Метаболомика старения гетеротрофных суспензионных культур Nicotiana tabacum L. VBI-0

Полный текст

АКТУАЛЬНОСТЬ

Клеточные культуры высших растений, в том числе трансформированные, широко используют в качестве модельных систем для изучения целого ряда процессов, реализующихся в растительных организмах, в том числе деления, эмбриогенеза, дифференциации, различных этапов первичного и вторичного метаболизма и др. [1, 2]. Изучение культур позволяет углубить понимание клеточных механизмов адаптации растительных организмов к биотическим [3] и абиотическим стрессорам [4]. Наряду с этим культуры растительных клеток широко востребованы в современной биотехнологии для получения биологически активных соединений, гетерологичных белков и т. д. [5]. Применение асептических строго контролируемых условий позволяет достичь высокой воспроизводимости результатов, синхронизации клеточного цикла и высокой скорости роста [2, 6]. Культуры клеток растений могут быть как фотосинтезирующими [7], так и гетеротрофными [1]. Гетеротрофные культуры поддерживаются в темноте, а единственным источником углерода и энергии у них становятся органические соединения, входящие в состав среды. Клетки растений способны потреблять экзогенные органические соединения, особенно, сахарозу [8], являющуюся основной транспортируемой формой углерода у высших растений [9].

Включение сахарозы в метаболизм начинается с расщепления, которое осуществляется двумя типами ферментов — инвертазами и сахарозосинтазами. Инвертазы гидролизуют сахарозу на глюкозу и фруктозу. Кислые инвертазы локализованы в вакуоли, нейтральные/щелочные — в цитоплазме и апопласте [10]. Сахарозосинтазы расщепляют молекулы сахарозы на фруктозу и УДФ-глюкозу, которая является предшественником в синтезе ряда метаболитов. Вероятно, несколько путей включения сахарозы в метаболизм могут работать параллельно, и тогда возникает вопрос об их соотношении в норме и при стрессе. Продукты гидролиза сахарозы могут быть катаболизированы через гликолиз, цикл трикарбоновых кислот (ЦТК) и пентозофосфатный путь для получения энергии. С другой стороны, экзогенный углерод может быть вовлечен в накопление биомассы, направлен в синтез амино- и жирных кислот или других соединений. Помимо этого, поступающий углерод может быть депонирован в форме крахмала или липидов. Интенсивность перечисленных процессов метаболизма зависит от видовых особенностей исследуемой культуры клеток, физиологической и биохимической активности составляющих ее клеток и меняется в процессе развития.

Очевидно, что в процессе роста культур происходит исчерпание субстрата и развивается голодание. Первым последствием голодания является падение физиологической активности. Удаление сахарозы ведет к быстрому снижению уровня дыхания [11, 12]. Падает экспрессия генов, кодирующих ферменты ЦТК и окислительного фосфорилирования [13]. Падает и уровень гликолиза, что выражается в снижении уровня фосфатов сахаров [14, 15] и экспрессии генов соответствующих ферментов [13, 11]. Кроме того, при голодании клеток наблюдается мобилизация резервов. Быстрым, но кратковременным источником углерода служат вакуолярные пулы сахарозы и малата [14]. Отмечено усиление экспрессии некоторых генов, связанных с гидролизом крахмала [13]. Происходит мобилизация липидов, которая обеспечивается индукцией генов липаз и ферментов окисления жирных кислот [13, 11]. Вместе с этим может иметь место деградация мембран [16]. Дополняется картина снижением экспрессии генов ферментов, участвующих в синтезе жирных кислот [11]. Показано, что голодание клеток характеризуется высокой протеолитической активностью, так как аминокислоты также могут быть источником углерода при голодании. На это указывает рост уровня экспрессии генов ферментов, связанных с катаболизмом аминокислот [17], особенно с катаболизмом разветвленных аминокислот [18]. Этот процесс влечет за собой перестройку азотного обмена [19]. Однако голодание гетеротрофных культур может длиться только очень ограниченный период времени. В случае суспензионных культур арабидопсиса уже после 24 ч голодания жизнеспособность клеток начинает быстро падать. После 48 ч культура теряет возможность восстанавливаться после пересева, что указывает на невозможность восстановления нового цикла развития, начинающегося с пролиферации [11].

