Influence of Increased Amounts of the CHD1 Protein on Salivary Gland Secretion Genes Expression in Drosophila Salivary Glands

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

В эукариотических клетках генетический материал организован в хроматин-комплекс, состоящий из ДНК и гистонов. Преобразования хроматина необходимы для осуществления всех происходящих с ДНК процессов — транскрипции, репликации, репарации, рекомбинации, а также как основа для эпигенетической регуляции. Одним из основных механизмов преобразований хроматина является его ремоделирование, осуществляемое моторными белками — АТФазами из семейства SNF2 [1]. Среди них подсемейство CHD (Chromo-ATPase/Helicase-DNA-binding protein) характеризуется наличием двойных хромодоменов [2, 3]. У классического модельного организма — дрозофилы представлены все 3 группы этого подсемейства — CHD1, CHD3-4 и kismet (CHD6-9), которые есть и в геноме млекопитающих [4]. Среди белков данного подсемейства CHD1 наиболее консервативен и его уникальность состоит в том, что он вовлечен не только в ремоделирование хроматина, но и в его сборку из ДНК и гистонов in vitro [5]и in vivo [6–8]. Удаление и сборка нуклеосом выполняется в результате совместного действия АТФ-зависимых хроматин ремоделирующих факторов и гистоновых шаперонов [7, 9]. In vivo CHD1 необходим для включения вариантного гистона Н3.3 в репликативно-независимой сборке хроматина в ходе преобразования мужского пронуклеуса у дрозофилы после оплодотворения [6]. Подобная функция CHD1 описана и для млекопитающих [10].

CHD1 играет важную роль в регуляции процесса транскрипции. Изначально он был охарактеризован как хроматин-ремоделирующий белок, связывающийся с регионами активной транскрипции — пуфами и междисками в политенных хромосомах личинок третьего возраста у дрозофилы [11]. Исследования на дрожжах и на культуре клеток человека показали, что CHD1 выделяется в комплексе с различными факторами элонгации транскрипции и с компонентами системы сплайсинга. CHD1 участвует в регуляции инициации, элонгации и терминации транскрипции [3, 12–15]. В процессе элонгации транскрипции у дрожжей-сахаромицетов CHD1 взаимодействует с факторами элонгации Spt4-Spt5 и Spt16-Pob3, а также с субъединицей Rtf1 комплекса PAF1, который регулирует элонгацию [13]. Как показано в исследованиях на мышах, при инициации транскрипции CHD1 является компонентом преинициаторного комплекса [16]. Во время его формирования CHD1 рекрутируется к промоторам активных генов через взаимодействие с компонентом Med1 комплекса Mediator [16]. У дрожжей-шизосахаромицетов Chd1 также входит в состав этого комплекса [17, 18]. В промоторах генов дрожжей, дрозофилы и клеток человека функция CHD1, вероятно, заключается в преодолении барьера для транскрипции, которым служит первая после сайта старта транскрипции нуклеосома [19–22]. У дрозофилы CHD1 проявляет себя и как активатор, и как репрессор транскрипции генов [23, 24].

