Метаболомика старения гетеротрофных суспензионных культур Nicotiana tabacum L. VBI-0

Обложка


Цитировать

Полный текст

Открытый доступ Открытый доступ
Доступ закрыт Доступ предоставлен
Доступ закрыт Доступ платный или только для подписчиков

Аннотация

Гетеротрофные клеточные культуры широко используют в качестве модельных объектов в биологии растений. В процессе развития культуры меняется состав среды: истощается субстрат, накапливаются продукты метаболизма, растет плотность клеток. В финальной фазе рост останавливается и через непродолжительное время культура погибает. Эти процессы сопровождаются физиологическими изменениями клеток, которые можно назвать старением культуры. Методом газовой хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией, было проведено профилирование метаболитов гетеротрофных клеток Nicotiana tabacum VBI-0, поддерживаемых в суспензионной культуре. Сравнивали клетки культур возрастом 7 сут, во время интенсивного роста биомассы, и 28 сут, когда культура находилась в стационарной фазе. Было установлено, что старение сопряжено с падением накопления аминокислот. В то же время возрастал уровень пентоз и сложных сахаров, включая сахарозу, тогда как уровень глюкозы, фруктозы и сахарофосфатов снижался. Для стареющих культур характерен больший уровень накопления малата, пирувата и некоторых других карбоксилатов. Таким образом, полученные метаболомные данные свидетельствуют, что старение сопряжено с изменением обмена аминокислот, снижением активности начального этапа гликолиза, накоплением сложных сахаров, пентоз и карбоксилатов.

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Клеточные культуры высших растений, в том числе трансформированные, широко используют в качестве модельных систем для изучения целого ряда процессов, реализующихся в растительных организмах, в том числе деления, эмбриогенеза, дифференциации, различных этапов первичного и вторичного метаболизма и др. [1, 2]. Изучение культур позволяет углубить понимание клеточных механизмов адаптации растительных организмов к биотическим [3] и абиотическим стрессорам [4]. Наряду с этим культуры растительных клеток широко востребованы в современной биотехнологии для получения биологически активных соединений, гетерологичных белков и т. д. [5]. Применение асептических строго контролируемых условий позволяет достичь высокой воспроизводимости результатов, синхронизации клеточного цикла и высокой скорости роста [2, 6]. Культуры клеток растений могут быть как фотосинтезирующими [7], так и гетеротрофными [1]. Гетеротрофные культуры поддерживаются в темноте, а единственным источником углерода и энергии у них становятся органические соединения, входящие в состав среды. Клетки растений способны потреблять экзогенные органические соединения, особенно, сахарозу [8], являющуюся основной транспортируемой формой углерода у высших растений [9].

Включение сахарозы в метаболизм начинается с расщепления, которое осуществляется двумя типами ферментов — инвертазами и сахарозосинтазами. Инвертазы гидролизуют сахарозу на глюкозу и фруктозу. Кислые инвертазы локализованы в вакуоли, нейтральные/щелочные — в цитоплазме и апопласте [10]. Сахарозосинтазы расщепляют молекулы сахарозы на фруктозу и УДФ-глюкозу, которая является предшественником в синтезе ряда метаболитов. Вероятно, несколько путей включения сахарозы в метаболизм могут работать параллельно, и тогда возникает вопрос об их соотношении в норме и при стрессе. Продукты гидролиза сахарозы могут быть катаболизированы через гликолиз, цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) и пентозофосфатный путь для получения энергии. С другой стороны, экзогенный углерод может быть вовлечен в накопление биомассы, направлен в синтез амино- и жирных кислот или других соединений. Помимо этого, поступающий углерод может быть депонирован в форме крахмала или липидов. Интенсивность перечисленных процессов метаболизма зависит от видовых особенностей исследуемой культуры клеток, физиологической и биохимической активности составляющих ее клеток и меняется в процессе развития.

Очевидно, что в процессе роста культур происходит исчерпание субстрата и развивается голодание. Первым последствием голодания является падение физиологической активности. Удаление сахарозы ведет к быстрому снижению уровня дыхания [11, 12]. Падает экспрессия генов, кодирующих ферменты ЦТК и окислительного фосфорилирования [13]. Падает и уровень гликолиза, что выражается в снижении уровня фосфатов сахаров [14, 15] и экспрессии генов соответствующих ферментов [13, 11]. Кроме того, при голодании клеток наблюдается мобилизация резервов. Быстрым, но кратковременным источником углерода служат вакуолярные пулы сахарозы и малата [14]. Отмечено усиление экспрессии некоторых генов, связанных с гидролизом крахмала [13]. Происходит мобилизация липидов, которая обеспечивается индукцией генов липаз и ферментов окисления жирных кислот [13, 11]. Вместе с этим может иметь место деградация мембран [16]. Дополняется картина снижением экспрессии генов ферментов, участвующих в синтезе жирных кислот [11]. Показано, что голодание клеток характеризуется высокой протеолитической активностью, так как аминокислоты также могут быть источником углерода при голодании. На это указывает рост уровня экспрессии генов ферментов, связанных с катаболизмом аминокислот [17], особенно с катаболизмом разветвленных аминокислот [18]. Этот процесс влечет за собой перестройку азотного обмена [19]. Однако голодание гетеротрофных культур может длиться только очень ограниченный период времени. В случае суспензионных культур арабидопсиса уже после 24 ч голодания жизнеспособность клеток начинает быстро падать. После 48 ч культура теряет возможность восстанавливаться после пересева, что указывает на невозможность восстановления нового цикла развития, начинающегося с пролиферации [11].