Исчерпание нутриентов и другие изменения среды порождают комплекс физиологических процессов, заканчивающихся гибелью культуры, этот этап можно назвать старением. Происходит остановка роста, снижается уровень дыхания и синтетических процессов [20, 21]; меняется состав жирных кислот [22]; изменяется морфология и число органелл [23–25]. Особый интерес вызывает сравнительный анализ процессов, протекающих в культурах клеток растений при голодании и на поздних стадиях развития, с таковыми при онтогенетическом или индуцированном старении клеток в составе нативных органов растений [26, 19]. Было установлено, что старые голодающие гетеротрофные культуры арабидопсиса существенно отличаются от онтогенетически стареющих органов растений на транскрипционном уровне. Лишь около 40 % генов арабидопсиса, экспрессия которых повышалась в стареющей культуре клеток, характеризовались ростом экспрессии в листьях при старении, индуцированном темнотой [27]. Дальнейшее исследование особенностей онтогенетического старения, углеродного голодания и старения культур необходимо для анализа онтогенеза и трофического уровня адаптации растений.

Можно заключить, что усвоение субстрата и метаболический ответ на его дефицит, прежде всего, связаны с центральным метаболизмом. Центральный (первичный) метаболизм — это собирательное понятие совокупности обменных процессов, обеспечивающих клетку углеродом, энергией и метаболитами, необходимыми для поддержания жизнедеятельности и предшественниками для синтеза вторичных соединений [28, 29]. Совокупность первичных метаболитов, представленных по большей части небольшими молекулами, такими как C₂–C₅-карбоновые кислоты, аминокислоты, моносахариды, жирные кислоты и др., составляют специфичный метаболический профиль, характеризующий состояние биологического объекта. Перспективным методом для проведения метаболического профилирования представляется газовая хроматография, сопряженная с масс-спектрометрией (ГХ-МС), — один из основополагающих методов метаболомики [30].

В представленном исследовании проведено сравнение метаболомных профилей гетеротрофной клеточной культуры VBI-0, полученной из паренхимы стебля Nicotiana tabacum L. cv. Virginia Bright Italia 0 [31]. Суспензионная культура VBI-0, так же как и культура By-2 (N. tabacum L., cv. Bright Yellow 2), является легко синхронизируемой и имеющей специфический нитевидный фенотип [32]. Клетки на разных стадиях развития хорошо различаются морфологически: небольшие клетки, образующие цепи в период пролиферации в течение первой недели роста, и одиночные крупные вытянутые клетки после двух недель в стационарной фазе [33]. Именно клетки этих двух стадий, контрастных по своему физиологическому состоянию, были использованы в этом исследовании. Профилирование метаболитов было выполнено в период роста биомассы (7-е сутки) и на этапе старения, в преддверии гибели (28-е сутки).

Цель — выявить метаболические различия клеток растущих и стареющих стационарных суспензионных культур клеток табака VBI-0.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал

Модельным объектом работы является этиолированная суспензионная культура, Nicotiana tabacum L. (VBI-0, культура, Virginia Bright, Italia). Культуру поддерживали в темноте, при температуре 26 °C и постоянном перемешивании на ротационном шейкере (120 об/мин). Пробы отбирали из культур возрастом 7 сут (рост биомассы) и 28 сут (старение). Для анализа отбирали 200 мг сырой биомассы путем фильтрации с помощью водоструйного вакуумного насоса.

Пробоподготовка

Пробы быстро замораживали в жидком азоте. Клетки разрушали в шаровой мельнице (Tissue Lyser LT, QIAGEN, Германия). Экстракцию проводили охлажденной смесью метанол – хлороформ – вода в соотношении 5 : 2 : 2. После экстракции пробы очищали от остатков клеток центрифугированием в течение 10 мин, 15 000 g при 4 °C. Экстракт выпаривали в вакуумном испарителе. Высушенный материал растворяли в смеси пиридина и силилирующего агента BSFA – TMCS (99 : 1), с добавлением внутреннего стандарта (трикозан, нормальный углеводород C₂₃). Материал дериватизировали, инкубируя пробы при 90 °C в течение 20 мин.

