The ability of photochemical decomposition products of the Roundup to induce oxidative stress in bacterial cells

Full Text

АКТУАЛЬНОСТЬ

Вещество с тривиальным названием «глифосат (Гл)» входит в состав более чем 20 коммерческих препаратов, в частности в Раундап (Рп) [*]. Он является самым распространенным по объему производства и применения в практике сельского хозяйства в мире [1]. Это неселективный системный гербицид, который используется для борьбы с сорняками, особенно многолетними. Действующее вещество имеет систематическое название N-фосфонометилглицин (N-ФМГ, N-phosphonomethylglycine) — фосфорорганическое вещество, относящееся к фосфонатам.

Согласно результатам многочисленных исследований, используемые гербициды и продукты их разложения загрязняют обрабатываемые территории [2, 3]. Причем Гл и его основные продукты распада, в частности аминометилфосфорная кислота (АМФК), ответственны за почти повсеместное загрязнение поверхностных и подземных вод [4]. По отношению к культурным растениям, например Allium cepa L. и Zea mays L., Рп показал высокую токсичность [5, 6]. Сорные виды растений, являющиеся объектом применения Рп или Гл, имеют способность быстро привыкать к нему, в связи с чем применяемые дозы периодически повышаются [7–10]. Ряд гербицидов, в том числе Рп, образует хелатные комплексы с металлами [11, 12] и взаимодействуют с оксидом алюминия [13]. Такого типа комплексы имеют значительно более высокие константы связывания с аденином, нуклеотидами и рядом других биологических молекул. В результате этого их химическая и биологическая устойчивость, а также токсикологические эффекты значительно возрастают [14, 15]. Остаточные количества Рп (Гл) и продукты его разложения содержатся в основных продуктах пищи, таких как сахар, кукуруза, соя и пшеница [16].

Как и другие гербициды, Рп негативно влияет на почвенные и водные организмы, проявляя высокую токсичность и резко снижая их численность [3, 14, 15]. Попадая с пищей в организм человека, Рп поражает органы пищеварительной и выделительной систем, становится причиной многих заболеваний [2, 3, 17–19]. В том числе Гл оказывает существенное влияние на окисление жиров и полипептидов. Характер воздействия меняется: при высоких концентрациях (10^–3–10^–6 моль/л) снижается интенсивность процессов перекисного окисления, а в низких — увеличивается интенсивность этих реакций для липидов и белков [20–22].

Одним из механизмов действия Рп является ингибирование холинэстеразных ферментов [23]. Зафиксировано подавление Рп активности мальтазы и пептидазы у гидробионтов, ингибирование активности фермента окислительно-восстановительной системы НАДН-оксидоредуктазы in vitro гербицидами Лонтрел, Рп, Зенкор, Базагран, Кузагард, Сетоксидим и комплексами Лонтрела с металлами [24, 25].

Ферменты цитохрома P450 (CYP) играют решающую роль в метаболизме животных и растений. В частности, участвуют в детоксикации ксенобиотиков. Ингибирование Гл ферментов CYP — недооцененный компонент его токсичности для млекопитающих. Таким путем Гл усиливает повреждающее действие химических веществ и токсинов, попадающих в организм из окружающей среды. Негативное воздействие на организм коварно и проявляется медленно с течением времени, поскольку воспаление повреждает клеточные системы во всем организме. Кроме ингибирования ферментов CYP Гл нарушает биосинтез ароматических аминокислот кишечными бактериями и транспорт сульфата в сыворотке. Все эти процессы синергически усиливают друг друга и совокупное действие на организм в целом [16].

Гербициды вызывают серьезные нарушения в антиоксидантной системе и индуцируют окислительный стресс, перекисное окисление липидов и снижают уровни восстановленного глутатиона и антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы, каталазы и глутатионредуктазы в ткани печени, что является предполагаемым токсико-динамическим путем окислительного стресса [26]. Имеется ряд указаний на генотоксический потенциал гербицида Рп [26–31] как его наиболее опасное действие. Окислительная фрагментация ДНК является важным механизмом генетического повреждения [28–30]. Рп изменяет экспрессию генов в печени, в частности TP53. Образование апуриновых/апиримидиновых повреждений ведет к разрывам в цепи ДНК и неправильному свертыванию белков [27]. Установлены общие молекулярные механизмы, связанные с генерацией активных форм кислорода (АФК) при воздействии Гл или через его метаболит— AMФК [31, 32].

