CURRENT STATE OF THE PROBLEM OF THE LABORATORY DIAGNOSTICS OF UROGENITAL TRICHOMONIASIS

Abstract

The laboratory diagnostics of urogenital trichomoniasis is an actual problem of modern microbiology of infections of the reproductive tract. In the review, literature data on methods of microbiological diagnostics of trichomoniasis are presented, which include microscopy of wet mount and stained preparations, culture techniques, immunological methods and nucleic acid amplification tests.

Full Text

Введение Для современного общества характерен высокий уровень заболеваемости инфекцями, передаваемыми половым путем (ИППП). Среди них важная роль принадлежит урогенитальному трихомониазу — антропонозному заболеванию, вызываемому облигатно-паразитическим жгутиковым простейшим Trichomonas vaginalis. У женщин трихомонады могут вызывать вагинит, цервицит, уретрит [107]. Трихомониаз ассоциирован с воспалительными заболеваниями органов малого таза и неблагоприятными исходами беременности, такими как преждевременные роды, преждевременный разрыв плодных оболочек, и низкой массой плода [74, 98]. Трихомонадная инфекция у мужчин может быть причиной уретрита [50], а также может быть ассоциирована с простатитом [16] и мужским фактором бесплодия [101]. Показано, что наличие трихомониаза повышает восприимчивость к ВИЧ-инфекции [66]. Трихомониаз — давно известное заболевание. Несмотря на это, многие вопросы относительно адекватной лабораторной диагностики и, как следствие, реальной распространенности этой инфекции и форм инфекционного процесса остаются не решенными. Публикуемые данные по распространенности урогенитального трихомониаза в различных популяциях варьируются в широких пределах, от 1 % до 60 % [18, 19, 26, 51, 75, 82, 87, 90, 93, 95, 115]. Эти показатели мало коррелируют с регионами исследования и с используемыми методами микробиологической диагностики. Какую-либо значимую тенденцию к увеличению или снижению этих показателей во времени усмотреть довольно трудно. Имеются лишь некоторые корреляции с расой и образом жизни [103]. Важность точной лабораторной диагностики диктуется также тем обстоятельством, что у 10–80 % женщин [81] и большинства мужчин болезнь протекает бессимптомно или малосимптомно, а клиническая картина часто неспецифична. Несмотря на то что имеются определенные клинические признаки, характерные для трихомонадной инфекции, такие как обильные пенистые выделения из влагалища, установление диагноза только на основании этих проявлений не рекомендуется, так как у большинства инфицированных женщин (88 %, по данным Fouts A. и соавт. [38]) заболевание может быть не диагностировано, а для существенной части неинфицированных женщин (29 %, по данным Fouts A. и соавт. [38]) может быть получен ложноположительный результат. Для решения этой проблемы рядом авторов были предложены алгоритмы комплексного клинико-микробиологического обследования пациентов на трихомонады [1, 2, 92]. Очевидно, что методы микробиологической диагностики являются решающими в установлении диагноза трихомонадной инфекции. Трихомониаз является недооцененной проблемой в области ИППП. В программах контроля над ИППП ему уделяется относительно небольшое внимание. Однако новые данные о его распространенности, ассоциации с неблагоприятными исходами беременности, увеличенным риском заражения ВИЧ и другой патологией [42, 43, 57, 83, 85, 90, 100, 111, 116] создали потребность в усилении мер по контролю над этим заболеванием, важнейшая роль в котором отводится оптимальной лабораторной диагностике. Несмотря на достаточную с научной точки зрения (в отличие от нормативных и экономических аспектов) разработанность диагностической базы [106, 113], многие вопросы диагностики трихомониаза еще предстоит решить. В обзоре представлены данные литературы о принципах, диагностических характеристиках, достоинствах и недостатках методов микробиологической диагностики трихомониаза: микроскопического исследования нативного и окрашенного препаратов, культурального исследования, иммунологических методах и методах амплификации нуклеиновых кислот (МАНК). Методы лабораторной диагностики трихомониаза — диагностические характеристики, преимущества и ограничения Микроскопическое исследование Микроскопическое исследование «нативного» препарата является наиболее доступным методом микробиологической диагностики трихомониаза. При этом принципиально важно