Influence of increased amounts of the CHD1 protein on Salivary Gland Secretion genes expression in Drosophila salivary glands

Full Text

В эукариотических клетках генетический материал организован в хроматин – комплекс состоящий из ДНК и гистонов. Преобразования хроматина необходимы для осуществления всех происходящих с ДНК процессов – транскрипции, репликации, репарации, рекомбинации и являются также основой для эпигенетической регуляции. Одним из основных механизмов преобразований хроматина является его ремоделирование, осуществляемое моторными белками – АТФ-азами из семейства SNF2 (1). Среди них подсемейство CHD (Chromo-ATPase/Helicase-DNA-binding protein) характеризуется наличием двойных хромодоменов (2), (3). У классического модельного организма – дрозофилы представлены все 3 группы этого подсемейства – CHD1, CHD3-4 и kismet (CHD6-9), которые есть и в геноме млекопитающих (4). Среди белков данного подсемейства CHD1 наиболее консервативен и является уникальным в том отношении, что он вовлечен в не только в ремоделирование хроматина, но и в его сборку из ДНК и гистонов in vitro (5) и in vivo (6), (7), (8). Удаление и сборка нуклеосом выполняется в результате совместного действия АТФ-зависимымых хроматин ремоделирующих факторов и гистоновых шаперонов (9), (7). In vivo CHD1 необходим для включения вариантного гистона Н3.3 в репликативно-независимой сборки хроматина в ходе преобразования мужского пронуклеуса у дрозофилы после оплодотворения (6). Подобная функция Chd1 описана и для млекопитающих (10).

CHD1 играет важную роль в регуляции процесса транскрипции. Изначально он был охарактеризован как хроматин-ремоделирующий белок, связывающийся с регионами активной транскрипции – пуфами и междисками в политенных хромосомах личинок третьего возраста у дрозофилы (11). Исследования на дрожжах и на культуре клеток человека показали, что CHD1 выделяется в комплексе с различными факторами элонгации транскрипции и с компонентами системы сплайсинга. Chd1 участвует в регуляции инициации, элонгации и терминации транскрипции (3), (12), (13), (14), (15). В процессе элонгации транскрипции CHD1 взаимодействует с факторами элонгации, Spt4-Spt5 и Spt16–Pob3, и с субъединицей Rtf1 комплекса PAF1, который регулирует элонгацию (13). Как показано в исследованиях на мышах при инициации транскрипции  CHD1 является компонентом преинициационного комплекса (16). Во время его формирования CHD1 рекрутируется к промоторам активных генов через взаимодействие с компонентом Med1 комплекса Mediator (16). У дрожжей-шизосахаромицетов Chd1 также является компонентом этого комплекса (17), (18). В промоторах генов дрожжей, дрозофилы и клеток человека функция Chd1 вероятно заключается в преодолении барьера для транскрипции, которым является первая после сайта старта транскрипции нуклеосома (19), (20), (21), (22). У дрозофилы CHD1 проявляет себя и как активатор и как репрессор транскрипции генов (23),  (24).

Геном человека содержит 2 гомолога CHD: CHD1 и CHD2, возникшие в результате полногеномной дупликации в ходе эволюции позвоночных и оба они вовлечены в канцерогенез. Мутации в гене Chd1 связаны с раком простаты, (25), (26), (27). При этом CHD1 является раковым супрессором, играющим ключевую роль в развитии рака простаты и определяющим метастазирование. Делеции, мутации и перестройки, вовлекающие ген Chd1, относятся к наиболее частым изменениям, наблюдающимся при раке простаты. CHD1 необходим для рекрутирования андрогенного рецептора к промоторам контролируемых им генов – раковых супрессоров, таких как NKX3-1, FOXO1, and PPARγ (28). Однако наиболее существенную роль в канцерогенезе играют не делеции, а наоборот избыток белка CHD1. Наиболее частыми при раке простаты являются мутации PTEN, которые приводят к нарушению протеолитической деградации белка Chd1 (29). Избыточное количество Chd1, в свою очередь, вызывает индукцию генов про-онкогенного пути TNF-NF-κB. Мутации PTEN в раковых клетках проявляют синтетическое летальное взаимодействие с мутациями Chd1 или инактивацией этого гена с помощью РНК-интерференции. Таким образом в этих опухолях CHD1 является привлекательной мишенью для развития таргетной терапии заболевания. Однако учитывая множественную роль CHD1 в регуляции генетических процессов для использования его в качестве мишени для таргетной терапии необходимо тщательное изучение всех его функций. Поэтому мы решили разработать генетическую модель для анализа влияния повышенной продукции белка CHD1 у классического модельного организма Drosophila melanogaster.  Для этого мы индуцировали экспрессию этого белка в слюнных железах, что позволяет изучить влияния повышенной продукции белка CHD1 как на структуру хромосом и хроматина, так и на экспрессию генов. С помощью GAL4 драйвера P{GaWB}AB1, который экспрессирует белок GAL4 в слюнных железах, мы индуцировали транскрипцию трансгенов, кодирующих либо белок CHD1 дикого типа (P{UAST-Сhd1^(wt)}), либо его каталитически не активную форму (P{UAST-Сhd1^(KR)559}). Замена лизина на аргинин в позиции 559 консервативного АТФ-азного домена полностью элиминирует АТФ-азную активность белка и его способность к ремоделированию или сборке хроматина (6). В процессе этих исследований мы заметили, что куколки таких особей очень слабо крепятся к стенке пробирок для культивирования дрозофилы. Прикрепление куколок к субстрату осуществляется с помощью секрета слюнных желез. Именно поэтому в данной работе мы исследовали влияние повышенной продукции CHD1 на экспрессию генов, кодирующих основные белки этого секрета SGS (salivary gland secret, sgs).