Профилирование метаболитов

Для ГХ-МС-анализа использовали газовый хроматограф Agilent 5860, сопряженный с масс-спектрометром Agilent 5975С (Agilent Technologies, США). Для автоматического ввода проб использовали автосэмплер Agilent 7693A. Разделение проводили на капиллярной колонке DB5-HT (Agilent Technologies, США). Газ-носитель — гелий, постоянный поток 1 мл/мин, температура испарителя 250 °C, в режиме splitless, температурный режим термостата колонки: начальная температура 70 °C, затем линейное повышение со скоростью 4°/мин до 320 °C.

Для обработки хроматограмм использовали программное обеспечение PARADISe [34] в сочетании с NIST MS Search (National Institute of Standards and Technology, NIST, США). Дополнительно, для деконволюции и идентификации метаболитов использовали AMDIS (Automated Mass Spectral Deconvolution and Identification System, NIST, США). Соединения аннотировали по совпадению полученных масс-спектров (MF > 800) и индексов удерживания Ковача с библиотечными записями в NIST2020 (США), Golm Metabolome Database (GMD, Германия) [35] и собственной библиотеки Лаборатории аналитической фитохимии Ботанического института РАН (Санкт-Петербург, Россия).

Статистический анализ и визуализация

Анализ данных был проведен в среде R4.3.1 «Beagle Scouts». Данные были нормализованы на медиану наблюдения, логарифмированы и стандартизированы. Если соединение отсутствовало в образце, но присутствовало в остальных повторностях, это считали технической ошибкой и проводили импутацию с помощью метода KNN (k-ближайших соседей) с применением пакета impute [36]. Анализ методом главных компонент (PCA, principal component analysis) проводили с помощью pcaMethods [37]. Дискриминантный анализ методом ортогональных проекций на латентные структуры (OPLS-DA, orthogonal projections in latent structure — discriminant analysis) выполняли с помощью пакета ropls [38]. Для анализа обогащения наборов метаболитов (metabolite set enrichment analysis, MSEA) применяли пакет fgsea [39]. Наборы метаболитов для биохимических путей для MSEA и реакционные пары для построения метаболической карты были загружены из базы данных KEGG [40] с использованием пакета KEGGREST [41]. Список метаболитов, относящихся к различным биохимическим путям, корректировали вручную, поскольку для некоторых метаболитов были добавлены необходимые пути. Соединения, для которых был аннотирован класс, помещали в соответствующие пути. Метаболическая карта была построена на платформе Cytoscape [42].

РЕЗУЛЬТАТЫ

На 7-е сутки культуры характеризовались интенсивным ростом плотности биомассы. На 28-е сутки плотность сырой массы не изменялась более 7 дней, что свидетельствует о полном исчерпании ресурсов и завершении развития культуры (рис. 1).

 

Рис. 1. Рост гетеротрофной суспензионной культуры N. tabacum VBI-0

Fig. 1. Growth of heterotrophic suspension cell culture N. tabacum VBI-0: fresh weight density mg per ml

 

В результате анализа ГХ-МС были получены профили метаболитов, которые включали около 300 соединений, 84 из них были определены по совпадению масс-спектров и индексов удерживания с библиотечными, а еще для 44 был аннотирован химический класс. Остальные спектры не были идентифицированы, но были использованы в анализе. Наиболее многочисленными в полученных профилях метаболитов были сахара и их производные (в сумме около 60), сахароспирты, сахарокислоты, фосфосахара, пентозы (включая рибозу), гексозы (в том числе глюкоза и фруктоза), олигосахариды, например сахароза. Было аннотировано большое число сложных молекул, содержащих остатки сахаров, объединяющих, по-видимому, многочисленные ди- и трисахариды, а также вторичные соединения, такие как гликозиды. Профили также включали 24 аминокислоты, из них 17 стандартных, около 20 карбоновых кислот, среди которых присутствовали интермедиаты энергетического обмена. В небольшом количестве обнаружены свободные жирные кислоты и стерины.

Для определения сходства профилей культур в фазе роста и старения был проведен PCA. На рис. 2 профили метаболитов рассеяны в пространстве счетов первых двух главных компонент (ГК). Можно видеть, что наблюдения четко разделены в соответствии с возрастом вдоль ГК1, объясняющей 56,8 % дисперсии. Индивидуальные различия культур одного возраста связаны с ГК2, объясняющей 23 %.