Исчерпание нутриентов и другие изменения среды порождают комплекс физиологических процессов, заканчивающихся гибелью культуры, этот этап можно назвать старением. Происходит остановка роста, снижается уровень дыхания и синтетических процессов [20, 21]; меняется состав жирных кислот [22]; изменяется морфология и число органелл [23–25]. Особый интерес вызывает сравнительный анализ процессов, протекающих в культурах клеток растений при голодании и на поздних стадиях развития, с таковыми при онтогенетическом или индуцированном старении клеток в составе нативных органов растений [26, 19]. Было установлено, что старые голодающие гетеротрофные культуры арабидопсиса существенно отличаются от онтогенетически стареющих органов растений на транскрипционном уровне. Лишь около 40 % генов арабидопсиса, экспрессия которых повышалась в стареющей культуре клеток, характеризовались ростом экспрессии в листьях при старении, индуцированном темнотой [27]. Дальнейшее исследование особенностей онтогенетического старения, углеродного голодания и старения культур необходимо для анализа онтогенеза и трофического уровня адаптации растений.

Можно заключить, что усвоение субстрата и метаболический ответ на его дефицит, прежде всего, связаны с центральным метаболизмом. Центральный (первичный) метаболизм — это собирательное понятие совокупности обменных процессов, обеспечивающих клетку углеродом, энергией и метаболитами, необходимыми для поддержания жизнедеятельности и предшественниками для синтеза вторичных соединений [28, 29]. Совокупность первичных метаболитов, представленных по большей части небольшими молекулами, такими как C2–C5-карбоновые кислоты, аминокислоты, моносахариды, жирные кислоты и др., составляют специфичный метаболический профиль, характеризующий состояние биологического объекта. Перспективным методом для проведения метаболического профилирования представляется газовая хроматография, сопряженная с масс-спектрометрией (ГХ-МС), — один из основополагающих методов метаболомики [30].

В представленном исследовании проведено сравнение метаболомных профилей гетеротрофной клеточной культуры VBI-0, полученной из паренхимы стебля Nicotiana tabacum L. cv. Virginia Bright Italia 0 [31]. Суспензионная культура VBI-0, так же как и культура By-2 (N. tabacum L., cv. Bright Yellow 2), является легко синхронизируемой и имеющей специфический нитевидный фенотип [32]. Клетки на разных стадиях развития хорошо различаются морфологически: небольшие клетки, образующие цепи в период пролиферации в течение первой недели роста, и одиночные крупные вытянутые клетки после двух недель в стационарной фазе [33]. Именно клетки этих двух стадий, контрастных по своему физиологическому состоянию, были использованы в этом исследовании. Профилирование метаболитов было выполнено в период роста биомассы (7-е сутки) и на этапе старения, в преддверии гибели (28-е сутки).

Цель — выявить метаболические различия клеток растущих и стареющих стационарных суспензионных культур клеток табака VBI-0.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал

Модельным объектом работы является этиолированная суспензионная культура, Nicotiana tabacum L. (VBI-0, культура, Virginia Bright, Italia). Культуру поддерживали в темноте, при температуре 26 °C и постоянном перемешивании на ротационном шейкере (120 об/мин). Пробы отбирали из культур возрастом 7 сут (рост биомассы) и 28 сут (старение). Для анализа отбирали 200 мг сырой биомассы путем фильтрации с помощью водоструйного вакуумного насоса.

Пробоподготовка

Пробы быстро замораживали в жидком азоте. Клетки разрушали в шаровой мельнице (Tissue Lyser LT, QIAGEN, Германия). Экстракцию проводили охлажденной смесью метанол – хлороформ – вода в соотношении 5 : 2 : 2. После экстракции пробы очищали от остатков клеток центрифугированием в течение 10 мин, 15 000 g при 4 °C. Экстракт выпаривали в вакуумном испарителе. Высушенный материал растворяли в смеси пиридина и силилирующего агента BSFA – TMCS (99 : 1), с добавлением внутреннего стандарта (трикозан, нормальный углеводород C23). Материал дериватизировали, инкубируя пробы при 90 °C в течение 20 мин.

Профилирование метаболитов

Для ГХ-МС-анализа использовали газовый хроматограф Agilent 5860, сопряженный с масс-спектрометром Agilent 5975С (Agilent Technologies, США). Для автоматического ввода проб использовали автосэмплер Agilent 7693A. Разделение проводили на капиллярной колонке DB5-HT (Agilent Technologies, США). Газ-носитель — гелий, постоянный поток 1 мл/мин, температура испарителя 250 °C, в режиме splitless, температурный режим термостата колонки: начальная температура 70 °C, затем линейное повышение со скоростью 4°/мин до 320 °C.

Для обработки хроматограмм использовали программное обеспечение PARADISe [34] в сочетании с NIST MS Search (National Institute of Standards and Technology, NIST, США). Дополнительно, для деконволюции и идентификации метаболитов использовали AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST, США). Соединения аннотировали по совпадению полученных масс-спектров (MF > 800) и индексов удерживания Ковача с библиотечными записями в NIST2020 (США), Golm Metabolome Database (GMD, Германия) [35] и собственной библиотеки Лаборатории аналитической фитохимии Ботанического института РАН (Санкт-Петербург, Россия).