Как результат этих биохимических нарушений, происходящих в результате действия Рп (Гл), возникают эмбриотоксические, гемотоксические, цитотоксические и генотоксические изменения в организме человека и животных [17, 18, 33], снижается фертильность, наблюдаются канцерогенные и тератогенные нарушения [19, 34, 35]. По классификации Международного агентства по изучению рака (МАИР) Всемирной организации здравоохранения с 2015 г. Рп находится в группе канцерогенов 2А [36, 37].

Фитотоксический эффект гербицидов зависит от того, насколько долго они сохраняются на листьях. Это зависит от рецептуры гербицидов, которая, наряду с действующим веществом, содержит вспомогательные вещества, усиливающие смачиваемость листьев и проникновение молекул гербицида в клетки растений. Поэтому после обработки на листьях растений длительное время сохраняются капли гербицида, который, находясь под воздействием лучей солнца, подвергается разложению. В этой связи имеется ряд публикаций по изучению продуктов фоторазложения Гл [38–41]. Например, ранее нами показано, что при облучении раствора N-ФМГ светом с длин волн λ = 250–600 нм в течение 14 ч образуется генотоксичный продукт, способный индуцировать SOS-ответ у биосенсора K12 — MG1655 (pColD-lux). При этом необлученный раствор N-ФМГ не обладал такой активностью [41].

Несмотря на все имеющиеся данные, острейшими для ученых-экологов остаются вопросы: во-первых, каковы продукты разложения N-ФМГ; во-вторых, каковы наиболее эффективные способы очистки питьевой воды от N-ФМГ и продуктов его разложения.

Были исследованы различные процессы обработки природной и питьевой воды для снижения в ней концентрации гербицидов и сведения к минимуму потенциальных рисков для здоровья, связанных с воздействием этих химических веществ при потреблении загрязненной воды [42, 43]. Со временем исследователи пришли к выводу, что усовершенствованные процессы окисления являются ключевой технологией для решения проблем загрязнения гербицидами как при очистке питьевой воды, так и при очистке сточных вод [44]. В работах [45–47] в условиях воздействия УФ-излучения исследовалось параллельное влияние ряда других факторов, таких как катализатор, рН, введение H₂O₂. В нашей предыдущей статье кроме УФ-излучения применялось воздействие озоном [41].

Следует подчеркнуть, что проведено очень мало исследований основных продуктов разложения Гл (Рп), но представленные результаты неоднозначны. В исследовании [45] утверждается, что AMФК — основной метаболит, обладающий высокой устойчивостью и низкой токсичностью. Микроядерным анализом in vitro на линии клеток яичника китайского хомячка (Chinese Hamster) CHO-K1 в работе [46] для Гл и АМФК показана цитогенетическая токсичность, которая увеличивалась в 100 раз после светового облучения. Оценка внутриклеточных АФК позволила предположить участие окислительного стресса в генотоксическом воздействии Гл.

Столь же противоречивые мнения высказываются о возможном пути фоторазложения N-ФМГ. В обзоре [47] анализируется значительное количество данных и приводятся два пути образования продуктов реакции. Однако устойчивыми соединениями называются глицин, саркозин, формальдегид, а не AMФК, и процесс их образования не сопряжен с ней. В нашей предыдущей статье методом хромато-масс-спектрометрии (МС) были установлены продукты фоторазложения, среди которых не было идентифицировано АМФК [41]. С нашей точки зрения, это легко объяснить, поскольку существуют определенные трудности стабилизации фосфатной группы в составе молекул [48]. А продукты, образующиеся при гидролитическом отщеплении фосфатной группы, сильно стабилизируются за счет сопряжения [48].

В исследованиях причин возникновения и путей формирования генотоксичности веществ и гербицидов, в частности, эффективно использование lux-биосенсоров на основе штамма E. coli K12: MG1655 (pSoxS-lux) и MG1655 (pKatG-lux) [49–51], а также pColD-lux [52], несущих рекомбинантную плазмиду с lux-опероном люминесцирующей бактерии Photorhabdus luminescens, слитым с промоторами генов супероксиддисмутазы, каталазы и колицина соответственно. Промотор pKatG (белок-активатор OxyR) специфически реагирует на перекись водорода и другие пероксиды, тогда как промотор pSoxS (белок-активатор SoxR) специфически реагирует на супероксидный анионрадикал. Для SOS-биосенсора, реагирующего на повреждения ДНК, использован промотор pColD колицинового гена, входящего в SOS-регулон. Штаммы E. coli, несущие lux-оперон, под воздействием индукторов окислительного стресса или ДНК-повреждающих агентов начинают активно продуцировать люциферин-люциферазный комплекс, что приводит к повышению уровня биолюминесценции [53].