Геном человека содержит 2 гомолога Chd1 дрозофилы — CHD1 и CHD2, возникшие в результате полногеномной дупликации в ходе эволюции позвоночных и оба они вовлечены в канцерогенез. Мутации в гене CHD1 ассоциированы с раком простаты [25–27]. При этом CHD1 проявляет себя раковым супрессором, играющим ключевую роль в развитии рака простаты и определяющим метастазирование. Делеции, мутации и перестройки, затрагивающие ген CHD1, относятся к наиболее частым изменениям, наблюдающимся при раке простаты. CHD1 необходим для рекрутирования андрогенного рецептора к промоторам контролируемых им генов — раковых супрессоров, таких как NKX3-1, FOXO1 и PPARγ [28]. Однако наиболее существенную роль в канцерогенезе играют не делеции, а наоборот избыток белка CHD1. Наиболее часто при раке простаты выявляются мутации в гене PTEN, которые приводят к нарушению протеолитической деградации белка CHD1 [29].Избыточное количество CHD1, в свою очередь, вызывает индукцию генов про-онкогенного пути TNF-NF-κB.Мутации PTEN в раковых клетках проявляют синтетическое летальное взаимодействие с мутациями CHD1 или инактивацией этого гена с помощью РНК-интерференции. Таким образом в опухолях, несущих делеции PTEN, приводящие к накоплению белка СHD1, он может служить привлекательной мишенью для развития таргетной терапии заболевания. Однако, учитывая множественную роль CHD1 в регуляции генетических процессов, для использования его в качестве мишени для таргетной терапии необходимо тщательное изучение всех его функций и механизма действия. Поэтому мы решили разработать генетическую модель для анализа влияния повышенной продукции белка CHD1, используя классический модельный организм Drosophila melanogaster. Для этого мы индуцировали экспрессию этого белка в слюнных железах, что позволяет изучить влияние повышенной продукции белка CHD1 как на структуру хромосом и хроматина, так и на экспрессию генов. С помощью GAL4-драйвера P{GaWB}AB1, который экспрессирует белок GAL4 в слюнных железах, начиная с эмбриональной и до конца личиночной стадий развития, мы индуцировали транскрипцию трансгенов, кодирующих либо белок CHD1 дикого типа (P{UAST-Сhd1^(wt)}), либо его каталитически не активную форму (P{UAST-Сhd1^(KR)559}). Замена лизина на аргинин в позиции 559 консервативного АТФазного домена полностью элиминирует АТФазную активность белка и его способность к ремоделированию или сборке хроматина [6]. В процессе этих исследований мы заметили, что куколки особей с повышенной экспрессией белка CHD1 в обеих его формах очень слабо крепятся к стенке пробирок для культивирования дрозофилы и легко отваливаются при прикосновении препаровальной иглой. Прикрепление куколок к субстрату осуществляется с помощью секрета слюнных желез. Именно поэтому в данной работе мы исследовали влияние повышенной продукции CHD1 на экспрессию генов, кодирующих основные белки этогосекрета SGS (Salivary gland secret, Sgs).

Цель — анализ влияния повышенной экспрессии белка CHD1 в модельном организме — дрозофиле — на транскрипцию гормон-зависимых тканеспецифичных генов в слюнных железах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы следующие линии дрозофилы: линия дикого типа Oregon-R; линия GAL4-драйвер w; P{GaWB}AB1; линии несущие трансгены w;P{UAST-Сhd1^(wt)}, кодирующий белок дикого типа,и w; P{UAST-Сhd1^(KR)559}, кодирующий белок с неактивной АТФазой [6]; а также две линии несущие делеции гена Chd1 — w; Df(2L) Df(2L)Chd1¹/T(2;3) SM6b-TM6B Tb и w; Df (2L) Exel7014/T(2;3) SM6b-TM6B Tb. В делеции Df(2L)Chd1¹ удалены 3 гена, включая Chd1, а крупная делеция Df(2L)Exel7014 перекрывается с Df(2L)Chd1[1] только в одном гене — Chd1 [6]. При скрещивании этих двух линий отбирали нуль-мутантов по гену Chd1 [6]. Все культуры поддерживались на стандартной среде при температуре 25°C.

Для количественной оценки прикрепления куколок к стенкам пробирки использовали следующий метод: культуры выращивали в разборных пробирках со съемным донышком. После окукливания особей, донышки со средой заменяли на заполненные водой комнатной температуры и переворачивали определенное число раз, а затем подсчитывали количество оставшихся прикрепленными к стенкам куколок и количество смытых. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью критерия χ²с поправкой Йейтса [30].