Материалы и методы

В работе были использованы следующие линии дрозофилы: линия дикого типа Oregon-R; линия – драйвер w; P{GaWB}AB1; линии несущие трансгены w; P{UAST-Сhd1^(wt)}, кодирующий белок дикого типа  и w; P{UAST-Сhd1^(KR)559}, кодирующий белок с не активной АТФ-азой (6);  а также 2 линии несущие делеции гена Chd1 - w; Df(2L)Chd1[1])/ T(2;3) SM6b-TM6B Tb  и w; Df (2L) Exel7014 /T(2;3) SM6b-TM6B Tb. В делеции Df(2L)Chd1[1] удалены 3 гена, включая Chd1, а крупная делеции Df(2L)Exel7014, перекрывается с Df(2L)Chd1[1] только в 1 гене − Chd1 (6). При скрещивании этих 2 линий отбирали нуль - мутантов по гену Chd1 (6). Все культуры поддерживались на стандартной среде при температуре 25^о C.

Для количественной оценки прикрепления куколок к стенкам пробирки использовали следующий метод: культуры выращивали в разборных пробирках со съемным донышком. После окукливания особей, донышки со средой заменяли на заполненные водой комнатной температуры и переворачивали определенное число раз, а затем подсчитывали количество оставшихся прикрепленными к стенкам куколок и количество смытых.

Для выделения тотальной РНК использовали 2 метода: метод, основанный на гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции с помощью реагента Trizol (Invitrogen) в соответствии с инструкцией. РНК выделяли из изолированных слюнных желез либо из целых личинок на различных стадиях развития. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой и проводили обратную транскрипцию с помощью набора Lunascript (New England Biolabs). Для проведения ПЦР в реальном времени использовали  реакционную смесь для RT-PCR SyberGreen + Rox (2,5Х) (BioRad) и амплификатор BioRad CFX96. РНК выделяли из личинок на пуффовой стадии 1-2 (A); 0- часовых предкуколок (С) и предкуколок + 2 часа (D). Для определения физиологического возраста личинок выращивали на среде с добавленным красителем - бромфеноловым синим, который позволяет разделять стадии развития по заполненности кишечника личинок окрашенной средой (30).  В качестве референсных генов использовались Act (actin) и RpL32 (ribosomal protein L32) (31), обработку данных проводили с помощью программы REST 2009. Праймеры использованные для РТ-ПЦР доступны по запросу.

Результаты

Как уже упоминалось, предпосылкой данного исследования была замеченная нами особенность куколок особей генотипов w; P{GaWB}AB1/ P{UAST-Сhd1^(wt) и  w; P{GaWB}AB1/ P{UAST-Сhd1^(KR)559} - их слабое прикрепление к стенкам пробирок. Поскольку дляприкрепления к субстрату окукливающиеся личинки используют выделяющийся на стадии PS-10 секрет слюнных желез, служащий «клеем», мы предположили, что такой фенотип может быть связан с нарушением синтеза основного компонента этого «клея» - белков секрета слюнных желез SGS.  О нарушении их синтеза свидетельствовало и практически полное отсутствие секрета в просвете слюнных желез на всех исследованных стадиях развития.  Железы таких особей несколько уменьшены и не превышают по толщине жирового тела, но в остальном сохраняют нормальную морфологию. С тем, чтобы количественно охарактеризовать степень прикрепления куколок к поверхности мы проводили смыв куколок с помощью последовательного переворачивания культуральных стаканчиков с водой и подсчета количества смытых и остающихся прикрепленными куколок. Результаты этого анализа приведены в таблице 1.

Таблица 1. Зависимость прикрепления куколок к поверхности от экспрессии белка CHD1 в клетках слюнных желез.

Как видно из этой таблицы, после 50 переворачиваний смывается 85% куколок генотипа w; P{GaWB}AB1/ P{UAST-Сhd1(wt), 92% особей P{GaWB}AB1/ P{UAST-Сhd1^(wt)} и только 5% особей w; P{GaWB}AB1/+. Таким образом, используя процедуру, занимающую около 1 минуты, мы смогли получить практически качественные различия по фенотипу прикрепления к поверхности, что свидетельствует о практически полном отсутствии секрета слюнных желез при повышенной экспрессии как белка CHD1 , так и его не активной формы.

