно стабилизируются за счет сопряжения [48].

В исследованиях причин возникновения и путей формирования генотоксичности веществ и гербицидов, в частности, эффективно использование lux-биосенсоров на основе штамма E. coli K12: MG1655 (pSoxS-lux) и MG1655 (pKatG-lux) [49–51], а также pColD-lux [52], несущих рекомбинантную плазмиду с lux-опероном люминесцирующей бактерии Photorhabdus luminescens, слитым с промоторами генов супероксиддисмутазы, каталазы и колицина соответственно. Промотор pKatG (белок-активатор OxyR) специфически реагирует на перекись водорода и другие пероксиды, тогда как промотор pSoxS (белок-активатор SoxR) специфически реагирует на супероксидный анионрадикал. Для SOS-биосенсора, реагирующего на повреждения ДНК, использован промотор pColD колицинового гена, входящего в SOS-регулон. Штаммы E. coli, несущие lux-оперон, под воздействием индукторов окислительного стресса или ДНК-повреждающих агентов начинают активно продуцировать люциферин-люциферазный комплекс, что приводит к повышению уровня биолюминесценции [53].

Цель настоящей работы — исследование с помощью lux-биосенсоров на основе Escherichia coli способности продуктов фотохимического разложения N-ФМГ индуцировать окислительный стресс в бактериальных клетках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали действующее вещество гербицида Раундап [Глифосат, N-фосфонометилглицин (N-ФМГ, C₃H₈NO₅P)], очищенное двойной перекристаллизацией из бидистиллированной воды (рис. 1) [54].

 

Рис. 1. Химическая формула N-фосфонометилглицина

Fig. 1. Chemical formula of N-phosphonomethylglycine

 

В работе использовали бактериальные lux-биосенсоры: E. coli K12 MG1655 (pSoxS-lux) и E. coli K12 MG1655(pKatG-lux) [55–57]. В тексте они обозначены как биосенсоры pSoxS-lux и pKatG-lux. Данные биосенсоры содержат рекомбинантную плазмиду, включающую промоторы генов супероксиддисмутазы soxS и каталазы katG, слитые с lux-опероном Photorhabdus luminescens. В клетке штамма pSoxS-lux ген супероксиддисмутазы транскрибируется при повышении концентрации супероксид-аниона, и, соответственно, транскрипции подвергается и lux-оперон, что приводит к люминесценции клетки с интенсивностью, пропорциональной концентрации супероксид-аниона. Аналогичным механизмом работы обладает и штамм pKatG-lux, где ген каталазы, слитый с lux-опероном, транскрибируется при повышении концентрации в клетке пероксида водорода, что приводит к люминесценции с интенсивностью, пропорциональной его концентрации в клетке. Перечисленные биосенсоры предоставлены Г.Б. Завильгельским и И.В. Мануховым (ГосНИИгенетика, Москва).

Хранение и культивирование бактериальных культур осуществляли с помощью твердых, с добавлением агара, и жидких питательных сред LB (Луриа – Бертани). Среды содержали ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Для опытов использовали культуры биосенсоров KatG-lux и pSoxS-lux в жидкой питательной среде LB.

Ночные культуры биосенсоров разбавляли в свежей жидкой среде LB, доводя содержание бактерий до концентрации 10⁷ кл/мл, и инкубировали при 37 °C в течение 120 мин с аэрацией до достижения ранней экспоненциальной фазы. Далее культуры переносили в 96-луночный планшет по 180 мкл в каждую лунку. Ряд контрольного образца заполняли дистиллированной водой по 20 мкл в лунку. Следующие ряды лунок заполняли различными разведениями облученного N-ФМГ (N-ФМГобл). В последний ряд — по 20 мкл N-ФМГ в концентрации 0,01 М в качестве положительного контроля в lux-тесте. Далее культуры в заполненных планшетах культивировали течение 1 ч при 37 °C и определяли интенсивность люминесценции биосенсоров с помощью люминометра — микропланшетного ридера StatFax 4400 (Awareness Technology Inc., США), где за единицу измерения для люминесцентного ответа принимали условные единицы светового потока (RLU). Вышеперечисленные опыты проводили не менее трех раз с восемью повторениями в каждом.