проводить исследование непосредственно после взятия образца (в пределах 10–20 минут), во избежание снижения или потери подвижности возбудителем [83]. В исключительных случаях для транспортировки препарат следует поместить в атмосферу «влажной камеры» в чашку Петри с увлажненной фильтровальной бумагой и немедленно, не допуская охлаждения, доставить в лабораторию. Процедура исследования заключается в том, что на предметном стекле смешивают каплю теплого стерильного физиологического раствора с образцом и, накрыв покровным стеклом, немедленно исследуют с помощью обычного светового, фазово-контрастного или темнопольного микроскопа [4]. В препарате выявляют трихомонады по их характерной подвижности, которую важно не спутать с подвижностью иного рода. Поэтому метод пригоден для выявления только активно подвижных трихомонад. При выполнении последнего условия специфичность метода приближается к 100 %, а при попытках идентификации малоподвижных или неподвижных трихомонад резко возрастает количество ложноположительных результатов. С помощью микроскопического исследования нативного препарата удается выявить от 6 % до 82 % больных трихомониазом [3, 10, 21, 28, 30, 36, 40, 53, 56, 83]. Чувствительность метода во многом зависит от количества возбудителя в образце. Так, если концентрация возбудителя ниже 10 4 организмов/мл, тест его не выявляет. По этой причине тест не применим для диагностики трихомониаза у мужчин, у которых концентрация возбудителя невелика. Кроме того, показано, что из первоначально положительных в этом тесте образцов через 10 минут экспозиции 20 % из них становились отрицательными [48]. Микроскопическое исследование окрашенного препарата не требует немедленного просмотра препарата, позволяет лучше изучить как морфологию трихомонад, так и другие элементы. Однако метод менее чувствителен и специфичен, а также более трудоемок. Частота обнаружения трихомонад в клинических материалах, полученных от пациентов с трихомониазом, помещенных на предметное стекло и окрашенных анилиновыми красителями, может составлять 30–62 % [3, 73]. В окрашенных препаратах T. vaginalis не всегда выявляется в типичной грушевидной форме. Во время фиксации и окрашивания препаратов трихомонады теряют свои морфологические особенности, что приводит к диагностическим ошибкам при микроскопическом исследовании. Предложены различные методы окраски препаратов: по Граму, Лейшману, Романовскому–Гимзе, метиленовым синим по Леффлеру или его водным раствором. Последний может быть наиболее приемлем для практического применения, так как прост и, по-видимому, лучше других выявляет структурные особенности элементов трихомонад [3]. Трихомонады могут быть также выявлены в клинических материалах, окрашенных по методу Папаниколау. Чувствительность этого метода не превышает 60 %, специфичность — 95 % [10]. Метод люминесцентной микроскопии [39] при окрашивании препаратов акридиновым оранжевым используется редко [8]. Кроме того, предложен метод окраски трихомонад по Филду, позволяющий различать живых и погибших паразитов с выявлением характерной ультраструктуры возбудителя [11]. В нашей стране диагностика трихомониаза осуществляется преимущественно методом микроскопического исследования окрашенных препаратов (в основном, метиленовым синим и по методу Грама), диагностические характеристики которого невысоки. Только в ограниченном числе учреждений используются более точные методы выявления трихомонад, такие как микроскопическое исследование «нативных» препаратов отделяемого влагалища, а также культуральное исследование [52]. Культуральный метод Метод культивирования урогенитальных трихомонад на жидких или полужидких питательных средах в настоящее время считается «золотым стандартом» диагностики трихомониаза. Имеются немногочисленные описания культивирования трихомонад с использованием агаровых питательных сред [23, 88, 91]. К достоинствам культурального метода следует отнести его высокую специфичность (100 % при условии выявления активно подвижных трихомонад) [3, 21, 22, 49, 93] и низкий порог чувствительности, составляющий от 10 паразитов/мл образца и до 300–500 паразитов/мл [14], который во многом определяется качеством используемых питательных сред. Чувствительность культурального метода по сравнению с методом ПЦР варьируется от 35 % до 96 %, в зависимости от качества транспортных и культуральных питательных сред и условий