На следующем этапе мы проанализировали экспрессию генов секрета слюнных желез sgs3 (salivary gland secret 3), sgs4 (salivary gland secret 4), sgs5 (salivary gland secret), и ng2 (new glue 2) и Pig1 (Pre-intermoult gene 1), которые также экспрессируются исключительно в слюнных железах. Экспрессию всех этих генов анализировали в слюнных железах личинок на стадии PS1-2 (A), когда она является максимальной для всех исследуемых генов. Результаты анализа показаны на рисунке 1, данные представлены с использованием логарифмической шкалы.

Рисунок 1. Влияние сверхпродукции различных форм белка CHD1 на экспрессию тканеспецифических генов в слюнных железах дрозофилы.

На этой стадии экспрессия обоих трансгенов Chd1 приводит к практически полному отсутствию транскрипции всех исследованных генов, кодирующих белки секрета слюнных желез - SGS3, SGS4 и SGS5. В то же время транскрипция двух других тканеспецифичных для слюнных желез генов либо не изменена (Pig1),  либо даже повышена при экспрессии каталитически не активной формы белка CHD1 (ng2). Таким образом, подавление транскрипции именно генов SGS является высоко специфичным и не является результатом угнетения транскрипции в клетках слюнных желез.

На следующем этапе мы проанализировали динамику изменений транскрипции генов sgs4 и sgs5 в ходе развития. В этом эксперименте РНК выделяли из целых личинок так как экспрессия и исследуемых генов и GAL4 драйвера P{GaWB}AB1 происходит исключительно в слюнных железах, а их отделение от жирового тела является затруднительным при экспрессии трансгенов CHD1. В данном эксперименте использованы 2 контроля – линия дикого типа OregonR и гетерозиготы P{GaWB}AB1/+, а также нуль мутантные по гену Chd1 особи (Рисунок 2). 

Рисунок 2. Изменение экспрессии генов секрета слюнных желез дрозофилы с возрастом.

На стадии PS1-2 нуль мутанты по гену Chd1 особи также показывают снижение транскрипции sgs4, но не sgs5. Следовательно влияние каталитически не активной формы белка CHD1 на экспрессию генов sgs не может быть объяснено отсутствием его активности и совпадает с влиянием на экспрессию генов секрета слюнных желез повышенной продукции белка CHD1 дикого типа. С течением времени относительный уровень экспрессия генов sgs несколько увеличивается при повышенной продукции CHD1 (в особенности его не активной формы), что может быть объяснено медленным нарастанием их транскрипции при повышении количества белка CHD1 в хроматине. Таким образом, CHD1 не полностью блокирует процесс транскрипции генов sgs в результате повышенного рекрутирования к хроматину интерферирующим с привлечением РНК полимеразы.

Обсуждение

Главным результатом данной работы является обнаружение высоко специфичного подавления транскрипции генов секрета слюнных желез в результате повышения количества белка CHD1 в клетках слюнных желез, приводящего к нарушению крепления куколок к поверхности. Подобный фенотип позволяет создать модель для поиска генетических и химических факторов способных влиять на фенотип, связанный с повышением количества белка CHD1 в клетках дрозофилы. У человека стабилизация белка CHD1 вызванное мутациями в фосфатазе PTEN, приводящее к увеличению количества CHD1 в клетке приводит к раковой трансформации клеток простаты. Обнаружение очень специфичного фенотипа, связанного с повышенной продукцией CHD1 в клетках слюнных желез у дрозофилы, создает предпосылки для изучения регуляции транскрипции в результате увеличения концентрации данного белка. У человека рак простаты является гормон – зависимым (32). Гормональная регуляция экспрессии генов андрогенным рецептором (AR) строго контролируется множеством транскрипционных кофакторов, включая пионерские факторы FOXA1 и GATA2 (32). Экспрессия генов секрета слюнных желез зависит от стероидного гормона экдизона и опосредуется экдизоновым рецептором EcR, который является ближайшим гомологом андрогенного рецептора (33).  Экспрессия генов sgs4 и sgs3 зависит от транскрипционного  фактора forkhead, являющегося прямым гомологом FOXA1 (34), (33). Таким образом слюнные железы дрозофилы являются неплохой моделью для изучения изменений транскрипции, приводящих к раку простаты. 

About the authors

Anastasia V. Toroshchina

Petersburg Nuclear Physics Institute named by B.P. Konstantinov of National Research Centre «Kurchatov Institute»

Author for correspondence.
Email: toroshchina_av@pnpi.nrcki.ru
ORCID iD: 0009-0002-5574-1108

Аспирант, лаборант-исследователь, Отделение молекулярной и радиационной биофизики

Russian Federation, 188300, Russia, Leningradskaya Oblast, Gatchina, 1, mkr. Orlova roshcha.

Alexander Y. Konev

Petersburg Nuclear Physics Institute named by B.P. Konstantinov of National Research Centre «Kurchatov Institute»

Email: konev_ay@pnpi.nrcki.ru
ORCID iD: 0000-0003-0195-4044
SPIN-code: 8880-7387
Scopus Author ID: 7003623042

К.б.н., с.н.с., Отделение молекулярной и радиационной биофизики

Russian Federation, 188300, Russia, Leningradskaya Oblast, Gatchina, 1, mkr. Orlova roshcha.

References

Supplementary files