Статистический анализ и визуализация

Анализ данных был проведен в среде R4.3.1 «Beagle Scouts». Данные были нормализованы на медиану наблюдения, логарифмированы и стандартизированы. Если соединение отсутствовало в образце, но присутствовало в остальных повторностях, это считали технической ошибкой и проводили импутацию с помощью метода KNN (k-ближайших соседей) с применением пакета impute [36]. Анализ методом главных компонент (PCA, principal component analysis) проводили с помощью pcaMethods [37]. Дискриминантный анализ методом ортогональных проекций на латентные структуры (OPLS-DA, orthogonal projections in latent structure — discriminant analysis) выполняли с помощью пакета ropls [38]. Для анализа обогащения наборов метаболитов (metabolite set enrichment analysis, MSEA) применяли пакет fgsea [39]. Наборы метаболитов для биохимических путей для MSEA и реакционные пары для построения метаболической карты были загружены из базы данных KEGG [40] с использованием пакета KEGGREST [41]. Список метаболитов, относящихся к различным биохимическим путям, корректировали вручную, поскольку для некоторых метаболитов были добавлены необходимые пути. Соединения, для которых был аннотирован класс, помещали в соответствующие пути. Метаболическая карта была построена на платформе Cytoscape [42].

РЕЗУЛЬТАТЫ

На 7-е сутки культуры характеризовались интенсивным ростом плотности биомассы. На 28-е сутки плотность сырой массы не изменялась более 7 дней, что свидетельствует о полном исчерпании ресурсов и завершении развития культуры (рис. 1).

 

Рис. 1. Рост гетеротрофной суспензионной культуры N. tabacum VBI-0

Fig. 1. Growth of heterotrophic suspension cell culture N. tabacum VBI-0: fresh weight density mg per ml

 

В результате анализа ГХ-МС были получены профили метаболитов, которые включали около 300 соединений, 84 из них были определены по совпадению масс-спектров и индексов удерживания с библиотечными, а еще для 44 был аннотирован химический класс. Остальные спектры не были идентифицированы, но были использованы в анализе. Наиболее многочисленными в полученных профилях метаболитов были сахара и их производные (в сумме около 60), сахароспирты, сахарокислоты, фосфосахара, пентозы (включая рибозу), гексозы (в том числе глюкоза и фруктоза), олигосахариды, например сахароза. Было аннотировано большое число сложных молекул, содержащих остатки сахаров, объединяющих, по-видимому, многочисленные ди- и трисахариды, а также вторичные соединения, такие как гликозиды. Профили также включали 24 аминокислоты, из них 17 стандартных, около 20 карбоновых кислот, среди которых присутствовали интермедиаты энергетического обмена. В небольшом количестве обнаружены свободные жирные кислоты и стерины.

Для определения сходства профилей культур в фазе роста и старения был проведен PCA. На рис. 2 профили метаболитов рассеяны в пространстве счетов первых двух главных компонент (ГК). Можно видеть, что наблюдения четко разделены в соответствии с возрастом вдоль ГК1, объясняющей 56,8 % дисперсии. Индивидуальные различия культур одного возраста связаны с ГК2, объясняющей 23 %.

 

Рис. 2. Рассеяние профилей метаболитов в пространстве счетов главных компонент (ГК), полученных при анализе суспензионных культур клеток N. tabacum VBI-0 на стадиях роста и старения. Эллипсы — 95 % доверительные интервалы, % — доля дисперсии, связанная с главной компонентой

Fig. 2. Score plot from PCA of metabolite profiles extracted from heterotrophic suspension cell culture N. tabacum VBI-0 at growth and senescence. Eclipses — are the 95% confidence intervals, % — percent of variation

 

Поскольку профили метаболитов группировались в соответствии со стадиями развития культуры, на следующем этапе для выявления метаболитов, накапливающихся дифференциально в зависимости от стадии развития, был проведен дискриминантный анализ методом ортогональных проекций на латентные структуры (OPLS-DA). Отбор метаболитов, связанных со старением, мы проводили по величине VIP (variable importance in projection) [38]. На рис. 3 результаты представлены на упрощенной карте центрального метаболизма, построенной на основе главных реакционных пар (субстрат – продукт) из базы данных KEGG [40].

 

Рис. 3. Визуализация метаболитов, дифференциально накапливающихся (ДНМ), в растущих и стареющих культурах клеток N. tabacum VBI-0. Выбор ДНМ осуществлен по VIP > 1. FC — кратность различий средних значений (fold changes). Увеличение соответствует более высокому накоплению на стадии старения

Fig. 3. Visualization of differentially accumulated metabolites (DAMs) in suspension cell culture N. tabacum VBI-0 at growth and senescence stages. DAMs were selected by rule: VIP > 1. Increase refers to higher level at senescence. FC — fold changes

 