культивирования. Метод не лишен некоторых ограничений, таких как трудоемкость и длительный срок культивирования (от 2 до 7 дней с ежедневным микроскопическим исследованием), высокие требования к условиям транспортировки и хранения клинических образцов. Контаминация проб микроорганизмами может потребовать дополнительных пассажей, увеличивающих срок и стоимость исследования [35]. Пассаж (пересев) через 2–3 дня культивирования снижает бактериальную контаминацию и может потребоваться для окончательной идентификации T. vaginalis. Трихомонады способны вступать в медленную фазу роста, и даже в чистой культуре иногда может наблюдаться задержка роста от 24 до 48 часов, прежде чем проявится характерный рост организма. Трихомонады относят к факультативным анаэробам, они аэротолерантны, при их культивировании предпочтительны микроаэрофильные условия [32, 37, 114]. Разработаны различные варианты жидких питательных сред для выявления трихомонад: среды СPLM (cysteine-peptone-liver medium) (Джонсона–Трасселя), среда Даймонда (Diamond), модифицированная среда Даймонда с добавлением тиогликолята натрия (Diamond-modified), среды Kupferger, Kupferger-Trichosel, Kupferger-STS, Difco-Kupferger, TYM, СКДС, Vagicult, Oxoid, Hollander, Feinberg Wittington, Lash, Trichosel broth, Hirsh, тест-система InPouchTM TV (proteose-peptone medium) и ряд других. Исследования качества различных сред показали, что к числу самых оптимальных относятся среды Hollander, Diamond-modified и СPLM, с чувствительностью до 96 %; однако, вышеперечисленные питательные среды отличаются высокой стоимостью [35, 93]. В нашей стране выпускается ряд коммерческих питательных сред: среда питательная для выделения трихомонад жидкая (ООО «НПФ «Диагност-мед», г. Омск), основа питательной среды для культивирования трихомонад (НПО «Микроген», г. Махачкала) и питательная среда для визуального выявления Trichomonas vaginalis СВТ лиофилизированная (НИИЭМ им. Л. Пастера, Санкт-Петербург). Работ по оценке качества сред отечественного производства не проводилось. Возможности культурального метода по выявлению Т. vaginalis были улучшены с развитием портативных культуральных систем [25, 29], сочетающих функциональность и умеренную цену с приемлемыми диагностическими характеристиками. К портативным системам относится метод пластикового конверта, с помощью которого можно выполнить как микроскопическое исследование «нативного» препарата, так и сохранить трихомонады в закрытой системе для культивирования. Аналогично пластиковому конверту используется тест-система InPouchTM TV (BioMed Diagnostics, США) и ее аналоги, имеющие вид двухкамерного прозрачного пластикового мешка и позволяющие быстро провести микроскопическое исследование. Метод с использованием клеточных культур, в частности клеток линии McCoy, способен определять T. vaginalis в концентрациях менее 3 организмов в 1 мл вагинального отделяемого. В опытах in vitro показано, что T. vaginalis тропны к клеткам эпителия влагалища, по сравнению с другими типами клеток. Однако выделение трихомонад в культуре клеток — это не простой рутинный метод, он дорог и трудоемок. Для проведения культурального исследования клинический материал, полученный от пациента, помещают в питательную среду и инкубируют в микроаэрофильных условиях при 36 ± 1 оС в течение 24–48 часов. Далее ежедневно в течение 7 дней оценивают рост трихомонад по характерной подвижности с использованием метода прямой микроскопии «нативного» препарата [4]. С момента внедрения в практику антипротозойных препаратов разрабатываются методы определения чувствительности к ним T. vaginalis, которые, однако, в повседневной практике не используются [6, 24, 58, 64, 109]. Суть большинства из них заключается в приготовлении серийных разведений препаратов в среде культивирования, в которых затем инкубируют T. vaginalis в аэробных условиях [37, 61]. Ранее культивирование T. vaginalis рекомендовалось проводить в анаэробных условиях. Есть данные о необходимости определения чувствительности трихомонад к препаратам параллельно в аэробных и анаэробных условиях, так как такая методика позволяет более надежно выявлять устойчивые штаммы, что обусловлено различной, линейно не коррелирующей, чувствительностью штаммов к антипротозойным препаратам при различных концентрациях кислорода [80]. Помимо формы подвижного трофозоита, в жизненном цикле T. vaginalis выявлена форма