Для пересчета люминесценции на 1000 жизнеспособных клеток были проведены эксперименты по одновременному определению люминесценции и выживаемости биосенсоров pSoxS-lux и pKatG-lux непосредственно в инкубационной смеси в лунках планшета в зависимости от разведения N-ФМГобл. Для этого по истечении времени инкубации экспериментальной смеси замеряли интенсивность биолюминесценции. Затем содержимое каждой лунки серийно разводили в 0,9 % растворе натрия хлорида до 10^–6, 10^–5 и 10^–2 для последующего высева в чашки Петри с агаризованной питательной средой LB. Через 19 ч инкубации при 37 °C учитывали число выросших колоний и пересчитывали на число колониеобразующих единиц в 0,2 мл суспензии бактерий. Значение люминесценции делилось на число КОЕ для соответствующей концентрации N-ФМГобл и умножалось на 1000. Полученный коэффициент показывал относительную люминесценцию 1000 КОЕ.

Все эксперименты выполнены в трех повторностях. Полученные в ходе опытов данные обработали стандартными статистическими методами. Вычисляли средние значения показателей. Значимость различий средних значений определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Для вывода о статистической значимости различий полученных данных считали достаточной вероятность ошибки p < 0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кинетика и продукты разложения N-ФМГ под действием УФ-излучения и озона

Гербициды считаются безвредными для растений на том основании, что они разлагаются под действием УФ-компоненты солнечного излучения, почвенных микроорганизмов и в результате метаболизма внутри самого растения. Скорость разложения N-ФМГ под действием исключительно солнечного света, измеренная в наших экспериментальных условиях, составила 2,8 × 10^–4 М/ч [41].

Ранее нами была выполнена работа, в которой постарались смоделировать естественные природные условия, в которых оказывается гербицид после нанесения на растения: УФ-излучение солнца, влага (роса, дождь, поверхностные или подземные воды), озон (образующийся при грозовом разряде) [41]. Зарегистрировано разложение N-ФМГ под действием излучения ртутной лампы ДРШ-1000. Была обнаружена неаддитивность совместного действия УФ-излучения и озона на разложение N-ФМГ: скорость процесса во много раз превосходила скорости, регистрируемые при одном лишь облучении раствора или при одном барботаже озона через раствор реагента. Установлено, что реакция разложения N-ФМГ при совместном действии УФ-излучения и озона протекает со значительно более высокой скоростью (0,406 М/ч), чем при раздельном использовании УФ-излучения или озона [41].

Процесс разложения имеет сложный многоступенчатый характер. Как видно из рис. 2, на регистрируемых в процессе разложения N-ФМГ электронных спектрах прослеживается ряд промежуточных соединений, возникающих в разные периоды облучения. Так, через 1,0 ч от начала облучения в растворе появляется пик с λ₂ = 195 нм, который в дальнейшем присутствует во всех пробах. После 3,8 ч облучения идентифицируется пик λ₄ = 258 нм, который присутствует в пробах до 8,1 ч наблюдения. Однократно идентифицирован пик λ₅ = 238 нм через 5,3 ч. Пик λ₃ = 286 нм появляется через 2,8 ч, после этого через 1,0 ч исчезает и появляется вновь в пробе от 11,3 ч и так же более не идентифицируется. Это указывает на сложный многоступенчатый процесс разложения N-ФМГ.