Для выделения тотальной РНК использовали метод, основанный на гуанидин-тиоцианат-фенол-хлороформной экстракции с помощью реагента Trizol (Invitrogen, США) в соответствии с инструкцией. РНК выделяли из изолированных слюнных желез либо из целых личинок на различных стадиях развития. Выделенную РНК обрабатывали ДНКазой и проводили обратную транскрипцию с помощью набора LunaScript (New England Biolabs, США). Для проведения ПЦР в реальном времени использовали реакционную смесь для RT-PCR SyberGreen + Rox (2,5Х) (BioRad) и амплификатор BioRad CFX96. РНК выделяли из личинок на пуффовой стадии PS1-2; 0-часовых предкуколок (стадия PS10) и 0-часовых предкуколок + 2 ч (стадия PS10+2). Для определения физиологического возраста личинок выращивали на среде с добавленным красителем бромфеноловым синим, который позволяет разделять стадии развития по заполненности кишечника личинок окрашенной средой [31]. В качестве референсных генов использовали гены сплайсинговой РНК U6 (SnRNA:U6), актина Act42A (Actin42A) и рибосомального белка RpL32 (Ribosomal protein L32). Статистическую обработку данных проводили с помощью программы REST 2009 [32]. Праймеры, использованные для РТ-ПЦР, доступныпо запросу.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Как уже упоминалось, предпосылкой данного исследования была замеченная нами особенность куколок особей генотипов w; P{GaWB}AB1/P{UAST-Сhd1^(wt) и w; P{GaWB}AB1/P{UAST-Сhd1^(KR)559} — их слабое прикрепление к стенкам пробирок. Поскольку для прикрепления к субстрату окукливающиеся личинки стадии PS10 используют выделяемый ими секрет слюнных желез, служащий «клеем», мы предположили, что такой фенотип может быть связан с нарушением синтеза основного компонента этого «клея» — белков секрета слюнных желез SGS. О нарушении их синтеза свидетельствовало и практически полное отсутствие секрета в просвете слюнных желез на всех исследованных стадиях развития. Железы таких особей несколько уменьшены и не превышают по толщине жирового тела, но в остальном сохраняют нормальную морфологию. С тем чтобы количественно охарактеризовать степень прикрепления куколок к поверхности, мы проводили смыв куколок с помощью последовательного переворачивания культуральных стаканчиков с водой и подсчета количества смытых и остающихся прикрепленными куколок. Результаты этого анализа приведены в табл. 1.

 

Таблица 1. Зависимость прикрепления куколок к поверхности от экспрессии белка CHD1 в клетках слюнных желез

Изначальное  количество  куколок	Количество смытых куколок в зависимости  от числа оборотов пробирки			Количество не смытых куколок	Общее количество  смытых куколок  (доля в %), p*
	10 об.	30 об.	50 об.
P{GaWB}AB1
39	0	0	2	37	2
10	1	0	0	9	1
12	0	1	0	11	1
40	1	0	1	38	2
52	1	0	1	50	2
12	0	0	0	12	0
16	1	0	0	15	1
42	1	0	0	41	1
24	2	0	0	22	2
19	0	1	1	17	2
266**	7	2	5	252 (94,7%)	14 (5,2%)
P{GawB}AB1/P{UASTCHD1(WT)}
30	12	8	8	2	28
36	15	11	7	3	33
48	15	16	11	6	42
31	6	16	2	7	24
33	15	11	7	0	33
36	9	17	7	3	33
58	24	28	3	3	55
272#	96	107	45	36 (11,3%)	282 (88,7%), p=3,3×10–89
P{GaWB}AB1/P{UAST-Ch1(KR)559}
49	17	18	10	4	45
21	9	7	3	2	19
20	4	8	8	0	20
18	5	9	4	0	18
37	9	13	11	4	33
16	3	8	4	1	15
25	12	7	3	3	22
21	11	6	3	1	20
38	19	11	5	3	35
19	6	9	1	3	16
264##	95	96	52	21 (8,0 %)	243 (92,0%), p=4,1×10–88

Примечание. *p — вероятность того, что соотношение смытых и не смытых куколок не отличается от соотношения в контрольной линии P{GaWB}AB1; **соотношение смытых и не смытых куколок не отличается между пробирками (p=1,00), поэтому данные были объединены; ^#соотношение смытых и не смытых куколок не отличается между пробирками (p=0,18), поэтому данные были объединены; ^##соотношение смытых и не смытых куколок не отличается между пробирками (p=0,98), поэтому данные были объединены.

 

Как видно из табл. 1, после 50 переворачиваний смывается 88,7 % куколок генотипа w; P{GaWB}AB1/P{UAST-Сhd1(wt), 92 % особей P{GaWB}AB1/P{UAST-Сhd1^(wt)} и только 5 % особей w; P{GaWB}AB1/+. Таким образом, мы смогли получить практически качественные различия по фенотипу прикрепления к поверхности, что свидетельствует о практически полном нарушении функциональности секрета слюнных желез при повышенной экспрессии в клетках слюнных желез как белка CHD1, так и его не активной формы.