псевдоцисты [12, 13, 44, 71]. Данный факт заставляет еще скрупулезнее отнестись к ревизии характеристик методов, основанных на визуальном выявлении трофозоитов и их подвижности, то есть на методах микроскопии и культуральном исследовании. Выявление псевдоцист не находит применения в рутинной диагностике и пока представляет собой только исследовательское поле деятельности. Разрешению проблемы, возможно, способствовало бы применение иммунологических методик визуализации. По-видимому, данная проблема является дополнительным аргументом в пользу использования для диагностики трихомониаза МАНК. Иммунологические методы Ограничения микроскопического и культурального методов исследования оказали стимулирующее влияние на внедрение альтернативных методов диагностики трихомониаза. К их числу относятся иммунологические методы, как для выявления антигенов T. vaginalis, так и для выявления антитрихомонадных антител. Среди серологических тестов для определения антител к T. vaginalis в настоящее время безусловным лидером как по диагностическим характеристикам, так и по простоте исполнения, является иммуноферментный анализ (ИФА) [33, 55, 94]. В работе таких систем имеется ряд недостатков, обусловленных зависимостью иммунного ответа от различных факторов, характеристиками тест-систем, свойствами возбудителя. Чувствительность этих тестов составляет в среднем 82 %, специфичность — 73 % [93]. Поскольку антитрихомонадные антитела могут циркулировать в сыворотке крови в течение длительного времени после лечения, то дифференцировать таким образом текущую и перенесенную ранее инфекцию проблематично. Отсутствие адекватной модели с использованием лабораторных животных для исследования иммунного ответа при трихомониазе является серьезным ограничением для изучения возможностей серологического метода. В литературе описаны корреляции наличия антитрихомонадных антител и онкологической патологии [72, 76, 86]. Однако этот вопрос требует проведения специальных исследований. Для выявления антигенов T. vaginalis разработано несколько тестов. Как правило, чувствительность тестов для выявления антигенов трихомонад выше, чем чувствительность микроскопического метода исследования «нативного» препарата, но уступает (или сопоставима с ней) чувствительности культурального метода исследования. Бесспорным преимуществом данных тестов, по сравнению с традиционными методами диагностики трихомониаза, является то, что для интерпретации результатов исследования не нужны живые трихомонады. Эти тесты могут применяться в учреждениях, в которых нет возможности выполнять бактериологические исследования. Прямое определение специфических белков T. vaginalis, таких как клеточный разъединяющий фактор (cell-detaching factor, СDF) и цистеин-протеаза (cysteine protease), являющихся иммуногенами всех наблюдавшихся изолятов T. vaginalis, с использованием моноклональных антител в качестве быстрого метода диагностики трихомониаза показало результаты, аналогичные результатам метода микроскопии «нативного» препарата [17]. Прямой иммуноферментный и иммунофлюоресцентный анализ выявления антигенов трихомонад в клинических материалах, полученных из влагалища, с использованием коммерческих систем Trichomonas Direct Enzyme Immunoassay и Fluorescent Direct Immunoassay (California Integrated Diagnostics, Benicia, США), использующий смесь меченных перокидазой и флюорохромом моноклональных антител к различным структурам T. vaginalis, показали аналитические характеристики, сравнимые с культуральным методом. Достоинством данного теста является также то, что результаты тестирования становятся доступны в течение одного часа. T. vaginalis может быть обнаружена методом прямой иммунофлюоресценции в отделяемом влагалища [15], а также иммунопероксидазным методом при цитологическом исследовании фиксированных цервикальных проб [68]. Данные методы имеют достаточно высокую чувствительность (79– 90 %) и специфичность (98–100 %) [93] по сравнению с культуральным методом. Недостатком иммунологических методов является то, что для их выполнения требуются специальное оборудование; кроме того, эти методы достаточно дороги. Известен простой тест латекс-агглютинации, по чувствительности и специфичности сопоставимый с ИФА и позволяющий получить результат в течение нескольких минут [65], но широкого распространения не получивший. Также был предложен тест с использованием моноклональных