Цель настоящей работы — исследование с помощью lux-биосенсоров на основе Escherichia coli способности продуктов фотохимического разложения N-ФМГ индуцировать окислительный стресс в бактериальных клетках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали действующее вещество гербицида Раундап [Глифосат, N-фосфонометилглицин (N-ФМГ, C₃H₈NO₅P)], очищенное двойной перекристаллизацией из бидистиллированной воды (рис. 1) [54].

 

Рис. 1. Химическая формула N-фосфонометилглицина

Fig. 1. Chemical formula of N-phosphonomethylglycine

 

В работе использовали бактериальные lux-биосенсоры: E. coli K12 MG1655 (pSoxS-lux) и E. coli K12 MG1655(pKatG-lux) [55–57]. В тексте они обозначены как биосенсоры pSoxS-lux и pKatG-lux. Данные биосенсоры содержат рекомбинантную плазмиду, включающую промоторы генов супероксиддисмутазы soxS и каталазы katG, слитые с lux-опероном Photorhabdus luminescens. В клетке штамма pSoxS-lux ген супероксиддисмутазы транскрибируется при повышении концентрации супероксид-аниона, и, соответственно, транскрипции подвергается и lux-оперон, что приводит к люминесценции клетки с интенсивностью, пропорциональной концентрации супероксид-аниона. Аналогичным механизмом работы обладает и штамм pKatG-lux, где ген каталазы, слитый с lux-опероном, транскрибируется при повышении концентрации в клетке пероксида водорода, что приводит к люминесценции с интенсивностью, пропорциональной его концентрации в клетке. Перечисленные биосенсоры предоставлены Г.Б. Завильгельским и И.В. Мануховым (ГосНИИгенетика, Москва).

Хранение и культивирование бактериальных культур осуществляли с помощью твердых, с добавлением агара, и жидких питательных сред LB (Луриа – Бертани). Среды содержали ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Для опытов использовали культуры биосенсоров KatG-lux и pSoxS-lux в жидкой питательной среде LB.

Ночные культуры биосенсоров разбавляли в свежей жидкой среде LB, доводя содержание бактерий до концентрации 10⁷ кл/мл, и инкубировали при 37 °C в течение 120 мин с аэрацией до достижения ранней экспоненциальной фазы. Далее культуры переносили в 96-луночный планшет по 180 мкл в каждую лунку. Ряд контрольного образца заполняли дистиллированной водой по 20 мкл в лунку. Следующие ряды лунок заполняли различными разведениями облученного N-ФМГ (N-ФМГобл). В последний ряд — по 20 мкл N-ФМГ в концентрации 0,01 М в качестве положительного контроля в lux-тесте. Далее культуры в заполненных планшетах культивировали течение 1 ч при 37 °C и определяли интенсивность люминесценции биосенсоров с помощью люминометра — микропланшетного ридера StatFax 4400 (Awareness Technology Inc., США), где за единицу измерения для люминесцентного ответа принимали условные единицы светового потока (RLU). Вышеперечисленные опыты проводили не менее трех раз с восемью повторениями в каждом.

Для пересчета люминесценции на 1000 жизнеспособных клеток были проведены эксперименты по одновременному определению люминесценции и выживаемости биосенсоров pSoxS-lux и pKatG-lux непосредственно в инкубационной смеси в лунках планшета в зависимости от разведения N-ФМГобл. Для этого по истечении времени инкубации экспериментальной смеси замеряли интенсивность биолюминесценции. Затем содержимое каждой лунки серийно разводили в 0,9 % растворе натрия хлорида до 10^–6, 10^–5 и 10^–2 для последующего высева в чашки Петри с агаризованной питательной средой LB. Через 19 ч инкубации при 37 °C учитывали число выросших колоний и пересчитывали на число колониеобразующих единиц в 0,2 мл суспензии бактерий. Значение люминесценции делилось на число КОЕ для соответствующей концентрации N-ФМГобл и умножалось на 1000. Полученный коэффициент показывал относительную люминесценцию 1000 КОЕ.

Все эксперименты выполнены в трех повторностях. Полученные в ходе опытов данные обработали стандартными статистическими методами. Вычисляли средние значения показателей. Значимость различий средних значений определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Для вывода о статистической значимости различий полученных данных считали достаточной вероятность ошибки p < 0,01.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Кинетика и продукты разложения N-ФМГ под действием УФ-излучения и озона

Гербициды считаются безвредными для растений на том основании, что они разлагаются под действием УФ-компоненты солнечного излучения, почвенных микроорганизмов и в результате метаболизма внутри самого растения. Скорость разложения N-ФМГ под действием исключительно солнечного света, измеренная в наших экспериментальных условиях, составила 2,8 × 10^–4 М/ч [41].