 

Рис. 2. Изменение спектра поглощения реакционной смеси в процессе фотохимического разложения водного раствора N-фосфонометилглицина при совместном воздействии УФ-излучения и озона от времени: 1 — интенсивность поглощения при λ = 212 нм; 2 — 195 нм; 3 — 286 нм; 4 — 258 нм; 5 — 238 нм. По данным работы [41]

Fig. 2. Change in the absorption spectrum of the reaction mixture during the photochemical decomposition of an aqueous solution of N-phosphonomethylglycine under the combined influence of UV radiation and ozone over time: 1 — absorption intensity at λ = 212 nm; 2 — 195 nm; 3 — 286 nm; 4 — 258 nm; 5 — 238 nm. According to work [41]

 

Синергизм действия УФ-излучения и озона можно объяснить, приняв во внимание способность озона фотолизоваться при поглощении кванта УФ-излучения:

О₃ + hv → O* + O_{2 (1)}

Возникающий при этом атомарный кислород может непосредственно взаимодействовать с N-ФМГ, индуцируя процесс его окисления, включающий многоступенчатую последовательность превращений, в которой возникают продукты, некоторые из которых идентифицированы нами.

Для определения состава продуктов фотохимического разложения был выполнен анализ растворов N-ФМГобл с помощью МС [41]. Исходный N-ФМГ характеризовался пиком депротонированной молекулы с m/z 168, что соответствует составу [C₃H₇NO₅P]^–1. В образце, находившемся в темноте на воздухе при температуре 25 °C в течение 14,3 ч, появляются некие примеси, однако их существенно меньше, чем основного вещества — N-ФМГ. В пробе, содержащей облученный и озонированный раствор, даже следы N-ФМГ не были найдены, то есть N-ФМГ был полностью разрушен.

Использование МС высокого разрешения [58] позволило установить точные массы продуктов деструкции для образца (УФ + озон; 14,3 ч) и, как следствие, их элементные составы [41]. В табл. 1 приведены состав и наиболее вероятная структура фрагментов, образующихся в процессе фотохимического разложения под действием УФ-излучения и озона. Видно, что были зарегистрированы пики, соответствующие депротонированным молекулам продуктов разложения исходного N-ФМГ.

 

Таблица 1. Состав и структура фрагментов, образующихся в процессе фотохимического разложения N-фосфонометилглицина, согласно данным масс-спектрометрии [41] Table 1. Composition and structure of fragments formed during the photochemical decomposition of N-phosphonomethylglycine, according to mass spectrometry data [41]
Номер продукта	m/z	Состав	Структура
1	86,02510	C3H4O2N
2	100,00427	C3H2O3N
3	102,01995	C3H4O3N
4	104,03557	C3H6O3N
5	121,02968	C3H7O4N		или

 

Активность систем окислительного стресса под действием продуктов фоторазложения N-ФМГ

Продукты фоторазложения N-ФМГ (N-ФМГобл) индуцировали интенсивную люминесценцию биосенсоров pKatG-lux и pSoxS-lux при инкубации в течение 90 мин (рис. 3). Это указывают на то, что N-ФМГобл прямо или опосредованно генерирует в бактериях E. coli такие оксидативные соединения, как супероксид-анион и пероксид водорода. Данные вещества являются сильными источниками оксидативного стресса для живых организмов. Окислительное повреждение клетки может носить не только цитотоксический характер, но и вызывать повреждения в ДНК бактерий.

 

Рис. 3. Люминесценция pKatG-lux и pSoxS-lux с N-ФМГобл в условных единицах светового потока

Fig. 3. Luminescence of pKatG-lux and pSoxS-lux with N-PMGirr in arbitrary units of luminous flux

 

Проведены эксперименты с целью определения выживаемости бактерий, то есть способности образовывать колонии (КОЕ), при воздействии N-ФМГобл в различных концентрациях. Для этого по истечении времени инкубации экспериментальной смеси аликвоту бактерий объемом 0,1 мл серийно разводили в 0,9 % растворе натрия хлорида до 10^–6. Затем по 0,1 мл из разных разведений высевали на агаризованную питательную среду LB в чашках Петри.

Через 19 ч инкубации при 37 °C учитывали число выросших колоний, являющееся показателем КОЕ (табл. 2).