антител против специфических протеинов T. vaginalis 62 kDa и 65 kDa [54]. Следует отметить, что применение методов определения антигенов T. vaginalis существенно сократилось после внедрения в практику МАНК, в частности метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Методы амплификации нуклеиновых кислот С начала 1990-х годов в микробиологическую диагностику стали внедряться технологии анализа нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний. Сначала это были методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот возбудителя с ДНК- или РНК-зондами. Позднее их стали замещать методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот. В основе МАНК лежит энзиматическая амплификация специфических фрагментов нуклеиновых кислот возбудителя с последующей детекцией продуктов амплификации (ампликонов). Очевидно, что за счет амплификации чувствительность МАНК превышает чувствительность методов гибридизации нуклеиновых кислот. Методы амплификации нуклеиновых кислот включают 2 основные группы методов: методы амплификации ДНК и методы амплификации РНК. К числу методов амплификации ДНК относятся полимеразная цепная реакция (ПЦР) и амплификация со смещением нити ДНК (strand displacement amplification, SDA). К числу методов амплификации РНК относится амплификация, основанная на транскрипции (transcription mediated amplification, TMA), и амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (nucleic acid sequence-based amplification, NASBA). Для диагностики урогенитальных инфекций предлагается целый ряд МАНК, однако наиболее широко используемым является метод ПЦР. В настоящее время существует множество публикаций по разработке и оценке тестов на основе МАНК для выявления T. vaginalis [5, 7, 20–22, 27, 28, 30, 31, 45–47, 53, 69, 70, 78, 79, 84, 93, 96, 99, 102, 108]. Чувствительность различных тестов варьируется в диапазоне 85–100 %, а специфичность — 95–100 %. При оценке отечественных тест-систем на основе МАНК также показано их значительное преимущество перед традиционными методами диагностики трихомониаза. Так, пределы детекции тестов на основе МАНК были в 100–1000 раз ниже пределов детекции микроскопического и культурального методов. Чувствительность тестов варьировалась от 94 до 100 %, специфичность равнялась 100 % [5, 7]. К безусловным достоинствам МАНК следует отнести их высокую чувствительность и специфичность, возможность получения результата исследования в короткий срок, а также значительно более простые требования к транспортировке и хранению клинического материала (чем при использовании методов, требующих наличия жизнеспособных трихомонад). Из ограничений метода необходимо выделить высокую стоимость оборудования, риск контаминации и получения ложноположительных результатов, высокие требования к квалификации персонала. Кроме того, при использовании большинства МАНК выявляются как живые, так и погибшие трихомонады. Если, по мнению некоторых специалистов, ПЦР не имеет явных преимуществ перед культуральным исследованием у женщин, то у мужчин этот метод обладает явными преимуществами [59, 70, 84, 110]. Метод может применяться в случае подозрения на трихомониаз при отрицательных результатах микроскопического и культурального тестов [60, 81]. Возможно также, что метод ПЦР, являющийся, по-видимому, наилучшим для скрининга трихомониаза, в ближайшее время может занять место «золотого стандарта» в диагностике этого заболевания, для чего требуются дополнительные исследования [104]. Эффективность МАНК при выявлении T. vaginalis зависит от выбранной генетической мишени, формата метода, структуры используемых праймеров и гибридизационных зондов, а также выбора клинического материала, времени его взятия, сроков и условий его хранения и транспортировки. В качестве мишеней в ПЦР-тестах для определения T. vaginalis чаще всего используются ген бета-тубулина [47], ген 18S рРНК [79], повторяющиеся последовательности ДНК [105; 78; 20]. Стадии тестирования с применением МАНК включают последовательно выделение ДНК/РНК, амплификацию, детекцию и анализ продуктов амплификации. Каждый из этапов должен осуществляться в строгом соответствии со стандартными операционными процедурами, описание которых предоставляет разработчик теста или изготовитель коммерческих тест-систем. В процессе диагностической работы особое внимание должно быть уделено снижению риска контаминации образцов, с этой