Ранее нами была выполнена работа, в которой постарались смоделировать естественные природные условия, в которых оказывается гербицид после нанесения на растения: УФ-излучение солнца, влага (роса, дождь, поверхностные или подземные воды), озон (образующийся при грозовом разряде) [41]. Зарегистрировано разложение N-ФМГ под действием излучения ртутной лампы ДРШ-1000. Была обнаружена неаддитивность совместного действия УФ-излучения и озона на разложение N-ФМГ: скорость процесса во много раз превосходила скорости, регистрируемые при одном лишь облучении раствора или при одном барботаже озона через раствор реагента. Установлено, что реакция разложения N-ФМГ при совместном действии УФ-излучения и озона протекает со значительно более высокой скоростью (0,406 М/ч), чем при раздельном использовании УФ-излучения или озона [41].

Процесс разложения имеет сложный многоступенчатый характер. Как видно из рис. 2, на регистрируемых в процессе разложения N-ФМГ электронных спектрах прослеживается ряд промежуточных соединений, возникающих в разные периоды облучения. Так, через 1,0 ч от начала облучения в растворе появляется пик с λ₂ = 195 нм, который в дальнейшем присутствует во всех пробах. После 3,8 ч облучения идентифицируется пик λ₄ = 258 нм, который присутствует в пробах до 8,1 ч наблюдения. Однократно идентифицирован пик λ₅ = 238 нм через 5,3 ч. Пик λ₃ = 286 нм появляется через 2,8 ч, после этого через 1,0 ч исчезает и появляется вновь в пробе от 11,3 ч и так же более не идентифицируется. Это указывает на сложный многоступенчатый процесс разложения N-ФМГ.

 

Рис. 2. Изменение спектра поглощения реакционной смеси в процессе фотохимического разложения водного раствора N-фосфонометилглицина при совместном воздействии УФ-излучения и озона от времени: 1 — интенсивность поглощения при λ = 212 нм; 2 — 195 нм; 3 — 286 нм; 4 — 258 нм; 5 — 238 нм. По данным работы [41]

Fig. 2. Change in the absorption spectrum of the reaction mixture during the photochemical decomposition of an aqueous solution of N-phosphonomethylglycine under the combined influence of UV radiation and ozone over time: 1 — absorption intensity at λ = 212 nm; 2 — 195 nm; 3 — 286 nm; 4 — 258 nm; 5 — 238 nm. According to work [41]

 

Синергизм действия УФ-излучения и озона можно объяснить, приняв во внимание способность озона фотолизоваться при поглощении кванта УФ-излучения:

О₃ + hv → O* + O_{2 (1)}

Возникающий при этом атомарный кислород может непосредственно взаимодействовать с N-ФМГ, индуцируя процесс его окисления, включающий многоступенчатую последовательность превращений, в которой возникают продукты, некоторые из которых идентифицированы нами.

Для определения состава продуктов фотохимического разложения был выполнен анализ растворов N-ФМГобл с помощью МС [41]. Исходный N-ФМГ характеризовался пиком депротонированной молекулы с m/z 168, что соответствует составу [C₃H₇NO₅P]^–1. В образце, находившемся в темноте на воздухе при температуре 25 °C в течение 14,3 ч, появляются некие примеси, однако их существенно меньше, чем основного вещества — N-ФМГ. В пробе, содержащей облученный и озонированный раствор, даже следы N-ФМГ не были найдены, то есть N-ФМГ был полностью разрушен.

Использование МС высокого разрешения [58] позволило установить точные массы продуктов деструкции для образца (УФ + озон; 14,3 ч) и, как следствие, их элементные составы [41]. В табл. 1 приведены состав и наиболее вероятная структура фрагментов, образующихся в процессе фотохимического разложения под действием УФ-излучения и озона. Видно, что были зарегистрированы пики, соответствующие депротонированным молекулам продуктов разложения исходного N-ФМГ.