Показано, что стареющие культуры отличались от растущих более высоким уровнем сложных сахаров, в том числе сахарозы, при этом уровень глюкозы и фруктозы существенно не различался. Вместе с этим объемы пулов фосфатов гексоз или не менялись, или сокращались. Старение также было связано с накоплением пентоз и в небольшой степени гексоз. Уровень конечного продукта гликолиза — пирувата, а также малата был выше в стационарных культурах. При этом уровень других зарегистрированных интермедиатов ЦТК не показал различий. Интересно, что уровень многих других карбоновых кислот, не вовлеченных напрямую в энергетический метаболизм, вырос. Наиболее ярким отличием профилей метаболитов стареющих культур представляется падение накопления почти всех свободных аминокислот. В их число входят интермедиаты азотного обмена: глутамат, глутамин и орнитин. Интересно, что на фоне этого наблюдалось значительное накопление мочевины. Можно отметить, что только на стадии роста была обнаружена аминоциклопропанкарбоновая кислота, являющаяся предшественником этилена. В уровне стеринов и свободных жирных кислот различий почти не наблюдалось. Исключением было сильное падение содержания одного неидентифицированного стерина и рост одной жирной кислоты с очень длинной цепью (С24), лигноцериновой (рис. 3).

Чтобы определить связь изменений с биохимическими путями, реализуемыми в растительной клетке, мы провели анализ обогащения. Он позволяет оценить силу и вероятность направленных согласованных изменений накопления набора метаболитов [39]. Мы использовали списки метаболитов биохимических путей из базы KEGG [40]. Результат представлен на рис. 4. Как можно заметить, стареющие культуры отличались от растущих большим накоплением сахаров, вовлеченных в метаболизм сахарозы, галактозы и аскорбата. При этом уменьшались пулы аминокислот, что может быть связано с репрессией синтеза белка и, возможно, азотосодержащих вторичных соединений, предшественниками которых они являются. Интермедиаты ЦТК, путей синтеза стеринов и жирных кислот не показали достоверных однонаправленных изменений.

 

Рис. 4. Анализ обогащения, полученный на основе нагрузок предиктивной компоненты ОПЛС-ДА. Сеть метаболических путей, реализуемых в клетках N. tabacum. Узлы — метаболические пути из базы данных KEGG. Если они имеют общие метаболиты в профиле, то они соединены ребрами, которые их стягивают. Размер — NES, нормализованная оценка обогащения (normalized enrichment score), цвет — FDR, уровень ложноположительных результатов (false discovery rate). Треугольники с вершиной, направленной вверх соответствуют более высокому накоплению интермедиатов пути при старении

Fig. 4. Metabolite sets enrichment analysis based on loadings from OPLS-DA classification. Nodes of graph are KEGG pathways for N. tabacum, edges, contracting nodes, are presence of common metabolites in profiles. Size — strength of influence (NES, normalized enrichment score), color — FDR (false discovery rate), up triangles refer to accumulation of pathway intermediates at senescence

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Состав профилей метаболитов культур клеток VBI-0 был сходен с таковыми у нативных проростков табака [43]. При том что спектры были получены и аннотированы близкими методами, количество соединений в профилях культуры было существенно меньшим. Как в проростках, так и в культурах наиболее широко представленной группой были углеводы. Тем не менее в случае культур число соединений, аннотированных как углеводы, было в полтора раза меньше, чем в случае проростков. Главным образом, в культурах наблюдалось меньше сложных углеводов. Причиной этого может являться дифференцировка органов, тканей и клеток в многоклеточном организме, которая прослеживается и на биохимическом уровне [44]. С другой стороны, проростки обладают полнофункциональными пластидами, освещаются и осуществляют фотосинтез, что предположительно расширяет метаболическую сеть и делает профиль метаболитов более разнообразным. Нужно также иметь в виду, что остатки сахаров входят в состав многих вторичных соединений [45], а синтез специализированных молекул запускается обычно в ответ на неблагоприятные воздействия [3, 46]. Поскольку экспериментальные суспензионные культуры поддерживали в стабильных и благоприятных условиях, механизмы синтеза многих вторичных соединений могли быть неактивными. С этим согласуется тот факт, что анализируемые культуры клеток отличались меньшим числом идентифицированных вторичных соединений. Например, в культурах табака не детектировали никотин, столь характерный для N. tabacum. Подчеркнем, что эти соединения были идентифицированы в проростках [43]. И последнее, важным фактором формирования профиля углеводов может быть изменение состава клеточной стенки. Появление большого числа олигосахаридов в профиле исследованных нами культур может быть результатом частичной деградации полисахаридов клеточной стенки, что ранее было отмечено в процессе развития суспензионных культур табака.

Хорошо известно, что органы и ткани растений с возрастом претерпевают физиологические изменения. Это выражается и в том, что профили метаболитов растений разного возраста [47, 48] или органов в процессе развития [49] существенно различаются. Как правило, на ранних стадиях развития растений, органов и культур имеет место увеличение сопряжений с высокой синтетической активностью. Например, активно делящиеся клетки томатов в суспензионных культурах отличаются высоким уровнем потока углерода в синтез белка [21]. С высокой активностью синтеза белка связано высокое содержание свободных аминокислот, которое наблюдается на более ранних стадиях развития растений [50].