 

Таблица 2. Зависимость выживаемости бактерий биосенсоров (число КОЕ в 0,1 мл культуры) от концентрации N-ФМГобл Table 2. Dependence of the survival of biosensor bacteria (number of CFUs in 0,1 mL suspensions) at concentration of N-PMGirr
Lux-биосенсор	Вода (контроль)	Разведение N-ФМГобл
		1 : 10	1 : 2	не разведен
pKatG-lux	5,11 ± 0,39 × 107	4,67 ± 0,55 × 107	4,73 ± 0,58 × 106	3,14 ± 0,56 × 105*
pSoxS-lux	5,46 ± 0,16 × 107	5,75 ± 0,08 × 107	4,54 ± 0,35 × 106*	2,83 ± 0,55 × 105**
Статистически значимые различия между контролем и вариантами с N-ФМГобл: *р ≤ 0,05; **р ≤ 0,001. Statistically significant differences between the control and variants with N-PMGirr: *р ≤ 0.05; **р ≤ 0.001.

 

Из данных, представленных в табл. 2, следует, что с увеличением концентрации N-ФМГобл значительно снижется число КОЕ в культуре клеток. Так, в случае биосенсора pKatG-lux в контроле число жизнеспособных бактерий составило 5,11 × 10⁷, при воздействии разбавленного 1 : 10 раствора N-ФМГобл выживаемость бактерий не отличалась от контрольного значения. Более высокие концентрации N-ФМГобл, разбавленного 1 : 2 и неразбавленного, снижали выживаемость бактерий в 10 и более чем в 100 раз соответственно. Подобные же результаты были получены и в случае биосенсора pSoxS-lux.

С целью определения изменения интенсивности люминесцентного ответа в зависимости от концентрации N-ФМГобл для фиксированного количества бактерий был проведен опыт по одновременному определению люминесценции и выживаемости бактерий биосенсоров pSoxS-lux и pKatG-lux непосредственно в культивируемой суспензии в ячейках планшета. Для этого через 90 мин инкубации суспензии считывали данные по люминесценции. Затем содержимое каждой лунки (0,2 мл) серийно разводили 0,9 % раствором натрия хлорида до 10^–6, 10^–5 и 10^–2 для последующего высева в чашки Петри с агаризованной питательной средой LB. Через 19 ч инкубации при 37 °C учитывали число выросших колоний и пересчитывали на число колониеобразующих единиц в 0,2 мл суспензии бактерий. Полученные результаты приведены в табл. 3.

 

Таблица 3. Зависимость интенсивности люминесцентного ответа и выживаемости клеток биосенсоров pKatG-lux и pSoxS-lux от концентрации N-ФМГобл Table 3. Dependence of the intensity of the luminescent response and cell survival of the biosensors pKatG-lux and pSoxS-lux on the N-PMGirr concentration
Lux-биосенсор	N-ФМГобл	Число КОЕ в 0,2 мл культуры	Люминесценция 0,2 мл культуры	Люминесценция на 1000 КОЕ
pKatG-lux	Вода (контроль)	5,22 ± 0,44 × 108	2938 ± 109	0,005
	1 : 10	4,71 ± 0,51 × 108	3328 ± 86	0,007
	не разведенный	3,34 ± 0,40 × 106	4092 ± 131	1,2*
pSoxS-lux	Вода (контроль)	4,19 ± 0,28 × 108	5932 ± 109	0,014
	1 : 10	3,62 ± 0,39 × 108	7157 ±115	0,02
	не разведенный	2,50 ± 0,38 × 106	9137 ± 125	3,65*
*Наиболее значимые результаты. *The most significant results.