 

Таблица 1. Состав и структура фрагментов, образующихся в процессе фотохимического разложения N-фосфонометилглицина, согласно данным масс-спектрометрии [41] Table 1. Composition and structure of fragments formed during the photochemical decomposition of N-phosphonomethylglycine, according to mass spectrometry data [41]
Номер продукта	m/z	Состав	Структура
1	86,02510	C3H4O2N
2	100,00427	C3H2O3N
3	102,01995	C3H4O3N
4	104,03557	C3H6O3N
5	121,02968	C3H7O4N		или

 

Активность систем окислительного стресса под действием продуктов фоторазложения N-ФМГ

Продукты фоторазложения N-ФМГ (N-ФМГобл) индуцировали интенсивную люминесценцию биосенсоров pKatG-lux и pSoxS-lux при инкубации в течение 90 мин (рис. 3). Это указывают на то, что N-ФМГобл прямо или опосредованно генерирует в бактериях E. coli такие оксидативные соединения, как супероксид-анион и пероксид водорода. Данные вещества являются сильными источниками оксидативного стресса для живых организмов. Окислительное повреждение клетки может носить не только цитотоксический характер, но и вызывать повреждения в ДНК бактерий.

 

Рис. 3. Люминесценция pKatG-lux и pSoxS-lux с N-ФМГобл в условных единицах светового потока

Fig. 3. Luminescence of pKatG-lux and pSoxS-lux with N-PMGirr in arbitrary units of luminous flux

 

Проведены эксперименты с целью определения выживаемости бактерий, то есть способности образовывать колонии (КОЕ), при воздействии N-ФМГобл в различных концентрациях. Для этого по истечении времени инкубации экспериментальной смеси аликвоту бактерий объемом 0,1 мл серийно разводили в 0,9 % растворе натрия хлорида до 10^–6. Затем по 0,1 мл из разных разведений высевали на агаризованную питательную среду LB в чашках Петри.

Через 19 ч инкубации при 37 °C учитывали число выросших колоний, являющееся показателем КОЕ (табл. 2).

 

Таблица 2. Зависимость выживаемости бактерий биосенсоров (число КОЕ в 0,1 мл культуры) от концентрации N-ФМГобл Table 2. Dependence of the survival of biosensor bacteria (number of CFUs in 0,1 mL suspensions) at concentration of N-PMGirr
Lux-биосенсор	Вода (контроль)	Разведение N-ФМГобл
		1 : 10	1 : 2	не разведен
pKatG-lux	5,11 ± 0,39 × 107	4,67 ± 0,55 × 107	4,73 ± 0,58 × 106	3,14 ± 0,56 × 105*
pSoxS-lux	5,46 ± 0,16 × 107	5,75 ± 0,08 × 107	4,54 ± 0,35 × 106*	2,83 ± 0,55 × 105**
Статистически значимые различия между контролем и вариантами с N-ФМГобл: *р ≤ 0,05; **р ≤ 0,001. Statistically significant differences between the control and variants with N-PMGirr: *р ≤ 0.05; **р ≤ 0.001.

 

Из данных, представленных в табл. 2, следует, что с увеличением концентрации N-ФМГобл значительно снижется число КОЕ в культуре клеток. Так, в случае биосенсора pKatG-lux в контроле число жизнеспособных бактерий составило 5,11 × 10⁷, при воздействии разбавленного 1 : 10 раствора N-ФМГобл выживаемость бактерий не отличалась от контрольного значения. Более высокие концентрации N-ФМГобл, разбавленного 1 : 2 и неразбавленного, снижали выживаемость бактерий в 10 и более чем в 100 раз соответственно. Подобные же результаты были получены и в случае биосенсора pSoxS-lux.

С целью определения изменения интенсивности люминесцентного ответа в зависимости от концентрации N-ФМГобл для фиксированного количества бактерий был проведен опыт по одновременному определению люминесценции и выживаемости бактерий биосенсоров pSoxS-lux и pKatG-lux непосредственно в культивируемой суспензии в ячейках планшета. Для этого через 90 мин инкубации суспензии считывали данные по люминесценции. Затем содержимое каждой лунки (0,2 мл) серийно разводили 0,9 % раствором натрия хлорида до 10^–6, 10^–5 и 10^–2 для последующего высева в чашки Петри с агаризованной питательной средой LB. Через 19 ч инкубации при 37 °C учитывали число выросших колоний и пересчитывали на число колониеобразующих единиц в 0,2 мл суспензии бактерий. Полученные результаты приведены в табл. 3.