 

Рис. 2. Рассеяние профилей метаболитов в пространстве счетов главных компонент (ГК), полученных при анализе суспензионных культур клеток N. tabacum VBI-0 на стадиях роста и старения. Эллипсы — 95 % доверительные интервалы, % — доля дисперсии, связанная с главной компонентой

Fig. 2. Score plot from PCA of metabolite profiles extracted from heterotrophic suspension cell culture N. tabacum VBI-0 at growth and senescence. Eclipses — are the 95% confidence intervals, % — percent of variation

 

Поскольку профили метаболитов группировались в соответствии со стадиями развития культуры, на следующем этапе для выявления метаболитов, накапливающихся дифференциально в зависимости от стадии развития, был проведен дискриминантный анализ методом ортогональных проекций на латентные структуры (OPLS-DA). Отбор метаболитов, связанных со старением, мы проводили по величине VIP (variable importance in projection) [38]. На рис. 3 результаты представлены на упрощенной карте центрального метаболизма, построенной на основе главных реакционных пар (субстрат – продукт) из базы данных KEGG [40].

 

Рис. 3. Визуализация метаболитов, дифференциально накапливающихся (ДНМ), в растущих и стареющих культурах клеток N. tabacum VBI-0. Выбор ДНМ осуществлен по VIP > 1. FC — кратность различий средних значений (fold changes). Увеличение соответствует более высокому накоплению на стадии старения

Fig. 3. Visualization of differentially accumulated metabolites (DAMs) in suspension cell culture N. tabacum VBI-0 at growth and senescence stages. DAMs were selected by rule: VIP > 1. Increase refers to higher level at senescence. FC — fold changes

 

Показано, что стареющие культуры отличались от растущих более высоким уровнем сложных сахаров, в том числе сахарозы, при этом уровень глюкозы и фруктозы существенно не различался. Вместе с этим объемы пулов фосфатов гексоз или не менялись, или сокращались. Старение также было связано с накоплением пентоз и в небольшой степени гексоз. Уровень конечного продукта гликолиза — пирувата, а также малата был выше в стационарных культурах. При этом уровень других зарегистрированных интермедиатов ЦТК не показал различий. Интересно, что уровень многих других карбоновых кислот, не вовлеченных напрямую в энергетический метаболизм, вырос. Наиболее ярким отличием профилей метаболитов стареющих культур представляется падение накопления почти всех свободных аминокислот. В их число входят интермедиаты азотного обмена: глутамат, глутамин и орнитин. Интересно, что на фоне этого наблюдалось значительное накопление мочевины. Можно отметить, что только на стадии роста была обнаружена аминоциклопропанкарбоновая кислота, являющаяся предшественником этилена. В уровне стеринов и свободных жирных кислот различий почти не наблюдалось. Исключением было сильное падение содержания одного неидентифицированного стерина и рост одной жирной кислоты с очень длинной цепью (С₂₄), лигноцериновой (рис. 3).

Чтобы определить связь изменений с биохимическими путями, реализуемыми в растительной клетке, мы провели анализ обогащения. Он позволяет оценить силу и вероятность направленных согласованных изменений накопления набора метаболитов [39]. Мы использовали списки метаболитов биохимических путей из базы KEGG [40]. Результат представлен на рис. 4. Как можно заметить, стареющие культуры отличались от растущих большим накоплением сахаров, вовлеченных в метаболизм сахарозы, галактозы и аскорбата. При этом уменьшались пулы аминокислот, что может быть связано с репрессией синтеза белка и, возможно, азотосодержащих вторичных соединений, предшественниками которых они являются. Интермедиаты ЦТК, путей синтеза стеринов и жирных кислот не показали достоверных однонаправленных изменений.