На следующем этапе мы проанализировали экспрессию генов секрета слюнных желез Sgs3 (Salivary gland secretion 3), Sgs4 (Salivary gland secretion 4), Sgs5 (Salivary gland secretion 5), ng2 (new glue 2) и Pig1 (Pre-intermoult gene 1), которые экспрессируются исключительно в слюнных железах. Экспрессию всех генов анализировали в слюнных железах личинок на стадии PS1-2, на которой начинается очень активная транскрипция всех трех генов Sgs, а активная транскрипция ng2 и Pig1, наоборот, начинает прекращаться [33]. В качестве референсного гена в этих экспериментах использовали ген сплайсинговой РНК U6 (SnRNA:U6), который транскрибируется с помощью РНК полимеразы III. В отличие от генов, транскрибируемых РНК полимеразами I и II, для генов, транскрибируемых полимеразой III, влияния на их экспрессию фактора CHD1 не показано. Результаты анализа приведены на рис. 1, данные представлены с использованием логарифмической шкалы.

Рис. 1. Влияние повышенной продукции конструкций, кодирующих нормальную (P{UAST-Сhd1(wt)) и каталитически неактивную(P{UAST-Сhd1^(KR)559}) формы белка CHD1 на экспрессию тканеспецифических генов слюнных желез дрозофилы. Показаны значения относительной экспрессии и 95% доверительный интервал.

 

На этой стадии экспрессия обоих трансгенов Chd1 приводит к практически полному отсутствию транскрипции всех исследованных генов, кодирующих белки секрета слюнных желез — SGS3, SGS4 и SGS5. В то же время транскрипция двух других тканеспецифичных для слюнных желез генов либо не изменена (Pig1), либо даже повышена при экспрессии каталитически не активной формы белка CHD1 (ng2). Таким образом, подавление транскрипции именно генов sgs является высоко специфичным, а не вызвано общим угнетением транскрипции в клетках слюнных желез. Дополнительным свидетельством этого является и сохранение практически нормальной структуры слюнных желез за исключением отсутствия в их просвете секрета, основным компонентом которого являются именно белки SGS.

На следующем этапе мы проанализировали динамику изменений количества РНК, транскрибируемого с генов Sgs4 и Sgs5 в ходе развития. В этом эксперименте РНК выделяли из целых личинок, так как экспрессия и исследуемых генов, и GAL4 драйвера P{GaWB}AB1 происходит исключительно в слюнных железах, а их отделение от жирового тела затруднительно у личинок, экспрессирующих трансгены Chd1. В данном эксперименте использованы 2 контроля — линия дикого типа Oregon-R и гетерозиготы P{GaWB}AB1/+, а также нуль-мутантные по гену Chd1 особи (рис. 2). В качестве референсных использованы гены Act42A и RpL32. Чтобы показать динамику изменений количества РНК в ходе развития, показаны значения относительной экспрессии по отношению к референсным генам и минимальному значению относительной экспрессии в ходе развития у контрольных особей генотипа P{GaWB}AB1/+ [34].

 

Рис. 2. Изменение экспрессии генов секрета слюнных желез дрозофилы Sgs4 и Sgs5 с возрастом. Показаны значения относительной экспрессии и 95% доверительный интервал.

 

На стадии PS1-2 нуль-мутанты по гену Chd1 особи также показывают снижение транскрипции Sgs4, но не Sgs5. Следовательно влияние каталитически неактивной формы белка CHD1 на экспрессию генов Sgs не может быть объяснено отсутствием его активности и сходно с влиянием на экспрессию генов секрета слюнных желез повышенной продукции белка CHD1 дикого типа. С течением времени относительный уровень экспрессия генов Sgs несколько увеличивается при повышенной продукции CHD1 (в особенности его неактивной формы), что может быть объяснено медленным нарастанием их транскрипции при повышении количества белка CHD1 в клетке. Таким образом, CHD1 не полностью блокирует процесс транскрипции генов Sgs в результате повышенного рекрутирования к хроматину, интерферирующим с привлечением РНК полимеразы.