 

Для вычисления интенсивности люминесцентного ответа биосенсоров pSoxS-lux и pKatG-lux на 1000 жизнеспособных клеток был проведен следующий расчет. Показатель интенсивности люминесцентного ответа биосенсора при определенной концентрации N-ФМГобл делили на число КОЕ в лунке при этой концентрации и умножали на 1000. Полученный коэффициент показывал относительную люминесценцию 1000 КОЕ. В контрольном образце, не обработанном N-ФМГобл, люминесценция 1000 бактерий pKatG-lux и pSoxS-lux составляла 0,005 и 0,014 отн. ед. соответственно. Люминесценция 1000 КОЕ бактерий pKatG-lux и pSoxS-lux при добавлении неразведенного N-ФМГобл превышала контрольную в 240 и 261 раз, составляя 1,2 и 3,65 отн. ед. В варианте эксперимента с использованием N-ФМГобл в десятикратном разведении люминесценция 1000 клеток pKatG-lux и pSoxS-lux составляла 0,007 и 0,02 отн. ед. соответственно.

Из этих данных становится очевидно, что интенсивность экспрессии гена фермента оксидативного стресса супероксиддисмутазы в жизнеспособных клетках биосенсора с повышением концентрации N-ФМГобл не уменьшается, а растет. Таким образом, с ростом концентрации N-ФМГобл часть клеток гибнет, а у оставшейся наблюдается усиление активности систем окислительного стресса (табл. 3).

Химические реакции, приводящие к образованию супероксидного анион-радикала из N-ФМГ под действием УФ-излучения и озона

В табл. 1 приведены продукты фотохимического разложения N-ФМГ. Можно предположить нижеследующую схему их образования. В жестких окислительных условиях, в которых оказался N-ФМГ — водная среда при воздействии УФ и озона (продуцирующего как О₂^–, так и О^•) — в возбужденное состояние переходит вся молекула N-ФМГ. Электроны переходят с π-связывающих на π-разрыхляющие уровни молекулы, что ведет к ее распаду. На первой стадии происходит потеря протона (–H⁺) с образованием стабильного промежуточного аниона, который мы можем регистрировать с помощью МС (m/z 168,0 [C₃H₇NO₅P]^–1) и УФ-спектроскопии (λ = 195 нм). Стабильность этого аниона можно объяснить делокализацией электронов по всей молекуле с задействованием сопряженных двойных связей С=О, Р=О и неподеленных электронных пар азота и кислорода (2).

 

 

От какой из кислотных группировок — карбонильной или фосфорной — происходит отщепление протона можно только предполагать, но очевидна вероятность обоих путей. Скорее всего, обе частицы находятся в равновесном состоянии.

На следующей, наиболее вероятной, стадии связь фосфор – углерод достаточно легко гидролизуется, при этом атом фосфора окисляется в условиях среды от валентности формально (+4) в N-ФМГ (из-за делокализации электронов), до наиболее стабильной валентности (+5). В результате отщепляется фосфорная кислота Н₃РО₄. Анионы РО₃^– с m/z 78,95941 и H₂PO₄^– с m/z 96,96990 идентифицировали в МС.

 

 

В образовавшемся интермедиате — анионе (*), атом азота своей неподеленной электронной парой участвует в сопряжении с карбоксильной группой. В результате облако π-электронов распределяется по всей молекуле. Этот анион достаточно стабилизирован и из него в условиях среды возможны последующие реакции по нескольким направлениям: а) из окислительного депротонирования атома азота образуется соединение № 1, идентифицируемое в МС с m/z 86,02510.

 

 

Из полученного соединения, при окислении метильной группы (б), связанной с атомом азота, образуется соединение № 2 с m/z 100,00427, альдегидная группировка которого сопряжена с неподеленной электронной парой атома азота, что стабилизирует эту частицу.

 

 

В условиях применяемой агрессивной окислительной среды идут дальнейшие окислительные реакции с образовавшимися интермедиатами по их легко окисляемым позициям — атому азота и метильной группировке, связанной с атомом азота.

В результате последовательно (в, г) образуются соединения № 4 с m/z 104,03557, а затем (г) № 5 с m/z 121,02968.