 

Рис. 4. Анализ обогащения, полученный на основе нагрузок предиктивной компоненты ОПЛС-ДА. Сеть метаболических путей, реализуемых в клетках N. tabacum. Узлы — метаболические пути из базы данных KEGG. Если они имеют общие метаболиты в профиле, то они соединены ребрами, которые их стягивают. Размер — NES, нормализованная оценка обогащения (normalized enrichment score), цвет — FDR, уровень ложноположительных результатов (false discovery rate). Треугольники с вершиной, направленной вверх соответствуют более высокому накоплению интермедиатов пути при старении

Fig. 4. Metabolite sets enrichment analysis based on loadings from OPLS-DA classification. Nodes of graph are KEGG pathways for N. tabacum, edges, contracting nodes, are presence of common metabolites in profiles. Size — strength of influence (NES, normalized enrichment score), color — FDR (false discovery rate), up triangles refer to accumulation of pathway intermediates at senescence

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Состав профилей метаболитов культур клеток VBI-0 был сходен с таковыми у нативных проростков табака [43]. При том что спектры были получены и аннотированы близкими методами, количество соединений в профилях культуры было существенно меньшим. Как в проростках, так и в культурах наиболее широко представленной группой были углеводы. Тем не менее в случае культур число соединений, аннотированных как углеводы, было в полтора раза меньше, чем в случае проростков. Главным образом, в культурах наблюдалось меньше сложных углеводов. Причиной этого может являться дифференцировка органов, тканей и клеток в многоклеточном организме, которая прослеживается и на биохимическом уровне [44]. С другой стороны, проростки обладают полнофункциональными пластидами, освещаются и осуществляют фотосинтез, что предположительно расширяет метаболическую сеть и делает профиль метаболитов более разнообразным. Нужно также иметь в виду, что остатки сахаров входят в состав многих вторичных соединений [45], а синтез специализированных молекул запускается обычно в ответ на неблагоприятные воздействия [3, 46]. Поскольку экспериментальные суспензионные культуры поддерживали в стабильных и благоприятных условиях, механизмы синтеза многих вторичных соединений могли быть неактивными. С этим согласуется тот факт, что анализируемые культуры клеток отличались меньшим числом идентифицированных вторичных соединений. Например, в культурах табака не детектировали никотин, столь характерный для N. tabacum. Подчеркнем, что эти соединения были идентифицированы в проростках [43]. И последнее, важным фактором формирования профиля углеводов может быть изменение состава клеточной стенки. Появление большого числа олигосахаридов в профиле исследованных нами культур может быть результатом частичной деградации полисахаридов клеточной стенки, что ранее было отмечено в процессе развития суспензионных культур табака.

Хорошо известно, что органы и ткани растений с возрастом претерпевают физиологические изменения. Это выражается и в том, что профили метаболитов растений разного возраста [47, 48] или органов в процессе развития [49] существенно различаются. Как правило, на ранних стадиях развития растений, органов и культур имеет место увеличение сопряжений с высокой синтетической активностью. Например, активно делящиеся клетки томатов в суспензионных культурах отличаются высоким уровнем потока углерода в синтез белка [21]. С высокой активностью синтеза белка связано высокое содержание свободных аминокислот, которое наблюдается на более ранних стадиях развития растений [50].

Синтетическая активность должна поддерживаться соответствующими ресурсами. Поскольку источником углерода и энергии для гетеротрофной культуры являются сахара, важную роль в обеспечении клетки приобретают пути их метаболизма. Моделирование потоков в гетеротрофных клетках арабидопсиса показало, что именно гликолиз и ЦТК играют ведущую роль в утилизации глюкозы [51]. Высокую значимость гликолизу может придать сочетание высокого уровня фосфорилированных гексоз и низкого соотношения АТФ/АДФ. Такая картина наблюдается, например, в период пролиферации клеток перикарпа плодов томатов [52]. Аналогично и в случае нашего исследования: в суспензионных культурах все фосфаты сахаров характеризовались большим содержанием в период роста. Падение уровня фосфатов сахаров при старении свидетельствует о снижении уровня активности начальных реакций гликолиза. Окончание пролиферации гетеротрофных клеток томата в культуре совпало с падением потоков через гликолиз и ЦТК [21]. Показано, что по мере старения гетеротрофных культур клеток табака активность аэробного дыхания снижается [20]. Предположительно, это является результатом углеродного голодания. Падение уровня дыхания, сопряженное со снижением содержания фосфорилированных сахаров, наблюдалось ранее в голодающих культурах после удаления субстрата из среды [14, 15]. В то же время высокий уровень сахарозы в клетках старых культур можно объяснить ее накоплением, как основного осмотика, в центральной вакуоли, объем которой увеличивается в процессе роста клеток [53]. Накопление свободных сахаров наблюдается на поздних стадиях развития растений и органов [50, 54]. Рост вакуоли также, вероятно, связан и с увеличением пула малата, который обычно накапливается в значительных количествах именно в этом компартменте [55, 56]. Накопление малата и других карбоксилатов может быть опосредовано частичным окислением сахаров для снабжения энергией [57], как и рост уровня пирувата, конечного продукта гликолиза.