Синтетическая активность должна поддерживаться соответствующими ресурсами. Поскольку источником углерода и энергии для гетеротрофной культуры являются сахара, важную роль в обеспечении клетки приобретают пути их метаболизма. Моделирование потоков в гетеротрофных клетках арабидопсиса показало, что именно гликолиз и ЦТК играют ведущую роль в утилизации глюкозы [51]. Высокую значимость гликолизу может придать сочетание высокого уровня фосфорилированных гексоз и низкого соотношения АТФ/АДФ. Такая картина наблюдается, например, в период пролиферации клеток перикарпа плодов томатов [52]. Аналогично и в случае нашего исследования: в суспензионных культурах все фосфаты сахаров характеризовались большим содержанием в период роста. Падение уровня фосфатов сахаров при старении свидетельствует о снижении уровня активности начальных реакций гликолиза. Окончание пролиферации гетеротрофных клеток томата в культуре совпало с падением потоков через гликолиз и ЦТК [21]. Показано, что по мере старения гетеротрофных культур клеток табака активность аэробного дыхания снижается [20]. Предположительно, это является результатом углеродного голодания. Падение уровня дыхания, сопряженное со снижением содержания фосфорилированных сахаров, наблюдалось ранее в голодающих культурах после удаления субстрата из среды [14, 15]. В то же время высокий уровень сахарозы в клетках старых культур можно объяснить ее накоплением, как основного осмотика, в центральной вакуоли, объем которой увеличивается в процессе роста клеток [53]. Накопление свободных сахаров наблюдается на поздних стадиях развития растений и органов [50, 54]. Рост вакуоли также, вероятно, связан и с увеличением пула малата, который обычно накапливается в значительных количествах именно в этом компартменте [55, 56]. Накопление малата и других карбоксилатов может быть опосредовано частичным окислением сахаров для снабжения энергией [57], как и рост уровня пирувата, конечного продукта гликолиза.

По результатам анализа обогащения можно высказать предположение, что при старении активируется метаболизм аскорбата, как результат развития окислительного стресса в стареющих культурах. Высокая плотность культуры и исчерпание нутриентов в среде могут выступать в роли стрессовых факторов. А снижение уровня дыхания на поздних стадиях развития может рассматриваться в качестве механизма снижения окислительного стресса и замедления процесса старения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог, следует заметить, что клетки стареющих гетеротрофных культур испытывают стресс, связанный с углеродным голоданием и изменениями состава среды. Полученные метаболомные данные свидетельствуют о том, что старение сопряжено с падением уровня синтетических процессов, снижением активности начальной части гликолиза, накоплением сложных сахаров, пентоз и карбоксилатов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Благодарности. Исследования выполнены на оборудовании Ресурсного центра Санкт-Петербургского государственного университета «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Авторы выражают признательность проф. E. Zažímalová за предоставление культуры клеток табака, а также канд. биол. наук Т. Chen за помощь в проведении данного исследования.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: Р.К. Пузанский — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, хроматографическое исследование, анализ полученных данных, написание текста, привлечение финансирования; А.А. Кирпичникова — выращивание культуры, сбор и обработка материалов; А.Л. Шаварда — хроматографическое исследование, анализ полученных данных; В.В. Емельянов — сбор и обработка материалов, внесение окончательной правки; М.Ф. Шишова — концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных, написание текста, внесение окончательной правки.

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 23-24-00393, https://rscf.ru/project/23-24-00393/).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

×

Об авторах

Роман Константинович Пузанский

Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: puzansky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5862-2676
SPIN-код: 6399-2016

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Анастасия Алексеевна Кирпичникова

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: nastin1972@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5133-5175
SPIN-код: 9960-9527
Россия, Санкт-Петербург

Алексей Леонидович Шаварда

Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: stachyopsis@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1778-2814
SPIN-код: 5637-5122

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Владислав Владимирович Емельянов

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: bootika@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2323-5235
SPIN-код: 9460-1278

канд. биол. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Мария Федоровна Шишова

Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: mshishova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3657-2986
SPIN-код: 7842-7611
https://bio.spbu.ru/staff/id200_mfsh.php