 

 

В указанных условиях, азот легко окисляется до гидроксиаминовой (N–OH) группировки, с образованием 2-(N-гидроксиметил-гидроксиамин) этановой кислоты, соединения № 5:

 

 

Возможны и другие параллельные пути реакции окисления интермедиатов. В том числе и окисление углерода, находящегося в α-положении по отношению к карбонильной группе с образованием гидроксильной группы в этом положении — соединение № 3, имеющее m/z 102,01995, как показано на схеме (рис. 4).

 

Рис. 4. Схема потенциальных реакций окисления N-ФМГ по α-углеродному атому

Fig. 4. Scheme of potential reactions of N-PMG oxidation at α-carbon atom

 

Как видно из табл. 1, продукты фотохимического разложения № 1–4 имеют одну, две или даже три двойные связи. Значительные избыточные электронные плотности обусловливает их восстановительную природу.

Особый интерес вызывает продукт № 5, имеющий m/z 121,02968 и состав C₃H₇O₄N.

 

 

Соединение № 5 — алифатический гидроксиамин: 2-(N-гидроксиметил-гидроксиамин) этановая кислота, является окислителем и способно к реакции диспропорционирования, приводящей к образованию короткоживущего и высоко активного нитроксильного радикала.

 

 

В результате переноса протона (Н⁺) неспаренный электрон локализуется на разрыхляющей π*-орбитали, образованной из 2p_z-орбиталей атомов азота и кислорода. Гибридизация связей атома азота близка к sp². В литературе встречаются указания на то, что при отсутствии возможности делокализации неспаренного электрона, образуется крайне нестабильный молекулярный ион [59]. Алкильные радикалы быстро реагируют с кислородом [60, 61] c образованием супероксидного анион-радикала (^•O^–2) — одной из самых активных форм кислорода, циркулирующих в организмах. Эта частица обладает очень высокой реакционной способностью, вследствие чего и время ее жизни и ее стационарная концентрация очень малы.

RNO• + O₂ → RNO^– + O₂• (или O₂^–) или

RNO• + O₃ → RNO₂ + O₂• (или O₂^–). (6)

Однако имеются данные, указывающие, что из-за высокой мгновенной плотности излучения становится возможным взаимодействие между собой продуктов, образовавшихся под действием УФ-излучения [62]. Продукт(ы) диффундирует(ют) через мембрану клеток, проникая внутрь. В частности, при обработке λ = 220 нм происходит значительное снижение от pH 7,4 (биологически важных) до pH 2,5–3,0. Механизм снижения pH связан с образованием и последующим распадом пероксинитрита. При pH 7,4 существуют как ионная (ONOO^–), так и протонированная (пероксиазотистая кислота ONOOH; pK_a = 6,8) формы. Протонированная форма имеет период полураспада ~1,3 с, в то время как ионная форма может сохраняться до 15 сут даже при комнатной температуре [62].

Иммунная система пользуется поражающим действием окислителей, превращая выработку окисляющих веществ в ключевой элемент механизма уничтожения патогенов. Так, активированные фагоциты продуцируют АФК и активные формы азота. К ним относятся супероксид (•O^–2), оксид азота (•NO) и особенно реакционноспособное производное — пероксинитрит (ONOO^–) [63]. В нормальных условиях внутриклеточное содержание АФК поддерживается на низком уровне различными ферментными системами, участвующими в редокс-гомеостазе. Однако под влиянием различных условий, в частности в присутствии токсичных веществ (например, пестицидов), в клетках накапливается слишком много свободных радикалов — молекул без одного электрона (супероксидный радикал, гидроксильный радикал HО^– и H₂O₂), приводящих к возникновению состояния окислительного (оксидативного) стресса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования показали, что продукты фотохимического разложения N-ФМГ токсичны для клеток бактерий coli. С помощью системы биосенсоров pSoxS-lux и pKatG-lux N-ФМГобл вызывает оксидативный стресс с увеличением концентраций супероксидного аниона и пероксида водорода, что может привести к повреждению генетического материала. Методом МС установлено, что среди продуктов фотохимического окисления N-ФМГ идентифицируется соединение состава C₃H₇O₄N с m/z 121,02968 [41]. В настоящей работе приведена последовательность химических реакций, доказывающих, что в результате переноса протона (Н⁺) и делокализации неспаренного электрона соединение 2-(N-гидроксиметил-гидроксиамин) этановая кислота способно продуцировать супероксид радикал (^•O^–2), что может привести к повышению интенсивности экспрессии гена фермента оксидативного стресса супероксиддисмутазы в жизнеспособных клетках биосенсоров pSoxS-lux и pKatG-lux.