 

Таблица 3. Зависимость интенсивности люминесцентного ответа и выживаемости клеток биосенсоров pKatG-lux и pSoxS-lux от концентрации N-ФМГобл Table 3. Dependence of the intensity of the luminescent response and cell survival of the biosensors pKatG-lux and pSoxS-lux on the N-PMGirr concentration
Lux-биосенсор	N-ФМГобл	Число КОЕ в 0,2 мл культуры	Люминесценция 0,2 мл культуры	Люминесценция на 1000 КОЕ
pKatG-lux	Вода (контроль)	5,22 ± 0,44 × 108	2938 ± 109	0,005
	1 : 10	4,71 ± 0,51 × 108	3328 ± 86	0,007
	не разведенный	3,34 ± 0,40 × 106	4092 ± 131	1,2*
pSoxS-lux	Вода (контроль)	4,19 ± 0,28 × 108	5932 ± 109	0,014
	1 : 10	3,62 ± 0,39 × 108	7157 ±115	0,02
	не разведенный	2,50 ± 0,38 × 106	9137 ± 125	3,65*
*Наиболее значимые результаты. *The most significant results.

 

Для вычисления интенсивности люминесцентного ответа биосенсоров pSoxS-lux и pKatG-lux на 1000 жизнеспособных клеток был проведен следующий расчет. Показатель интенсивности люминесцентного ответа биосенсора при определенной концентрации N-ФМГобл делили на число КОЕ в лунке при этой концентрации и умножали на 1000. Полученный коэффициент показывал относительную люминесценцию 1000 КОЕ. В контрольном образце, не обработанном N-ФМГобл, люминесценция 1000 бактерий pKatG-lux и pSoxS-lux составляла 0,005 и 0,014 отн. ед. соответственно. Люминесценция 1000 КОЕ бактерий pKatG-lux и pSoxS-lux при добавлении неразведенного N-ФМГобл превышала контрольную в 240 и 261 раз, составляя 1,2 и 3,65 отн. ед. В варианте эксперимента с использованием N-ФМГобл в десятикратном разведении люминесценция 1000 клеток pKatG-lux и pSoxS-lux составляла 0,007 и 0,02 отн. ед. соответственно.

Из этих данных становится очевидно, что интенсивность экспрессии гена фермента оксидативного стресса супероксиддисмутазы в жизнеспособных клетках биосенсора с повышением концентрации N-ФМГобл не уменьшается, а растет. Таким образом, с ростом концентрации N-ФМГобл часть клеток гибнет, а у оставшейся наблюдается усиление активности систем окислительного стресса (табл. 3).

Химические реакции, приводящие к образованию супероксидного анион-радикала из N-ФМГ под действием УФ-излучения и озона

В табл. 1 приведены продукты фотохимического разложения N-ФМГ. Можно предположить нижеследующую схему их образования. В жестких окислительных условиях, в которых оказался N-ФМГ — водная среда при воздействии УФ и озона (продуцирующего как О₂^–, так и О^•) — в возбужденное состояние переходит вся молекула N-ФМГ. Электроны переходят с π-связывающих на π-разрыхляющие уровни молекулы, что ведет к ее распаду. На первой стадии происходит потеря протона (–H⁺) с образованием стабильного промежуточного аниона, который мы можем регистрировать с помощью МС (m/z 168,0 [C₃H₇NO₅P]^–1) и УФ-спектроскопии (λ = 195 нм). Стабильность этого аниона можно объяснить делокализацией электронов по всей молекуле с задействованием сопряженных двойных связей С=О, Р=О и неподеленных электронных пар азота и кислорода (2).

 

 

От какой из кислотных группировок — карбонильной или фосфорной — происходит отщепление протона можно только предполагать, но очевидна вероятность обоих путей. Скорее всего, обе частицы находятся в равновесном состоянии.

На следующей, наиболее вероятной, стадии связь фосфор – углерод достаточно легко гидролизуется, при этом атом фосфора окисляется в условиях среды от валентности формально (+4) в N-ФМГ (из-за делокализации электронов), до наиболее стабильной валентности (+5). В результате отщепляется фосфорная кислота Н₃РО₄. Анионы РО₃^– с m/z 78,95941 и H₂PO₄^– с m/z 96,96990 идентифицировали в МС.

 

 

В образовавшемся интермедиате — анионе (*), атом азота своей неподеленной электронной парой участвует в сопряжении с карбоксильной группой. В результате облако π-электронов распределяется по всей молекуле. Этот анион достаточно стабилизирован и из него в условиях среды возможны последующие реакции по нескольким направлениям: а) из окислительного депротонирования атома азота образуется соединение № 1, идентифицируемое в МС с m/z 86,02510.

 

 

Из полученного соединения, при окислении метильной группы (б), связанной с атомом азота, образуется соединение № 2 с m/z 100,00427, альдегидная группировка которого сопряжена с неподеленной электронной парой атома азота, что стабилизирует эту частицу.