целью все этапы исследования пространственно должны быть разобщены [4]. Для детекции продуктов амплификации используется несколько методов. Наиболее распространенным является электрофорез в агарозном геле. Однако, в последнее время широко внедряется способ детекции амплифицированной ДНК в режиме реального времени. Данный подход реализуется путем использования меченных флюорофорами зондов, генерирующих флюоресцентный сигнал при наличии в реакционной смеси искомой последовательности ДНК. Для этого используются приборы c оптическим блоком, позволяющим мониторировать интенсивность флюоресценции в ходе реакции. Современные термоциклеры для ПЦР в реальном времени оснащены каналами для детекции флюоресценции в нескольких диапазонах длин волн (до 5–6), что позволяет разрабатывать мультиплексные форматы реакции (так, в одной пробирке можно выявить одновременно как ДНК T. vaginalis, так и других возбудителей урогенитальных инфекций [63, 89]). Так как технология ПЦР в реальном времени позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации непосредственно в процессе реакции, это существенно сокращает время анализа и снижает риск контаминации. Кроме того, так как интенсивность накапливаемого сигнала прямо пропорциональна количеству мишени в пробе, ПЦР в реальном времени позволяет проводить количественную оценку исследуемой мишени в пробе. Сегодня начинают внедряться в практику методы выявления РНК возбудителя (например, NASBA и TMA) [5, 7, 9, 34]. Высокая чувствительность этих методов обеспечивается благодаря высокому содержанию в клетках возбудителей рибосомальной РНК (рРНК) (на одну копию ДНК в клетке может приходиться 1000–10000 копий РНК), что позволяет обнаруживать в клиническом материале очень малые количества микроорганизмов. Кроме того, они позволяют с большой вероятностью судить о жизнеспособности выявляемого объекта, так как после гибели микроорганизма разрушение его РНК происходит гораздо быстрее, чем ДНК. В методах амплификации РНК реализован принципиально иной, по сравнению с ПЦР, способ амплификации, а в качестве мишени в данных тестах используется рРНК возбудителя. Эти отличия методов при высокой чувствительности и специфичности позволяют рассматривать методы NASBA и TMA как альтернативные методу ПЦР, а также использовать их в качестве адекватных подтверждающих тестов. Недавно для выявления T. vaginalis был предложен коммерческий тест на основе ТМА APTIMA Trichomonas vaginalis Assay (Gen-Probe, San-Diego, США) [45, 62, 67, 97]. В многоцентровом клиническом исследовании диагностических характеристик данного теста его чувствительность и специфичность равнялись, соответственно, 100 % и 99,0 % для вагинальных образцов, 100 % и 99,4 % для цервикальных образцов, 95,2 % и 98,9 % образцов мочи от женщин [62]. В нашей стране разработана тест-система на основе технологии NASBA АмплиСенс Trichomonas vaginalis — РИБОТЕСТ (ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора). Ее чувствительность и специфичность при исследовании вагинальных проб от женщин и уретральных проб от мужчин равнялись 100 % [5]. Заключение Оптимальная диагностика трихомониаза является важнейшим компонентом контроля над этим заболеванием. Диагностика трихомониаза традиционно основывается на микроскопическом и культуральном исследованиях — методах, суть которых заключается в выявлении живых трихомонад с характерной подвижностью. Микроскопическое исследование «нативного» материала — наиболее распространенный метод диагностики трихомониаза у женщин. Это быстрый и недорогой метод, но чувствительность его невысока. Культуральный метод обладает высокой чувствительностью (при условии использования высококачественных питательных сред), однако его недостатками являются длительность культивирования (2–7 дней) и необходимость соблюдения строгих условий транспортировки и хранения. В нашей стране диагностика трихомониаза осуществляется преимущественно методом микроскопического исследования окрашенных препаратов (в основном, метиленовым синим и по методу Грама), диагностические характеристики которого невысоки. Только в ограниченном числе учреждений используются более точные методы выявления трихомонад, такие как микроскопическое исследование «нативных» препаратов отделяемого влагалища, а также культуральное исследование. Внедрение МАНК в рутинную диагностику данного заболевания значительно повысит ее эффективность.