Предложен механизм трансформации молекулы N-ФМГ в новые химические соединения, способные в клетках бактерий генерировать АФК и устойчивые свободные радикалы. В свою очередь, свободные радикалы и накопление АФК в клетке приводит к повреждениям ДНК. Таким образом, рассмотрен весьма вероятный механизм возникновения генотоксического эффекта продуктов фотохимического распада N-ФМГ. Попадая в организм человека, N-ФМГ накапливается в мембранах клеток за счет взаимодействия с липидами; или же связываясь в устойчивые комплексные соединения с другими биологическими молекулами, как например АТФ. В определенных условиях — нервные перегрузки, повышенная солнечная радиация (hv или hv + О₃) или другие факторы — из аккумулированных молекул N-ФМГ генерируется значительное количество супероксид радикалов (•O^–2). Мембрана(ы) разрываются и радикалы попадают в лимфу и кровоток. Их количество многократно превосходит потребности организма и то количество, которое организм способен использовать или детоксицировать в нормальных физиологических условиях. Избыточное количество радикалов приводит к повышенной активации свободнорадикальных процессов, что влечет за собой целый каскад негативных реакций и патологических процессов, лежащих в основе ряда заболеваний.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли равный вклад в подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: Е.А. Саратовских — идея исследования, анализ результатов и источников, написание первоначального текста; Е.А. Мачигов — биолюминесцентный анализ и обработка первичного экспериментального материала; А.И. Ярмоленко — создание схемы реакций фотохимического разложения; Е.В. Штамм — сбор литературных данных и написание литературного обзора; С.К. Абилев — доработка текста, интерпретация полученных результатов биолюминесцентного исследования.

Источник финансирования. Работа выполнена в соответствии с темой № FFSG-2024-0012 Государственного задания (рег. № 124020500019-2) и с темой № 0092-2022-0003 Государственного задания (рег. № 122022600163-7).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

 

[*] Поскольку в коммерческие препараты вводят различные добавки, далее по тексту мы приводим те названия, которые использовали авторы в конкретной цитируемой статье.

Об авторах

Елена Анатольевна Саратовских

Федеральный исследовательский центр проблем химической физики и медицинской химии Российской академии наук

Автор, ответственный за переписку.
Email: easar@icp.ac.ru
ORCID iD: 0000-0003-1841-0641
SPIN-код: 4183-7660

д-р биол. наук

Россия, Черноголовка

Эльбек Альбертович Мачигов

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук

Email: elbek_machigov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2811-6374
SPIN-код: 7382-5408
Россия, Москва

Андрей Иванович Ярмоленко

Федеральный исследовательский центр проблем химической физики и медицинской химии Российской академии наук

Email: andr.yar@bk.ru
ORCID iD: 0009-0008-2736-4118
Россия, Черноголовка

Елена Валентиновна Штамм

Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук

Email: ekochem@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2537-2751

д-р хим. наук

Россия, Москва

Серикбай Каримович Абилев

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова

Email: abilev@vigg.ru
ORCID iD: 0000-0001-8636-6828
SPIN-код: 4692-4311
Scopus Author ID: 8723003000

д-р биол. наук

Россия, Москва; Москва

Список литературы

Дополнительные файлы