д-р биол. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

  1. Imseng N., Schillberg S., Schürch C., et al. Suspension culture of plant cells under heterotrophic conditions. В кн.: Meyer H., Schmidhalter D.R., editors. Industrial scale suspension culture of living cells. 1st edition. Wiley, 2014. P. 224–258. doi: 10.1002/9783527683321.ch07
  2. Loyola-Vargas V.M., Vázquez-Flota F. An introduction to plant cell culture: back to the future. В кн.: Loyola-Vargas V.M., Vázquez-Flota F., editors. Plant Cell Culture Protocols. Methods in Molecular Biology™. Vol. 318. Humana Press, 2005. P. 3–8. doi: 10.1385/1-59259-959-1:003
  3. Mhlongo M.I., Steenkamp P.A., Piater L.A., et al. Profiling of altered metabolomic states in Nicotiana tabacum cells induced by priming agents // Front Plant Sci. 2016. Vol. 7. ID 1527. doi: 10.3389/fpls.2016.01527
  4. Kariya K., Tsuchiya Y., Sasaki T., Yamamoto Y. Aluminium-induced cell death requires upregulation of NtVPE1 gene coding vacuolar processing enzyme in tobacco (Nicotiana tabacum L.) // J Inorg Biochem. 2018. Vol. 181. P. 152–161. doi: 10.1016/j.jinorgbio.2017.09.008
  5. Bapat V.A., Kavi Kishor P.B., Jalaja N., et al. Plant cell cultures: Biofactories for the production of bioactive compounds // Agronomy. 2023. Vol. 13, N. 3. ID 858. doi: 10.3390/agronomy13030858
  6. Zagorskaya A.A., Deineko E.V. Suspension-cultured plant cells as a platform for obtaining recombinant proteins // Russian Journal Plant Physiology. 2017. Vol. 64, N. 6. P. 795–807. doi: 10.1134/S102144371705017X
  7. Roitsch T., Sinha A.K. Application of photoautotrophic suspension cultures in plant science // Photosynt. 2002. Vol. 40, N. 4. P. 481–492. doi: 10.1023/A:1024332430494
  8. Schenk R.U., Hildebrandt A.C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures // Can J Bot. 1972. Vol. 50, N. 1. P. 199–204. doi: 10.1139/b72-026
  9. Dominguez P.G., Niittylä T. Mobile forms of carbon in trees: metabolism and transport // Tree Physiol. 2022. Vol. 42, N. 3. P. 458–487. doi: 10.1093/treephys/tpab123
  10. Ruan Y.L. Sucrose metabolism: Gateway to diverse carbon use and sugar signaling // Annu Rev Plant Biol. 2014. Vol. 65. P. 33–67. doi: 10.1146/annurev-arplant-050213-040251
  11. Contento A.L., Kim S.-J., Bassham D.C. Transcriptome profiling of the response of Arabidopsis suspension culture cells to Suc starvation // Plant Physiol. 2004. Vol. 135, N. 4. P. 2330–2347. doi: 10.1104/pp.104.044362
  12. Journet E.P., Bligny R., Douce R. Biochemical changes during sucrose deprivation in higher plant cells // J Biol Chem. 1986. Vol. 261, N. 7. P. 3193–3199. doi: 10.1016/S0021-9258(17)35767-8
  13. Wang H.-J., Wan A.-R., Hsu C.-M., et al. Transcriptomic adaptations in rice suspension cells under sucrose starvation // Plant Mol Biol. 2007. Vol. 63, N. 4. P. 441–463. doi: 10.1007/s11103-006-9100-4
  14. Gout E., Bligny R., Douce R., et al. Early response of plant cell to carbon deprivation: in vivo 31P-NMR spectroscopy shows a quasi-instantaneous disruption on cytosolic sugars, phosphorylated intermediates of energy metabolism, phosphate partitioning, and intracellular pHs // New Phytol. 2011. Vol. 189, N. 1. P. 135–147. doi: 10.1111/j.1469-8137.2010.03449.x
  15. Roby C., Martin J.-B., Bligny R., Douce R. Biochemical changes during sucrose deprivation in higher plant cells. Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance studies // J Biol Chem. 1987. Vol. 262, N. 11. P. 5000–5007. doi: 10.1016/S0021-9258(18)61145-7
  16. Inoue Y., Moriyasu Y. Degradation of membrane phospholipids in plant cells cultured in sucrose-free medium // Autophagy. 2006. Vol. 2, N. 3. P. 244–246. doi: 10.4161/auto.2745
  17. Kim S.W., Koo B.C., Kim J., Liu J.R. Metabolic discrimination of sucrose starvation from Arabidopsis cell suspension by 1H NMR based metabolomics // Biotechnol Bioprocess Eng. 2007. Vol. 12, N. 6. P. 653–661. doi: 10.1007/BF02931082
  18. Binder S. Branched-chain amino acid metabolism in Arabidopsis thaliana // The Arabidopsis Book. 2010. Vol. 2010, N. 8. ID e0137. doi: 10.1199/tab.0137
  19. Morkunas I., Borek S., Formela M., Ratajczak L. Plant responses to sugar starvation. В кн.: Chang C.F., editor. Carbohydrates — comprehensive studies on glycobiology and glycotechnology. InTech, 2012. doi: 10.5772/51569
  20. Tsuchiya Y., Nakamura T., Izumi Y., et al. Physiological role of aerobic fermentation constitutively expressed in an aluminum-tolerant cell line of tobacco (Nicotiana tabacum) // Plant Cell Physiol. 2021. Vol. 62, N. 9. P. 1460–1477. doi: 10.1093/pcp/pcab098
  21. Rontein D., Dieuaide-Noubhani M., Dufourc E.J., et al. The metabolic architecture of plant cells // J Biol Chem. 2002. Vol. 277, N. 46. P. 43948–43960. doi: 10.1074/jbc.M206366200
  22. Peč J., Flores-Sanchez I.J., Choi Y.H., Verpoorte R. Metabolic analysis of elicited cell suspension cultures of Cannabis sativa L. by 1H-NMR spectroscopy // Biotechnol Lett. 2010. Vol. 32, N. 7. P. 935–941. doi: 10.1007/s10529-010-0225-9
  23. Toyooka K., Sato M., Wakazaki M., Matsuoka K. Morphological and quantitative changes in mitochondria, plastids, and peroxisomes during the log-to-stationary transition of the growth phase in cultured tobacco BY-2 cells // Plant Signal Behav. 2016. Vol. 11, N. 3. ID e1149669. doi: 10.1080/15592324.2016.1149669
  24. Toyooka K., Sato M., Kutsuna N., et al. Wide-range high-resolution transmission electron microscopy reveals morphological and distributional changes of endomembrane compartments during log to stationary transition of growth phase in tobacco BY-2 cells // Plant Cell Physiol. 2014. Vol. 55, N. 9. P. 1544–1555. doi: 10.1093/pcp/pcu084
  25. Voitsekhovskaja O.V., Schiermeyer A., Reumann S. Plant peroxisomes are degraded by starvation-induced and constitutive autophagy in tobacco BY-2 suspension-cultured cells // Front Plant Sci. 2014. Vol. 5. ID 629. doi: 10.3389/fpls.2014.00629
  26. Zhao Z., Zhang J.-W., Lu S.-H., et al. Transcriptome divergence between developmental senescence and premature senescence in Nicotiana tabacum L. // Sci Rep. 2020. Vol. 10, N. 1. ID 20556. doi: 10.1038/s41598-020-77395-2
  27. Buchanan-Wollaston V., Page T., Harrison E., et al. Comparative transcriptome analysis reveals significant differences in gene expression and signalling pathways between developmental and dark/starvation-induced senescence in Arabidopsis // Plant J. 2005. Vol. 42, N. 4. P. 567–585. doi: 10.1111/j.1365-313X.2005.02399.x
  28. Noor E., Eden E., Milo R., Alon U. Central carbon metabolism as a minimal biochemical walk between precursors for biomass and energy // Mol Cell. 2010. Vol. 39, N. 5. P. 809–820. doi: 10.1016/j.molcel.2010.08.031