 

 

В условиях применяемой агрессивной окислительной среды идут дальнейшие окислительные реакции с образовавшимися интермедиатами по их легко окисляемым позициям — атому азота и метильной группировке, связанной с атомом азота.

В результате последовательно (в, г) образуются соединения № 4 с m/z 104,03557, а затем (г) № 5 с m/z 121,02968.

 

 

В указанных условиях, азот легко окисляется до гидроксиаминовой (N–OH) группировки, с образованием 2-(N-гидроксиметил-гидроксиамин) этановой кислоты, соединения № 5:

 

 

Возможны и другие параллельные пути реакции окисления интермедиатов. В том числе и окисление углерода, находящегося в α-положении по отношению к карбонильной группе с образованием гидроксильной группы в этом положении — соединение № 3, имеющее m/z 102,01995, как показано на схеме (рис. 4).

 

Рис. 4. Схема потенциальных реакций окисления N-ФМГ по α-углеродному атому

Fig. 4. Scheme of potential reactions of N-PMG oxidation at α-carbon atom

 

Как видно из табл. 1, продукты фотохимического разложения № 1–4 имеют одну, две или даже три двойные связи. Значительные избыточные электронные плотности обусловливает их восстановительную природу.

Особый интерес вызывает продукт № 5, имеющий m/z 121,02968 и состав C₃H₇O₄N.

 

 

Соединение № 5 — алифатический гидроксиамин: 2-(N-гидроксиметил-гидроксиамин) этановая кислота, является окислителем и способно к реакции диспропорционирования, приводящей к образованию короткоживущего и высоко активного нитроксильного радикала.

 

 

В результате переноса протона (Н⁺) неспаренный электрон локализуется на разрыхляющей π*-орбитали, образованной из 2p_z-орбиталей атомов азота и кислорода. Гибридизация связей атома азота близка к sp². В литературе встречаются указания на то, что при отсутствии возможности делокализации неспаренного электрона, образуется крайне нестабильный молекулярный ион [59]. Алкильные радикалы быстро реагируют с кислородом [60, 61] c образованием супероксидного анион-радикала (^•O^–2) — одной из самых активных форм кислорода, циркулирующих в организмах. Эта частица обладает очень высокой реакционной способностью, вследствие чего и время ее жизни и ее стационарная концентрация очень малы.

RNO• + O₂ → RNO^– + O₂• (или O₂^–) или

RNO• + O₃ → RNO₂ + O₂• (или O₂^–). (6)

Однако имеются данные, указывающие, что из-за высокой мгновенной плотности излучения становится возможным взаимодействие между собой продуктов, образовавшихся под действием УФ-излучения [62]. Продукт(ы) диффундирует(ют) через мембрану клеток, проникая внутрь. В частности, при обработке λ = 220 нм происходит значительное снижение от pH 7,4 (биологически важных) до pH 2,5–3,0. Механизм снижения pH связан с образованием и последующим распадом пероксинитрита. При pH 7,4 существуют как ионная (ONOO^–), так и протонированная (пероксиазотистая кислота ONOOH; pK_a = 6,8) формы. Протонированная форма имеет период полураспада ~1,3 с, в то время как ионная форма может сохраняться до 15 сут даже при комнатной температуре [62].

Иммунная система пользуется поражающим действием окислителей, превращая выработку окисляющих веществ в ключевой элемент механизма уничтожения патогенов. Так, активированные фагоциты продуцируют АФК и активные формы азота. К ним относятся супероксид (•O^–2), оксид азота (•NO) и особенно реакционноспособное производное — пероксинитрит (ONOO^–) [63]. В нормальных условиях внутриклеточное содержание АФК поддерживается на низком уровне различными ферментными системами, участвующими в редокс-гомеостазе. Однако под влиянием различных условий, в частности в присутствии токсичных веществ (например, пестицидов), в клетках накапливается слишком много свободных радикалов — молекул без одного электрона (супероксидный радикал, гидроксильный радикал HО^– и H₂O₂), приводящих к возникновению состояния окислительного (оксидативного) стресса.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования показали, что продукты фотохимического разложения N-ФМГ токсичны для клеток бактерий coli. С помощью системы биосенсоров pSoxS-lux и pKatG-lux N-ФМГобл вызывает оксидативный стресс с увеличением концентраций супероксидного аниона и пероксида водорода, что может привести к повреждению генетического материала. Методом МС установлено, что среди продуктов фотохимического окисления N-ФМГ идентифицируется соединение состава C₃H₇O₄N с m/z 121,02968 [41]. В настоящей работе приведена последовательность химических реакций, доказывающих, что в результате переноса протона (Н⁺) и делокализации неспаренного электрона соединение 2-(N-гидроксиметил-гидроксиамин) этановая кислота способно продуцировать супероксид радикал (^•O^–2), что может привести к повышению интенсивности экспрессии гена фермента оксидативного стресса супероксиддисмутазы в жизнеспособных клетках биосенсоров pSoxS-lux и pKatG-lux.