По результатам анализа обогащения можно высказать предположение, что при старении активируется метаболизм аскорбата, как результат развития окислительного стресса в стареющих культурах. Высокая плотность культуры и исчерпание нутриентов в среде могут выступать в роли стрессовых факторов. А снижение уровня дыхания на поздних стадиях развития может рассматриваться в качестве механизма снижения окислительного стресса и замедления процесса старения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог, следует заметить, что клетки стареющих гетеротрофных культур испытывают стресс, связанный с углеродным голоданием и изменениями состава среды. Полученные метаболомные данные свидетельствуют о том, что старение сопряжено с падением уровня синтетических процессов, снижением активности начальной части гликолиза, накоплением сложных сахаров, пентоз и карбоксилатов.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Благодарности. Исследования выполнены на оборудовании Ресурсного центра Санкт-Петербургского государственного университета «Развитие молекулярных и клеточных технологий». Авторы выражают признательность проф. E. Zažímalová за предоставление культуры клеток табака, а также канд. биол. наук Т. Chen за помощь в проведении данного исследования.

Вклад авторов. Все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией. Вклад каждого автора: Р.К. Пузанский — концепция и дизайн исследования, сбор и обработка материалов, хроматографическое исследование, анализ полученных данных, написание текста, привлечение финансирования; А.А. Кирпичникова — выращивание культуры, сбор и обработка материалов; А.Л. Шаварда — хроматографическое исследование, анализ полученных данных; В.В. Емельянов — сбор и обработка материалов, внесение окончательной правки; М.Ф. Шишова — концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных, написание текста, внесение окончательной правки.

Источник финансирования. Исследование выполнено при поддержке Российского научного фонда (грант № 23-24-00393, https://rscf.ru/project/23-24-00393/).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

ADDITIONAL INFORMATION

Acknowledgments. The research was performed using equipment of the Research Park “Center for Molecular and Cell Technologies” at Saint Petersburg State University. Authors thank Prof. E. Zažímalová for providing the tobacco cell culture, as well as Dr. T. Chen for his assistance in carrying out this investigation.

Authors’ contribution. All authors have made a significant contribution to the development of the concept, research, and preparation of the article, as well as read and approved the final version before its publication. Personal contribution of the authors: R.K. Puzanskiy — experimental design, collecting and preparation of samples, GC-MS, data analysis, writing the main part of the text, making final edits, funding acquisition; A.A. Kirpichnikova — maintaining cell cultures, collecting and preparation of samples; A.L. Shavarda — GC-MS, data analysis; V.V. Yemelyanov — collecting and preparation of samples, making final edits; M.F. Shishova — experimental design, data analysis, writing the main part of the text, making final edits.

Funding source. This research was funded by the Russian Science Foundation (grant No. 23-24-00393, https://rscf.ru/en/project/23-24-00393/).

Competing interests. The authors declare that they have no competing interests.

Об авторах

Роман Константинович Пузанский

Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: puzansky@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-5862-2676
SPIN-код: 6399-2016

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Анастасия Алексеевна Кирпичникова

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: nastin1972@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-5133-5175
SPIN-код: 9960-9527
Россия, Санкт-Петербург

Алексей Леонидович Шаварда

Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук; Санкт-Петербургский государственный университет

Email: stachyopsis@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-1778-2814
SPIN-код: 5637-5122

канд. биол. наук

Россия, Санкт-Петербург; Санкт-Петербург

Владислав Владимирович Емельянов

Санкт-Петербургский государственный университет

Email: bootika@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2323-5235
SPIN-код: 9460-1278

канд. биол. наук, доцент

Россия, Санкт-Петербург

Мария Федоровна Шишова

Санкт-Петербургский государственный университет

Автор, ответственный за переписку.
Email: mshishova@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3657-2986
SPIN-код: 7842-7611
https://bio.spbu.ru/staff/id200_mfsh.php

д-р биол. наук, профессор

Россия, Санкт-Петербург

Список литературы

Дополнительные файлы