  29. Zakhartsev M., Medvedeva I., Orlov Y., et al. Metabolic model of central carbon and energy metabolisms of growing Arabidopsis thaliana in relation to sucrose translocation // BMC Plant Biol. 2016. Vol. 16, N. 1. ID262. doi: 10.1186/s12870-016-0868-3
  30. Fiehn O. Metabolomics by Gas chromatography–mass spectrometry: Combined targeted and untargeted profiling // Curr Prot Molecul Biol. 2016. Vol. 114, N. 1. P. 30.4.1–30.4.32. doi: 10.1002/0471142727.mb3004s114
  31. Zažímalová E., Petrášek J., Morris D.A. The dynamics of auxin transport in tobacco cells // Bulg J Plant Physiol. 2003. N. S. P. 207–224.
  32. Campanoni P., Blasius B., Nick P. Auxin transport synchronizes the pattern of cell division in a tobacco cell line // Plant Physiol. 2003. Vol. 133, N. 3. P. 1251–1260. doi: 10.1104/pp.103.027953
  33. Zažimalová E., Opatrný Z., Březinová A., Eder J. The effect of auxin starvation on the growth of auxin-dependent tobacco cell culture: dynamics of auxin-binding activity and endogenous free IAA content // J Exp Bot. 1995. Vol. 46, N. 9. P. 1205–1213. doi: 10.1093/jxb/46.9.1205
  34. Johnsen L.G., Skou P.B., Khakimov B., Bro R. Gas chromatography–mass spectrometry data processing made easy // J Chromatogr A. 2017. Vol. 1503. P. 57–64. doi: 10.1016/j.chroma.2017.04.052
  35. Hummel J., Selbig J., Walther D., Kopka J. The Golm Metabolome Database: a database for GC-MS based metabolite profiling. В кн.: Nielsen J., Jewett M.C., editors. Metabolomics. Topics in Current Genetics. Vol. 18. Berlin, Heidelberg: Springer, 2007. P. 75–95. doi: 10.1007/4735_2007_0229
  36. Hastie T., Tibshirani R., Narasimhan B., Chu G. impute: impute: Imputation for microarray data // Bioconductor. 2023. R package version 1.76.0. doi: 10.18129/B9.bioc.impute
  37. Stacklies W., Redestig H., Scholz M., et al. pcaMethods — a bioconductor package providing PCA methods for incomplete data // Bioinformatics. 2007. Vol. 23, N. 9. P. 1164–1167. doi: 10.1093/bioinformatics/btm069
  38. Thévenot E.A., Roux A., Xu Y., et al. Analysis of the human adult urinary metabolome variations with age, body mass index, and gender by implementing a comprehensive workflow for univariate and OPLS statistical analyses // J Proteome Res. 2015. Vol. 14, N. 8. P. 3322–3335. doi: 10.1021/acs.jproteome.5b00354
  39. Korotkevich G., Sukhov V., Budin N., et al. Fast gene set enrichment analysis // BioRxiv. 2021. ID60012. doi: 10.1101/060012
  40. Kanehisa M., Furumichi M., Sato Y., et al. KEGG for taxonomy-based analysis of pathways and genomes // Nucleic Acids Res. 2023. Vol. 51, N. D1. P. D587–D592. doi: 10.1093/nar/gkac963
  41. Tenenbaum D., Maintainer B. KEGGREST: Client-side REST access to the Kyoto Encyclopedia of genes and genomes (KEGG) // Bioconductor. 2022. R package version 1.36.2. doi: 10.18129/B9.bioc.KEGGREST
  42. Shannon P., Markiel A., Ozier O., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks // Genome Res. 2003. Vol. 13, N. 11. P. 2498–2504. doi: 10.1101/gr.1239303
  43. Yemelyanov V.V., Puzanskiy R.K., Burlakovskiy M.S., et al. Metabolic profiling of transgenic tobacco plants synthesizing bovine interferon-gamma. В кн.: Zhan X., editor. Metabolomics — methodology and applications in medical sciences and life sciences. IntechOpen, 2021. doi: 10.5772/intechopen.96862
  44. Li D., Heiling S., Baldwin I.T., Gaquerel E. Illuminating a plant’s tissue-specific metabolic diversity using computational metabolomics and information theory // PNAS USA. 2016. Vol. 113, N. 47. P. E7610–E7618. doi: 10.1073/pnas.1610218113
  45. Bartnik M., Facey P.C. Glycosides. В кн.: Badal S., Delgoda R., editors. Pharmacognosy. Elsevier, 2017. P. 101–161. doi: 10.1016/B978-0-12-802104-0.00008-1
  46. Tugizimana F., Steenkamp P.A., Piater L.A., Dubery I.A. Multi-platform metabolomic analyses of ergosterol-induced dynamic changes in Nicotiana tabacum cells // PLoS ONE. 2014. Vol. 9, N. 1. ID e87846. doi: 10.1371/journal.pone.0087846
  47. Petrova N.V., Sazanova K.V., Medvedeva N.A., Shavarda A.L. Features of metabolomic profiles in different stages of ontogenesis in Prunella vulgaris (Lamiaceae) grown in a climate chamber // Russian Journal Bioorganic Chemistry. 2019. Vol. 45, N. 7. P. 906–912. doi: 10.1134/S1068162019070100
  48. Yurkov A.P., Puzanskiy R.K., Avdeeva G.S., et al. Mycorrhiza-induced alterations in metabolome of Medicago lupulina leaves during symbiosis development // Plants. 2021. Vol. 10, N. 11. ID 2506. doi: 10.3390/plants10112506
  49. Liu Y., Li M., Xu J., et al. Physiological and metabolomics analyses of young and old leaves from wild and cultivated soybean seedlings under low-nitrogen conditions // BMC Plant Biol. 2019. Vol. 19, N. 1. ID389. doi: 10.1186/s12870-019-2005-6
  50. Shtark O.Y., Puzanskiy R.K., Avdeeva G.S., et al. Metabolic alterations in pea leaves during arbuscular mycorrhiza development // PeerJ. 2019. Vol. 7. ID e7495. doi: 10.7717/peerj.7495
  51. Smith E.N., Ratcliffe R.G., Kruger N.J. Isotopically non-stationary metabolic flux analysis of heterotrophic Arabidopsis thaliana cell cultures // Front Plant Sci. 2023. Vol. 13. ID1049559. doi: 10.3389/fpls.2022.1049559
  52. Shameer S., Vallarino J.G., Fernie A.R., et al. Flux balance analysis of metabolism during growth by osmotic cell expansion and its application to tomato fruits // Plant J. 2020. Vol. 103, N. 1. P. 68–82. doi: 10.1111/tpj.14707
  53. Shameer S., Vallarino J.G., Fernie A.R., et al. Predicting metabolism during growth by osmotic cell expansion // BiolRxiv. 2019. ID 731232. doi: 10.1101/731232
  54. Li W., Zhang H., Li X., et al. Intergrative metabolomic and transcriptomic analyses unveil nutrient remobilization events in leaf senescence of tobacco // Sci Rep. 2017. Vol. 7, N. 1. ID 12126. doi: 10.1038/s41598-017-11615-0
  55. Tohge T., Ramos M.S., Nunes-Nesi A., et al. Toward the storage metabolome: Profiling the barley vacuole // Plant Physiol. 2011. Vol. 157, N. 3. P. 1469–1482. doi: 10.1104/pp.111.185710
  56. Ohnishi M., Anegawa A., Sugiyama Y., et al. Molecular components of Arabidopsis intact vacuoles clarified with metabolomic and proteomic analyses // Plant Cell Physiol. 2018. Vol. 59, N. 7. P. 1353–1362. doi: 10.1093/pcp/pcy069
  57. Beauvoit B.P., Colombié S., Monier A., et al. Model-assisted analysis of sugar metabolism throughout tomato fruit development reveals enzyme and carrier properties in relation to vacuole expansion // Plant Cell. 2014. Vol. 26, N. 8. P. 3224–3242. doi: 10.1105/tpc.114.127761