Предложен механизм трансформации молекулы N-ФМГ в новые химические соединения, способные в клетках бактерий генерировать АФК и устойчивые свободные радикалы. В свою очередь, свободные радикалы и накопление АФК в клетке приводит к повреждениям ДНК. Таким образом, рассмотрен весьма вероятный механизм возникновения генотоксического эффекта продуктов фотохимического распада N-ФМГ. Попадая в организм человека, N-ФМГ накапливается в мембранах клеток за счет взаимодействия с липидами; или же связываясь в устойчивые комплексные соединения с другими биологическими молекулами, как например АТФ. В определенных условиях — нервные перегрузки, повышенная солнечная радиация (hv или hv + О₃) или другие факторы — из аккумулированных молекул N-ФМГ генерируется значительное количество супероксид радикалов (•O^–2). Мембрана(ы) разрываются и радикалы попадают в лимфу и кровоток. Их количество многократно превосходит потребности организма и то количество, которое организм способен использовать или детоксицировать в нормальных физиологических условиях. Избыточное количество радикалов приводит к повышенной активации свободнорадикальных процессов, что влечет за собой целый каскад негативных реакций и патологических процессов, лежащих в основе ряда заболеваний.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Все авторы внесли равный вклад в подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: Е.А. Саратовских — идея исследования, анализ результатов и источников, написание первоначального текста; Е.А. Мачигов — биолюминесцентный анализ и обработка первичного экспериментального материала; А.И. Ярмоленко — создание схемы реакций фотохимического разложения; Е.В. Штамм — сбор литературных данных и написание литературного обзора; С.К. Абилев — доработка текста, интерпретация полученных результатов биолюминесцентного исследования.

Источник финансирования. Работа выполнена в соответствии с темой № FFSG-2024-0012 Государственного задания (рег. № 124020500019-2) и с темой № 0092-2022-0003 Государственного задания (рег. № 122022600163-7).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Authors’ contribution. All authors made an equal contribution to the preparation of the article, read and approved the final version before publication. Contribution of each author: E.A. Saratovskikh — the idea of research, analysis of results and sources, writing the original text; E.A. Machigov — bioluminescent analysis and processing of primary experimental material; A.I. Yarmolenko — creation of a reaction scheme for photochemical decomposition; E.V. Stamm — collection of literature data and writing the literature review; S.K. Abilev — revision of the text, interpretation of the results of bioluminescent research.

Funding source. This work was carried out in accord with state assignments No. FFSG-2024-0012 (State registration No. 124020500019-2) and with subject No. 0092-2022-0003 of the State Order (No. 122022600163-7).

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

 

[*] Поскольку в коммерческие препараты вводят различные добавки, далее по тексту мы приводим те названия, которые использовали авторы в конкретной цитируемой статье.

About the authors

Elena A. Saratovskikh

Federal Research Center of Problems of Chemical Physics and Medicinal Chemistry, Russian Academy of Sciences

Author for correspondence.
Email: easar@icp.ac.ru
ORCID iD: 0000-0003-1841-0641
SPIN-code: 4183-7660

Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, Chernogolovka, Moscow Region

Elbek A. Machigov

N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences

Email: elbek_machigov@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2811-6374
SPIN-code: 7382-5408
Russian Federation, Moscow

Andrey I. Yarmolenko

Federal Research Center of Problems of Chemical Physics and Medicinal Chemistry, Russian Academy of Sciences

Email: andr.yar@bk.ru
ORCID iD: 0009-0008-2736-4118
Russian Federation, Chernogolovka, Moscow Region

Elena V. Shtamm

N.N. Semenov Federal Research Center for Chemical Physics, Russian Academy of Sciences

Email: ekochem@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2537-2751

Dr. Sci. (Chemistry)

Russian Federation, Moscow

Serikbai K. Abilev

N.I. Vavilov Institute of General Genetics, Russian Academy of Sciences; Lomonosov Moscow State University

Email: abilev@vigg.ru
ORCID iD: 0000-0001-8636-6828
SPIN-code: 4692-4311
Scopus Author ID: 8723003000

Dr. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files