ОБСУЖДЕНИЕ

Главный результат данной работы — обнаружение высоко специфичного подавления транскрипции генов секрета слюнных желез в результате повышения количества белка CHD1 в клетках слюнных желез, приводящего к нарушению крепления куколок к поверхности. Такой легко анализируемый признак позволяет создать экспериментальную модель для исследования факторов, влияющих на фенотип, связанный с повышением количества белка CHD1 в клетках дрозофилы. У человека стабилизация белка CHD1 вызванная мутациями в фосфатазе PTEN, приводящими к увеличению количества CHD1 в клетке, приводит к раковой трансформации клеток простаты. Обнаружение очень специфичного фенотипа, связанного с повышенной продукцией CHD1 в клетках слюнных желез у дрозофилы, создает предпосылки для изучения регуляции транскрипции у модельного организма — дрозофилы — в результате увеличения концентрации данного белка. Такие исследования могут прояснить как механизмы действия белка CHD1, так и механизмы гормон-зависимой регуляции активности генов. У человека рак простаты является гормон-зависимым [35]. Гормональная регуляция экспрессии генов андрогенным рецептором (AR) строго контролируется множеством транскрипционных кофакторов, включая пионерские факторы FOXA1 и GATA2 [35]. Экспрессия генов секрета слюнных желез зависит от стероидного гормона экдизона и опосредуется экдизоновым рецептором EcR, который является ближайшим гомологом андрогенного рецептора [36]. Экспрессия генов Sgs4 и Sgs3 зависит и от экдизонового рецептора EcR и от транскрипционного фактора forkhead, являющегося прямым гомологом FOXA1 [36, 37]. Таким образом, гормон-зависимая регуляция активности генов в слюнных железах дрозофилы напоминает процессы андроген-зависимой регуляции транскрипции у человека в клетках простаты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Созданная модельная система для изучения генетических эффектов, вызванных увеличением количества белка CHD1 в клетках дрозофилы, может быть использована для исследования механизмов регуляции транскрипции белком CHD1 и ее нарушений в результате повышенной продукции белка CHD1.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. А.В. Торощина — сбор и подготовка образцов, проведение ПЦР в реальном времени, анализ полученных данных, написание текста; А.Ю. Конев — концепция и дизайн исследования, анализ полученных данных, написание текста, обзор литературы, окончательная редакция текста. Авторы одобрили версию для публикации, а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой ее части.

Благодарности. Благодарим Юлию Александровну Ильину за обучение методам, которые мы использовали в работе, и за ее значительный вклад в достижение результатов данного исследования.

Этическая экспертиза. Исследования проведены с использованием плодовой мушки Drosophila melanogaster. Заключения этического комитета не требуется.

Источники финансирования: Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации (тема № 1023031500033-1-1.6.7;1.6.4;1.6.8 «Функциональная и структурная организация сложных, мультикомпонентных биологических систем и их динамика», регистрационный номер № 121060200127-6).

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным: Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование: Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре.В рецензировании участвовали два внешних рецензента и член редакционной коллегии.

ADDITIONAL INFO

Author contribution: А.V. Toroshchina: sample collection and preparation, real-time PCR, data analysis, writing the text; A.Yu. Konev: research concept and design, data analysis, writing the text, literature review, final editing of the text. All authors have approved the publication version and also agreed to be responsible for all aspects of the each part of the work and ensured reliable consideration of the issues related to the accuracy and integrity.

Acknowledgments: We would like to thank Yulia A. Ilyina for teaching us the methods that we used in our work and for her significant contribution to achieving the results of this study.

Ethics approval: The research was conducted using the fruit fly Drosophila melanogaster. Ethical committee approval is not required.

Funding sources: The work was carried out within the framework of the state assignment of the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation (topic № 1023031500033-1-1.6.7;1.6.4;1.6.8 Functional and structural organization of complex, multicomponent biological systems and their dynamics, No. 121060200127-6).

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities or interests for the last three years related with for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: The authors did not use previously published information (text, illustrations, data) to create this paper.

Data availability statement: data generated in this study are available in the article.

Generative AI: Generative AI technologies were not used for this article creation.

Provenance and peer-review: This work was submitted to the journal on its own initiative and reviewed according to the standard procedure.Two external reviewers, and a member of the editorial board participated in the review.

About the authors

Anastasia V. Toroshchina

Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of National Research Centre “Kurchatov Institute”

Author for correspondence.
Email: toroshchina_av@pnpi.nrcki.ru
ORCID iD: 0009-0002-5574-1108
Russian Federation, 1 Orlova roshcha, Gatchina, Leningrad region, 188300

Aleksandr Yu. Konev

Konstantinov Petersburg Nuclear Physics Institute of National Research Centre “Kurchatov Institute”

Email: konev_ay@pnpi.nrcki.ru
ORCID iD: 0000-0003-0195-4044
SPIN-code: 8880-7387
Scopus Author ID: 7003623042

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, 1 Orlova roshcha, Gatchina, Leningrad region, 188300

References

Supplementary files