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать
2. Рис. 1. Рост гетеротрофной суспензионной культуры N. tabacum VBI-0

Скачать (63KB)
Метаданные
3. Рис. 2. Рассеяние профилей метаболитов в пространстве счетов главных компонент (ГК), полученных при анализе суспензионных культур клеток N. tabacum VBI-0 на стадиях роста и старения. Эллипсы — 95 % доверительные интервалы, % — доля дисперсии, связанная с главной компонентой

Скачать (94KB)
Метаданные
4. Рис. 3. Визуализация метаболитов, дифференциально накапливающихся (ДНМ), в растущих и стареющих культурах клеток N. tabacum VBI-0. Выбор ДНМ осуществлен по VIP > 1. FC — кратность различий средних значений (fold changes). Увеличение соответствует более высокому накоплению на стадии старения

Скачать (401KB)
Метаданные
5. Рис. 4. Анализ обогащения, полученный на основе нагрузок предиктивной компоненты ОПЛС-ДА. Сеть метаболических путей, реализуемых в клетках N. tabacum. Узлы — метаболические пути из базы данных KEGG. Если они имеют общие метаболиты в профиле, то они соединены ребрами, которые их стягивают. Размер — NES, нормализованная оценка обогащения (normalized enrichment score), цвет — FDR, уровень ложноположительных результатов (false discovery rate). Треугольники с вершиной, направленной вверх соответствуют более высокому накоплению интермедиатов пути при старении

Скачать (319KB)
Метаданные

© Эко-Вектор, 2024

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 89324 от 21.04.2025.